一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株。该降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，命名为扩展青霉菌PenicilliumexpansumN53，本发明所述扩展青霉（Penicilliumexpansum）N53可将白酒酒糟中的纤维素降解成葡萄糖，且具有纤维素酶酶活高，纤维素转化生成葡萄糖的转化率高等特点，极大程度上提高了白酒酒糟的利用率，对于后续生成蛋白饲料提供了保证，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素分解菌株。利用扩展青霉（Penicilliumexpansum）发酵降解白酒酒糟纤维素的研究较少。
【专利说明】一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株
[0001](一)【技术领域】
本发明属于生物【技术领域】，涉及一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株。
[0002](二)【背景技术】
白酒酒糟是白酒生产中的副产物。由于白酒酒糟呈酸性，且含有未能完全利用的淀粉、蛋白质及各种氨基酸、维生素、矿物元素等营养成分，是微生物生长的良好基质，若未能及时处理，会对酒糟存放地周边带来严重的污染，不符合我国大力建设资源节约型、环境友好型社会的发展方针。近年来，白酒产业的日趋发展，仅2012年1-11月，全国白酒产量高达1023.32万千升，比2011年同期增长了 112.02万千升。因此，白酒酒糟的综合利用对于我国构建节约型社会和环境保护方面具有十分重要的意义。
[0003]据统计，每100g白酒糟中就含有粗蛋白10_16g、粗纤维18_24g、粗脂肪3.83g、钙0.21g、磷 0.38g、维生素 A 625mg、维生素 B 27.9 mg、维生素 C 37.5 mg、维生素 PP419.92mg、烟酰胺182.69 mg等[1]。纤维素是由葡萄糖分子以β _1，4糖苷键组成的大分子多糖，由于含有许多高能氢键，因此较难被一般微生物分解、利用。半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，单糖聚合体间分别以共价键、氢键、醚键和酯键连接，他们与伸展蛋白、其他结构蛋白、壁酶、纤维素和果胶等构成具有一定硬度和弹性的细胞壁，因而呈现稳定的化学结构。
[0004]目前，国内对白酒酒糟的应用研究主要是利用酒糟生产饲料蛋白、直接烘干作为生产饲料[2]、提取植酸和植酸钙及复合氨基酸等物质[3，4]、制取甘油[3]、用于原酒再生产、制备糖用活性炭、酿醋、厌氧发酵回收沼气、培养食用菌[3]等方面。但从解决酒糟的彻底性角度考虑，目前只有直接或发酵后用作饲料、农肥方面可以从根本上解决酒糟废弃物的污染问题[1]。随着当今社会经济的发展，人们对于生态环境更加注重，因而在白酒生产中更加注重其对生态环境的影响，最大限度地利用资源，并尽可能地减少对环境的污染，把生产过程中各阶段的副产物及废弃物资源化利用，从而保护环境，达到人与自然环境协调发展。
[0005]由于白酒酒糟中粗纤维含量较高，直接利用酒糟生产菌体蛋白具有产值较低、利用不完全等缺点。因此选择一株能够分解利用白酒酒糟中的纤维素和半纤维素，将其转化为较易被微生物吸收利用的葡萄糖，对于利用白酒酒糟生产菌体蛋白具有显著地影响，能够极大程度上提高白酒酒糟的利用率。发酵后的饲料营养更均衡，含有丰富的维生素、多种微生物酶、生物活性物质及成长调节剂，动物更易吸收利用，解决了目前配合饲料中营养水平低、吸收效率不高的问题。目前，能够降解纤维素的菌株有很多，主要为绿色木霉、康宁木霉及黑曲霉Μ等几个菌株。然而现在这些已研究或应用的纤维素分解菌株仍存在着酶活活性不稳定、纤维素降解能力差、产酶成本高等问题，难以应用在白酒酒糟的纤维素降解中。本专利利用筛选得到的一株扩展青霉菌(Penicillium expansum)菌株分解利用白酒酒糟，产纤维素酶的酶活较高，性能稳定，是一种具有应用潜力的白酒酒糟稻壳纤维素降解菌株。
[0006](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术·的不足，提供了一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，该菌株可有效地将纤维素降解成葡萄糖，其纤维素酶的酶活较高，性能稳定，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素降解菌株。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特殊之处在于:命名为扩展青霉菌Penicillium expansum N53,该菌株的 18S rDNA 序列如下:
tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta300
acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc cgatacgggg aggtagtgac aataaatact420
gatacggggc tcttttgggt ctcgtaattg gaatgagaac aatttaaatc ccttaacgag480
gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta540
tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt gcggttctat tttgttggtt780
tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc gtcagtattc agctgtcaga840
ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc aaggatgttt900
tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta960
accataaact atgccgacta gggatcggac gggattctat gatgacccgt tcggcacctt1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680
ttagagaa1688，上述18S rDNA序列全长1688个核苷酸 。
[0008]本发明所述产降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌(Penicillium expansum)N53是一株通过自然选育获得的扩展青霉菌株，菌株已于2013年3月5日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.7275。
[0009]上述降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌N53，其生物学特征(6)是:在固体培养(分离培养基)平板上30°C培养96h后观察，菌落圆形铺展，向四周成辐射状，中间成绒状，孢子成暗绿色，有白色的边缘，最后变为褐色。光学显微镜下观察菌体分生孢子梗有隔膜且较长，比较光滑，顶端排列成帚状的分枝，分枝1-2次，顶层以切离法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子成椭圆形，光滑无色。
[0010]对本发明的菌株CGMCC N0.7275测定18S rDNA的基因序列的结果显示，该菌属于扩展青霉，测序核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]通过使用美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI ) BLAST 程序比对，发现本发明的 CGMCC N0.7275 菌株 18S rDNA 的基因序列与 NCBI 注册的扩展青梅(Penicillium expansum) HDJZ-ZWM-17 (⑶227344) 18SrDNA的基因序列具有高度同源性，并结合生理生化实验，初步鉴定CGMCC N0.7275菌株是一株扩展青梅(Penicillium expansum)。
[0012]上述用于菌体形态观察的固体培养基组成:CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2S04 4 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4
?7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、琼脂 20 g/L, pH 自然。
[0013]本发明所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉(Penicillium expansum)菌种选育的基本方法是:
使用筛选培养基培养都得到单菌落，加入刚果红溶液染色，再经过NaCl溶液脱色筛选得到透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，再将其接入到液体产酶培养基中，选取纤维素酶酶活较高的菌株，经过多次分离纯化，获得扩展青霉N53菌株(CGMCC N0.7275)，其中刚果红溶液染色2h，NaCl溶液中NaCl的质量分数为1%，脱色lh。
[0014]本发明所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉(Penicillium expansum)在白酒酒糟纤维素降解中的应用。
[0015]利用扩展青霉(Penicillium expansum)降解白酒酒糟纤维素的方法如下:
摇瓶发酵:取30°C培养3-4天的新鲜斜面倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液，接种发酵培养基，35°C摇瓶发酵72小时，发酵结束测定纤维素酶酶活及纤维素含量，纤维素酶活最高可达10_14u/ml,纤维素转化率为60-80%。
[0016]固体发酵:30°C培养3-4天的新鲜斜面倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液，按3%的接种量接入到预先准备好的发酵培养基中，30°C静置培养48h，发酵结束测定发酵培养基中的纤维素酶酶活和纤维素含量，纤维素酶活最高可达ll_15u/ml，纤维素转化率为65%-85%。
[0017]上述筛选用平板培养基组成为:CMC-Na10 g/L,K2HPO4.3Η20 2 g/L、(NH4) 2SO4 4g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、琼脂 20g/L, pH 自然;
上述斜面培养基组成为:土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，pH值自然；
上述发酵培养基的组成为:白酒酒糟10-90 g/L、麸皮10-90g/L (两者比例从1:9至9:1 均可)、豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2PO4 0-4 g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。
[0018]上述固体发酵培养基的组成为:白酒酒糟与麸皮的比例为7:3、料液比为1:0.8，其中营养液中豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P040_4g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。[0019]上述纤维素酶活按下述方法测定:
使用DNS闭塞法测定。测定原理是纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，而寡糖和单糖能在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，其又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
[0020]上述纤维素含量按下述方法测定:
使用硫酸蒽酮比色法测定。测定原理是纤维素在酸性条件下加热水解成葡萄糖，然后在浓硫酸作用下，单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。
[0021 ] 上述纤维素转化率测定按下述方法测定:
纤维素转化率(％)=[初始培养基中纤维素含量(g/L)-发酵后培养基中纤维素含量(g/L)]/初始培养基中纤维素含量(g/L)
由于白酒酒糟中粗纤维含量较高，因而对其中的半纤维素进行酸解，提取具有较高经济价值的木糖，而后再将提取木糖后的白酒酒糟进行纤维素降解，使降解后的白酒酒糟生产的蛋白饲料营养更加全面、充足，并实现白酒酒糟的全面利用。[0022]本发明所述扩展青霉(Penici 11 ium expansum)N53可将白酒酒糟中的纤维素降解成葡萄糖，且具有纤维素酶酶活高，纤维素转化生成葡萄糖的转化率高等特点，极大程度上提高了白酒酒糟的利用率，对于后续生成蛋白饲料提供了保证，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素分解菌株。利用扩展青霉(Penicillium expansum)发酵降解白酒酒糟纤维素的研究较少。
[0023](四)【专利附图】
【附图说明】
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0024]本发明提供的扩展青霉菌株菌(Penicillium expansum) N53,已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，邮政编码:100080，其保藏编号为CGMCC N0.7275。
[0025]图1扩展青霉菌(Penicillium expansum) N53平板透明圈；
图2扩张青霉菌(Penicillium expansum) N53菌落形态图；
图3扩张青霉菌(Penicillium expansum) N53光学显微镜下分生孢子梗；
图4扩张青霉菌(Penicillium expansum) N53构建系统发育树。
[0026](五)【具体实施方式】
实施例1降解白酒酒糟纤维素扩展青霉菌株的筛选
白酒酒糟及土样中的微生物经富集培养后，梯度稀释至适当浓度涂布到筛选培养基中，30°C培养3-4天，挑取单菌落转接至斜面培养基中30°C培养3-4天，然后划线到筛选培养基中30°C培养，待长出单菌落后加入其质量分数1%的刚果红溶液染色2h，再经质量分数为l%NaCl溶液脱色lh，观察有无透明圈的产生，并记录透明圈直径及菌落直径的大小，如图1。选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行复筛。将初筛分离得到的菌株接种到液体产酶培养基中，300C、180r/min培养3天后，测定各菌株发酵液的纤维素酶酶活，选取酶活较高的菌株。将测定出的纤维素酶酶活较高的菌株以一株接三瓶的方式接入发酵培养基中，30°C、180r/min培养3天后，测定各菌株纤维素酶的酶活，最终筛选出一株酶活较高且稳定的菌株，命名为扩展青霉(Penicillium expansum) N53。[0027]上述菌株扩展青霉(Penicillium expansum)N53,已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码:100080，其保藏编号为CGMCC N0.7275。
[0028]上述富集培养基组成为:CMC-Na10 g/L、K2HPO4.3H20 I g/L、Na2CO3 5 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母膏 10 g/L, pH 自然;
上述平板分离培养基组成为=CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2SO4 4 g/L、MgSO4.7Η20 0.1 g/L,FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、琼脂 20 g/L,pH自然；
上述斜面培养基组成为:土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L, pH自然。
[0029]上述摇瓶发酵培养基组成为:白酒酒糟10-90 g/L、麸皮10_90g/L(两者比例从1:9 至 9:1 均可)、豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2PO4 0-4 g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/UGaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。
[0030]上述降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌N53，其生物学特征(6)是:在固体培养(分离培养基)平板上30°C培养96h后观察，菌落圆形铺展，向四周成辐射状，中间成绒状，孢子成暗绿色，有白色的边缘，最后变为褐色，如图2所示。光学显微镜下观察菌体分生孢子梗有隔膜且较长，比较光滑，顶端排列成帚状的分枝，分枝1-2次，顶层以切离法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子成椭圆形，光滑无色，如图3所示。
[0031]上述用于菌体形态观察的固体培养基组成:
CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2S04 4 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4
?7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、琼脂 20 g/L, pH 自然。
[0032]实施例2 扩展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275 18S rDNA 测序 将实施例1选育得到的白酒酒糟纤维素降解菌株N53即CGMCC N0.7275菌株委托济南
力戈科技有限公司进行18S rDNA测序。
[0033]实验方法是:挑取斜面培养物于700 μ 165°C预热的FPCB Solution和7 μ I β -巯基乙醇中，65°C水浴后离心取上清液作为模板，使用UNIQ-10 Genomic DNA Preps KU，以NS1、NS6为引物，扩增目的片段。取5μ I进行琼脂糖凝胶电泳，使用UNIQ-10 Spin ColumnDNA Gel Extraction Kit 切胶回收目的片断，以 Seq ForwarcUSeq Reverse Seq Internal为引物对上述回收产物进行DNA测序。
[0034]测序结果:扩展青霉(Penicilliumexpansum)CGMCC N0.7275 18S rDNA测序核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0035]通过使用美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NcBI ) BLASTN 程序比对，发现 CGMCC N0.7275 菌株 18S rDNA 序列与NCBI 注册的扩展青霉(Penicillium expansum) HDJZ-ZWM-17 18S rDNA 序列具有高度同源性，结合菌落形态及镜检观察，如图2及图3，说明CGMCC N0.7275菌株是一株扩展青霉(Penicillium expansum)。
[0036]扩展青霉(Penicilliumexpansum) N53 序列表:
SEQ ID N0.1
SEQUENCE LISTING
<110>山东省食品发酵工业研究设计院〈120〉一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株〈130〉 2012-11-15〈160〉 I
<170> PatentIn version 3.3〈210〉 I〈211〉 1688〈212〉 DNA <213> 扩展青霉(Penicillium expansum)
〈400〉 I
tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
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acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
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tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
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tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680
ttagagaa1688实施例3 扩展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275菌株的应用将扩展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275菌株移接斜面活化；
按上述斜面培养基的组成配置斜面培养基，划线30°C 3-4天后，倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液。按白酒酒糟10-90 g/L、麸皮10-90g/L(两者比例从1:9至9:1均可)、豆柏5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P04 0-4 g/L、MgS04.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20
0.05-1 g/L、MnS04.H20 0-0.4 g/L、ZnS04.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0 培养基的组成配制发酵培养基，初始纤维素含量为248g/L (根据前面麸皮及酒糟的含量适当变化)，250ml三角瓶装液量为30ml，121 °C蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种孢子悬液液1ml，置旋转转速为150-220r/min、旋转半径为40mm摇床上，25-37°C培养64-72小时结束发酵，发酵液以4000 r/min离心10分钟,取上清液测定纤维素酶酶活为10_14u/ml,沉淀测定纤维素含量为57 g/L,纤维素转化率为60-80%。
[0037]或者:
按上述斜面培养基的组成配置斜面培养基，划线30°C 3-4天后，倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液。按白酒酒糟与麸皮的比例为7:3、料液比为1:0.8，其中营养液中豆柏5-40g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P040_4g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0 上述固体发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始纤维素质量分数为21.7%，121 °C蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，按3%的接种量接入到发酵培养基中，25-37°C静置培养36-48h，发酵结束测定发酵培养基中的纤维素酶酶活力和纤维素含量，纤维素酶活最高可达ll-15u/ml，纤维素质量分数为3.23%，纤维素转化率为65-85%。
[0038]上述纤维素酶活 按下述方法测定:
使用DNS闭塞法测定。测定原理是纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，而寡糖和单糖能在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，其又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
[0039]上述纤维素含量按下述方法测定:
使用硫酸蒽酮比色法测定。测定原理是纤维素在酸性条件下加热水解成葡萄糖，然后在浓硫酸作用下，单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。
[0040]上述纤维素转化率测定按下述方法测定:
纤维素转化率(％)=[初始培养基中纤维素含量(g/L)-发酵后培养基中纤维素含量(g/L)]/初始培养基中纤维素含量(g/L)。
[0041]参考文献:
[I]王肇颖，肖敏.白酒酒糟的综合利用及其发展前景[J].酿酒科技，2004，(I): 64-67。
[0042][2]吴忠会，刘清波，刘正安.白酒丢糟“零排放”的研究[J].食品科学，2008，29(8): 201-204。
[0043][3]李政一.白酒糟综合利用研究[J].北京工商大学学报(自然科学版)，2003，21(1):9-13。
[0044][4]施安辉.当前酿酒工业固体酒糟生态型综合利用的前景，2004，(3):9_11。
[0045][5]鲁文普，杨玉能.酒糟的饲料化利用概况，2009，33 (4):9_10。[0046] [6]魏景超.真菌分类鉴定手册[M]上海出版社， 1974:508-509。
【权利要求】
1.一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特征在于:命名为扩展青霉菌Penicillium expansum N53，该菌株的 18S rDNA 序列如下: tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta300
acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc cgatacgggg aggtagtgac aataaatact420
gatacggggc tcttttgggt ctcgtaattg gaatgagaac aatttaaatc ccttaacgag480
gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta540
tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt gcggttctat tttgttggtt780
tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc gtcagtattc agctgtcaga840
ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc aaggatgttt900
tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta960
accataaact atgccgacta gggatcggac gggattctat gatgacccgt tcggcacctt1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680ttagagaa1688，上述18S rDNA序列全长1688个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特征在于:在固体培养或分离培养基的平板上进行培养，然后观察菌落圆形铺展，向四周成辐射状，中间成绒状，孢子成暗绿色，有白色的边缘，最后变为褐色，光学显微镜下观察菌体分生孢子梗有隔膜且较长，比较光滑，顶端排列成帚状的分枝，顶层以切离法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子成椭圆形，光滑无色。
3.根据权利要求1或2所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特征在于:采用BLAST分析法，将扩展青霉菌N53的18S rDNA全序列与与NCBI注册的扩展青梅HDJZ-ZWM-17 18S rDNA的基因序列具有高度同源性的基因序列比较，同源性为.98.0%-99.0%。
4.根据权利要求1或2所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特征在于:该菌株是应用在白酒酒糟纤维素降解中。
5.根据权利要求1或2所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株选育方法，其特征在于:包括以下步骤: 使用筛选培养基培养都得到单菌落，加入刚果红溶液染色，再经过NaCl溶液脱色筛选得到透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，再将其接入到液体产酶培养基中，选取纤维素酶酶活较高的菌株，经过多次分离纯化，获得扩展青霉N53菌株。
6.根据权利要求1或2所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株选育方法，其特征在于:NaCl溶液中NaCl的质量分数为1%。
【文档编号】C12N1/14GK103667075SQ201310475001
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】徐慧, 刘建军, 李文婧, 牛梅丽 申请人:山东省食品发酵工业研究设计院