专利名称：检测诺氟沙星的scFv抗体、其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测诺氟沙星的SCFv重组抗体、其编码基因及应用。
背景技术：
诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)，化学名称为1_乙基_6_氟-1，4_ 二氢_4_氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是氟喹诺酮类抗菌药，具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，对下列细菌在体外具良好抗菌作用肠杆菌科的大部分细菌，包括枸椽酸杆菌属、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等肠杆菌属、大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形菌属、 沙门菌属、志贺菌属、弧菌属、耶尔森菌等。诺氟沙星体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。对青霉素耐药的淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌亦有良好抗菌作用。诺氟沙星作为一种常用兽药在畜牧业生产中得到广泛使用。但因其具有一定的毒性，在动物性食品中的残留对食品卫生和公共健康产生威胁。检测诺氟沙星残留的方法主要有仪器分析法和免疫学方法。化学分析方法因需要昂贵的仪器设备、对样品前处理要求高，且需要配备专门操作人员等，不适合现场监控检测。免疫学方法，目前主要是Elisa(酶联免疫吸附)方法，但该方法的核心试剂-单克隆抗体，因其制备和筛选过程繁琐，且对操作技术要求很高，不利于广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测诺氟沙星的scFv抗体及编码该抗体的基因序列及氨基酸序列。本发明的另一目的是提供上述scFv抗体及其及其编码基因在检测诺氟沙星中的应用。为了实现本发明目的，本发明人运用噬菌体展示技术，将小鼠抗体的重链、轻链可变区基因进行体外扩增，并借助了 15肽的连接肽段将重链和轻链片段拼接成一条单链抗体scFv，接着将该scFv片段插入噬菌体展示载体pCANTABk中，构建成重组质粒，并转化进宿主菌中，经过3轮固相淘筛和鉴定，获得了抗诺氟沙星的scFv单链抗体。其包括重链和轻链，其中，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。前述的scFv抗体，重链和轻链之间的连接肽段为(Glyjer)3。本发明还提供编码上述scFv抗体的基因，其中，编码scFv抗体重链的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本发明还提供含有编码上述scFv抗体的基因的载体。本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。本发明进一步提供上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有所述基因的载体或含有该载体的宿主细胞在检测诺氟沙星中的应用。
本发明还提供上述scFv抗体的制备方法，其是将编码上述scFv抗体的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。其中，所述表达载体为 pCANTAB5e。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果本发明检测诺氟沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中诺氟沙星的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的诺氟沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。能简便、高效地运用本发明获得的能分泌表达抗诺氟沙星重组抗体的重组菌株制备特异性的抗诺氟沙星scFv重组抗体。
图1 :scFv-pCANTABk重组质粒sfil和NotI双酶切电泳图，M :DL2000核酸分子量 Marker，1 10 :scFv-pCANTAB5e 酶切产物。图2 为30个重组菌诱导表达产生可溶性抗体scFv-ELISA检测结果。图3 重组菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图，1 重组菌诱导表达胞周间质，2 重组菌诱导表达上清液，3 阴性对照。图4 诺氟沙星诱导表达上清可溶性重组抗体IC5tl实验结果曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的试剂盒材料均为市售商品。实施例1免疫原及检测原的偶联制备1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、诺氟沙星(NFLX)标准品、透析膜、透析膜处理液、磁力搅拌仪、紫外分光光度仪。2、方法采用混合酸酐法，将诺氟沙星与蛋白大分子(BSA、OVA)进行偶联，制备免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及纯化A.中间产物制备a.取20mg药物置于烧杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超声波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力搅拌反应；c.将以上烧杯用锡箔纸包裹好，室温磁力搅拌反应M小时，此液为A液。B.合成及初步纯化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液为 B 液；b.在磁力搅拌下，将A液逐滴滴入B液中；c.用锡箔纸将烧杯包裹，室温搅拌反应过夜；
d.待以上反应完成，将过夜反应液转移至处理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小时换液，之后每8-12小时换液；e.透析结束后，将透析袋内的溶液以4000rpm离心30min，取上清，_20°C冻存；f.取透析液在紫外分光光度仪下，检测偶联效果及偶联物浓度测定表明 NFLX-BSA, NFLX-OVA偶联物制备成功。实施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周龄)、弗氏完全佐剂(sigma公司)、弗氏不完全佐剂(sigma 公司)、96孔酶标板、免疫原NFLX-BSA、包被原NFLX-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0. 05N, PH9. 6)、封闭液脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0. 1 % Tween20PBST)、终止液、鼠源抗诺氟沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原NFLX-BSA加入等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂；b.首免取8只6周龄Balb/c小鼠，采用背部多点注射免疫，0. 2ml/只，同时设置生理盐水对照组；C. 二免与三免免疫方法取100 μ g免疫原与等量弗氏不完全佐剂制成乳化剂， 背部多点免疫小鼠；每次免疫间隔15天。d.三免15天后，处死小鼠，摘取脾脏，_70°C冻存。眶下窦取血，离心取血清。2. 2ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价a.将包被原 NFLX-OVA 用包被缓冲液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l,0. 3mg/l,0. 2mg/l, 0. lmg/1浓度梯度，200 μ 1/孔，包被酶标板，4°C包被过夜；b.洗涤弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；c.封闭向每孔加满封闭液，于37 °C封闭1. 5小时；d.洗涤弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；e.加血清抗体将小鼠血清抗体，用PBS按照1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600、1 3200、1 6400、1 12800、1 25600、1 51200 进行梯度稀释后，加入封闭好的酶标孔中，200 μ 1/孔，37°C孵育反应2小时；f.洗涤弃血清抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；g.加酶标二抗HRP标记山羊抗鼠IgG抗体用PBS做1 10000稀释，200 μ 1/孔， 37 °C孵育反应1小时；h.洗涤弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；i.显色加入200 μ 1/孔TMB显色液，37°C孵育显色45min左右；j.终止用200 μ 1/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。3、结果通过间接ELISA检测，包被原最佳浓度0. 2mg/mL·诺氟沙星免疫组的5只小鼠(1、 2、6、7、8号)血清抗体效价达到1 1观00以上，可满足进一步实验的需要。实施例3免疫小鼠脾细胞RNA的提取及通过RT-PCR获得cDNA1、材料
免疫小鼠脾脏、细胞筛、DEPC处理的灭菌PBS、DEPC处理去离子水、总RNA提取试剂盒RNA iso Plus (Takara公司)、反转录试剂盒(Takara公司)。2、方法2. 1脾细胞总RNA的提取采用总RNA提取试剂盒RNAiso Plus，参照说明书进行。待RNA完全溶解后，在紫外分光光度计上测定获得RNA的质与量。将RNA冻存于-70°C。2. 2反转录合成cDNA从-70°C低温冰箱中取出获得的小鼠脾脏RNA，在低温环境下进行操作。采用商品化总RNA提取试剂盒(Takara)，参照说明书进行。扩增获得cDNA第一链，-70°C保存。3、结果根据免疫小鼠血清抗体效价，选取了效价高的小鼠脾脏，通过提取RNA并进行反转录，共制得诺氟沙星免疫组小鼠(共5只1、2、6、7、8号)脾细胞cDNA文库，cDNA浓度均达到 500ng/y L·实施例4scFv单链抗体库的构建1、材料免疫小鼠cDNA、重组噬菌体抗体扩增系统(Recombinant PhageAntibody System) (27-9400-01)包括重链引物对、轻链引物混合物和linker引物混合物、RS引物混合物 (Pharmacia 公司)、long amp TaqDNA 聚合酶(NEB 公司)、琼脂糖凝胶、DNAladder (DL2000、 lkb, TaKara公司)、凝胶回收试剂盒(TaKara公司)、质粒提取试剂盒(TaKara公司)、T4 DNA连接试剂盒(NEB公司)、限制性内切酶(sfiI、NotI) (^ffiB公司)、pMD18_T simple载体系统(TaKara公司)、DH5 α工程菌、TGl宿主菌、pCANTAB5e噬菌体载体、0. IN CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨苄青霉素、卡那霉素。2、方法2. IVH 禾口 VL 基因 PCR 扩增A.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VH基因PCR扩增反应体系
；xPCR缓冲液20 μLIOmM dNTP (每种)6 pLcDNA (约 200ng )5 μ ν重链引物对4 μ Longamp Taq4 μL双蒸水补足100 μL将以上反应体系除longamp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增950C 5min 热启动，加入 Longamp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；；35 个循环后，65°C 10min，4°C 保温。
PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(340bp)的目的条带。B.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VL基因PCR扩增反应体系，反应体系如本节A所列，加入轻链引物混合物2 μ L，用双蒸水补足100 μ L反应体系。将以上反应体系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，扩增参数如本节A所列。PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(32^p)的目的条带。C. PCR扩增产物切胶纯化回收使用胶纯化试剂盒(Takara公司)回收，参照说明书进行。将纯化回收获得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。2. 2S OE-PCR 拼接 VH-Linker-VL 基因采取“VH-Linker-VL”形式将VH基因、Linker及VL基因进行拼接。采用二步法 SOR-PCR法进行。取以上纯化获得的VH和VL基因片段，在低温环境下构建scFv基因拼接PCR扩增
反应体系
5xPCR缓冲液IOpL
IOmM dNTP (每种)5 μ νVH基因片段约 50 ngVL基因片段约 50 ngLinker引物混合物4 μLLongamp Taq2 pL双蒸水补足50 μL将以上反应体系加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增 940C Imin，63 °C 4min，7 个循环。2. 3引入sfil、NotI酶切位点A.以上反应结束，立即取出反应体系，迅速加入预先配制好的以下反应体系
5xPCR缓冲液IOpL
IOmMdNTP (每种)2 pL
RS引物混合物
Long amp Taq2 pL
双蒸水32 μ 将以上反应体系迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增940C lmin，55°C 2min，65°C 2min，30 个循环后，65°C 10min，4°C保温。PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混勻，加入到琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(750bp)的目的条带。B. scFv拼接产物切胶纯化回收使用凝胶纯化试剂盒Oiiagen)回收，参照说明书进行。将纯化回收获得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。C. scFv 基因连接 pCANTAB5e使用商品化T4DNA连接酶(ftOmega)，将经sfil和NotI酶切处理的scFv片段与 pCANTABk载体连接。操作方法参照说明书进行。取适量pCANTABk载体和scFv基因片段，在低温环境下构建连接反应体系
权利要求
1.一种检测诺氟沙星的SCFv抗体，其包括重链和轻链，其特征在于，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，重链和轻链之间由连接肽段连接。
2.如权利要求1所述的scFv抗体，其特征在于，重链和轻链之间的连接肽段为 (Gly4Ser)30
3.编码权利要求1或2所述scFv抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体重链的基因具有SEQID No. 3 所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQID No. 4 所示的核苷酸序列。
6.含有权利要求3-5任一项所述基因的载体。
7.含有6所述载体的宿主细胞。
8.权利要求1或2所述的scFv抗体、权利要求3-5任一项所述的基因、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在检测诺氟沙星中的应用。
9.权利要求1或2所述scFv抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求3-5任一项所述的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pCANTABk。
全文摘要
本发明提供了一种检测诺氟沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，重链和轻链之间由柔性连接肽(Gly4Ser)3连接。重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供编码上述scFv抗体的基因。本发明检测诺氟沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中诺氟沙星的残留量；对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；初次建库后，该scFv抗体的制备简单方便。采用高特异性的抗诺氟沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性好、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
文档编号C12N15/63GK102212136SQ20111007436
公开日2011年10月12日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者侯晓林, 刘文娟, 赵扬, 郑志明, 金社胜 申请人:商务部流通产业促进中心