专利名称：一种肌酸激酶mb同工酶活性测定试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学检验领域中的一种分析试剂，具体涉及用于测定血液中肌酸激酶 MB同工酶活性的试剂。
背景技术：
肌酸激酶(CK)有三种主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB, CK-BB0肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)，主要存在于心肌中，是心肌酶谱中最有特异性的酶，从八十年代起公认为心肌酶学诊断的“金标准”，应用于急性心肌梗塞(AMI)的早期诊断，是诊断及监测AMI病人病情敏感而特异的指标。临床上最普遍采用免疫抑制法，其原理免疫抑制法试剂中的抗CK-M抗体抑制 CK-M亚基，即抑制CK-MM活性和CK-MB的CK-M亚单位的活性，通过测定样品中未被抑制的 CK-B单体的活力(相当于一半CK-MB活力)，所以将结果乘以2，计算出CK-MB的活力，CK-MB 试剂的检测灵敏度相应也比CK低一半左右，由于CK-MB参考值<25 U/L,其上限25 U/L 的每分钟吸光度变化值只有0. 003左右，检测仪器的温飘及脂浊标本的干扰，都会产生较大的测量误差，使得测定结果不可靠。申请号200610114997.9的专利通过反应生成过氧化氢+鲁米诺+过氧化物酶化学发光法测定肌酸激酶MB同工酶活性，虽然有较高的检测灵敏度，但由于肌酸激酶在血清中很容易失活，通常要加入巯基试剂保持其活力，巯基试剂会严重抑制过氧化氢+过氧化物酶反应，使其测定结果不可靠性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，含有硫代氧化型辅酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)、巯基试剂、镁盐、葡萄糖激酶(GLUK) (或己糖激酶)、抗CK-M抗体、磷酸肌酸(CP)，二磷酸腺苷(ADP)、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)。优选地，上述硫代氧化型辅酶为硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD) 或其盐，或者硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Thio-NADP)或其盐；所述巯基试剂为N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或硫代甘油(TG)。进一步地，上述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，还可以含有一磷酸腺苷 (AMP)、二腺苷五磷酸(P1，P5-DiAP)、稳定剂和防腐剂。上述稳定剂为蛋白稳定剂、二糖、多糖、多元醇、氨基酸、螯合剂或非离子表面活性剂的一种或两种以上任意混合物；所述防腐剂为PR0CLIN系列防腐剂、叠氮钠、庆大霉素、 氯霉素、对羟基苯甲酸甲酯、脱氧乙酸及其盐或阳离子表面活性剂中的一种或其两种以上任意混合物。优选地，所述肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂为含有如下浓度成分的溶液 磷酸肌酸5-200 mmol/L
二磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L葡萄糖1-200 mmol/L
葡萄糖激酶(或己糖激酶)0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 0. 1-100 KU/L 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型辅酶0. 1-50 mmol/L
巯基试剂1-100 mmol/L
抗CK-M抗体 CK-M抑制>500 U/L 镁盐1-100 mmol/L
上述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，还可含有如下浓度的成分
一磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L
二腺苷五磷酸 0. 001-0. 1 mmol/L
稳定剂0. 1-20 mmol/L
防腐剂0. 1-20 g/L
上述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂的制备方法为将各成分溶于PH为5. (Γ9. 5 的缓冲液中。上述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂可为双试剂，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶(或己糖激酶，优选葡萄糖激酶)、 G6PDH、6P⑶H、硫代氧化型辅酶、巯基试剂、抗CK-M抗体、镁盐，所述试剂2包括以下成分
磷酸肌酸。上述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂(双试剂)的制备方法，步骤为1)将第一剂的各成分溶于PH为5. (Γ9. 5的缓冲液中，备用；2)将第二剂的成分溶于pH为5. (Γ9. 5的缓冲液中，备用。上述制备方法中，所述缓冲液为浓度为20-500 mmol/L的咪唑缓冲液、Bis-Tris 缓冲液或生物缓冲液。本发明提供的肌酸肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂能够达到以下效果
1)本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，检测灵敏度与现有技术相比能放大数倍，使测定结果具有高精密度、准确度；
2)本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂在405nm生成黄色指示，可以应用到干式试剂、快速检测试剂。
图1是实施例2制得的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂和对比例的肌酸激酶MB 同工酶活性测定试剂的反应灵敏度曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂含有硫代氧化型辅酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、巯基试剂、镁盐、葡萄糖激酶(或己糖激酶，优选葡萄糖激酶)、抗CK-M抗体、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其测定活性时的反应原理为 反应1、CK-M被抗CK-M抗体抑制
反应式 2、 磷酸肌酸 + 二磷酸腺苷 CK, >肌酸+三磷酸腺苷
反应式3、三磷酸腺苷+葡萄糖 GluK〉二磷酸腺苷+ G6P
反应式 4、G6P + Thio-NAD (P)+ GSPDH 6-PG + Thio-NAD (P)H + H+
反应式 5、6-PG + Thio-NAD (P)+ 6PGDH 、核糖 _5_ 磷酸 + Thio-NAD (P)H + H+
在405 nm测定吸光度增加的速率与肌酸激酶MB同工酶活性成正比。本发明采用硫代氧化型辅酶其在405nm具有较高的吸光度，而且反应式3产物葡萄糖-6-磷酸经过本发明二级放大，结合高灵敏的指示系统，使本发明的检测灵敏度可以达到临床上最普遍采用的免疫抑制法的4倍左右，从而测定结果精度提高得以保障。所述的硫代氧化型辅酶，可以是硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)、 硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Thio-NADP)，或上述辅酶的盐类。所述用于激活肌酸激酶活性的巯基试剂，可以是N-乙酰-L-半胱氨酸、硫代甘油等巯基试剂。加入的镁离子可以是醋酸镁、硫酸镁、氯化镁等，镁离子的加入除可激活反应式2 的反应外，更作为酶的辅助因子，维持酶的构象。作为优化的技术方案，肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂中还含有一磷酸腺苷、 二腺苷五磷酸、稳定剂和防腐剂。
一磷酸腺苷和二腺苷五磷酸的加入可降低待测样品中其他酶对测定结果的干扰。所述的稳定剂可以为蛋白稳定剂、多元醇、氨基酸、螯合剂和非离子表面活性剂。 其中，所述的多元醇、二糖、多糖、蛋白类稳定剂、氨基酸、螯合剂、二价金属离子，可以是单独使用，也可以是组合使用。其中，多元醇可以是甘油、乙二醇、丙二醇、二甘醇等，多元醇可以和水相互间形成坚强的氢键，降低水分子的活力，保持酶活性的三维结构。二糖类可以是蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等。蛋白类稳定剂可以是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等，蛋白类稳定剂可以和试剂中酶分子作用，减少离解为亚基或变性失活。氨基酸可以是赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸等及其盐，氨基酸可以协助保护酶蛋白质氨基酸核心序列的构想完整性，提高稳定性。螯合剂有乙二胺四乙酸、亚氨基二乙酸、氮三乙酸和二乙基三胺五乙酸、2-环已二胺四乙酸、乙二醇双(α -氨基乙酸)醚四乙酸、乙基乙二胺三乙酸等及其盐类，螯合剂中微量重金属，可防止抑制酶活性。非离子表面活性剂可以是吐温系列、TritonX、聚乙二醇系列等非离子表面活性剂，起到主要增溶、澄清、防止水溶液游离氧等作用。防腐剂可以是PR0CLIN系列防腐剂(2-甲基_4_异噻唑啉_3_酮和5_氯_2_甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、叠氮钠、庆大霉素、氯霉素、对羟基苯甲酸甲酯、脱氧乙酸及其盐、 阳离子表面活性剂等，可在保质期内抑制微生物的生长，防止试剂失效。
将上述各成分溶于pH为5. (Γ9. 5的缓冲液中即可制得本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂。缓冲液无特定要求，最好PH在5. 0-9. 5，可以使用是咪唑缓冲液，也可以是Bis-Tris缓冲液、Good’ s生物缓冲液等以维持试剂的pH值。本发明优选采用pH为 5. (Γ7. 5，浓度为20-500 mmol/L的咪唑醋酸缓冲剂作为缓冲液。为提高试剂保存时的稳定性，本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂可为双试剂将以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶、G6PDH、6PGDH、硫代氧化型辅酶、巯基试剂、抗CK-M抗体和镁盐溶于pH 5. (Γ9. 5的缓冲液中制成试剂1 ；将磷酸肌酸溶于pH 5. (Γ9. 5的缓冲液中制成试剂2。缓冲液无特定要求，最好pH在5. 0-9.5，可以使用是咪唑缓冲液，也可以是Bis-Tris缓冲液、Good’ s生物缓冲液等以维持试剂的pH值。本发明优选采用PH为5. (Γ7. 5，浓度为20-500 mmol/L的咪唑醋酸缓冲剂作为缓冲液。上述各成分在缓冲液中的浓度优选为 磷酸肌酸5-200 mmol/L 二磷酸腺苷 0. 5-20 mmol/L 葡萄糖 1-200 mmol/L 葡萄糖激酶 0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶0. 1-100 KU/L
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型辅酶0. 1-50 mmol/L
巯基试剂1-100 mmol/L
抗 CK-M 抗体(CK-M 抑制 >500 U/L) 镁盐1-100 mmol/L
一磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L
二腺苷五磷酸 0. 001-0. 1 mmol/L 稳定剂0. 1-20 mmol/L
防腐剂0. 1-20 g/L。以本发明制得的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂对肌酸激酶MB同工酶活性测定的具体步骤如下
在日立7180自动生化分析仪上测定精密度试验将取待测血清标本加入本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂中，混勻，37°C孵育1 3分钟后，连续监测2分钟波长 405nm的吸光度变化速率，测得待测标本中肌酸激酶MB同工酶的活性数值。本发明制得的肌酸激酶MB同工酶的精密度计算，具体步骤如下
取高低两个水平的血清样本，在日立7180自动生化分析仪上平行测定同-计算测定值的平均值和标准差，按( 式计算批内变异系数。变异系数=S/V X 100%............ (2)
式中s为标准差，计算公式为
-样本20次，
d + d i + · ■ + dl
Il - 1
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为Cln=Xn-^为同水平各次所测值；
Γ为平均值，计算公式为f = (Xl+X2+……+ ) /η。
本发明的优选实施例具体如下 实施例1
本实施例的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其主要成分及浓度如下
咪唑缓冲液PH 6. 7 100 mmol/L
磷酸肌酸30 mmol/L
ADP 2 mmol/L
葡萄糖20 mmol/L
GluK 2 KU/L
G6PDH 1. 5 KU/L
6PGDH 10 KU/L
硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸2 mmol/L NAC 20 mmol/L
抗 CK-M 抗体(CK-M 抑制 >2000 U/L)
EDTA 2 mmol/L
乙酸镁 10 mmol/L
AMP 5 mmol/L
P1, P5-DiAP 0. 01 mmol/L
将本实施例制得的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂在日立7180生化分析仪上测定精密度试验将取待测标本12μ L加入本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂300μ L 中，混勻，37°C孵育1-3分钟后，连续监测2分钟吸光度变化速率，测定波长405nm，测得肌酸激酶MB同工酶活性数值。日立7180自动生化分析仪测定参数
TEST NAMECK-MB
ASSAYRATE-A
TIME10
POINT10-16
WAVELENGTH660/405
SAMPLE VOLUME(NORMAL) 12 REAGENT Rl300
REAGENT R2 REAGENT R3
UNITU/L
K4522
本实施例的精密度实验计算结果如下 表一、精密度试验
权利要求
1.一种肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，含有硫代氧化型辅酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、巯基试剂、镁盐、葡萄糖激酶或己糖激酶、抗CK-M抗体、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，所述硫代氧化型辅酶为硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐，或者硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；所述巯基试剂为N-乙酰-L-半胱氨酸或硫代甘油。
3.根据权利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，还含有一磷酸腺苷、二腺苷五磷酸、稳定剂和防腐剂。
4.根据权利要求3所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，所述稳定剂为蛋白稳定剂、二糖、多糖、多元醇、氨基酸、螯合剂或非离子表面活性剂的一种或两种以上任意混合物；所述防腐剂为PR0CLIN系列防腐剂、叠氮钠、庆大霉素、氯霉素、对羟基苯甲酸甲酯、脱氧乙酸及其盐或阳离子表面活性剂中的一种或其两种以上任意混合物。
5.根据权利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，所述肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂为含有如下浓度成分的溶液磷酸肌酸5-200 mmol/L二磷酸腺苷0. 5-20 mmol/L葡萄糖1-200 mmol/L葡萄糖激酶或己糖激酶 0. 1-100 KU/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 0. 1-100 KU/L 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 0. 1-100 KU/L 硫代氧化型辅酶0. 1-50 mmol/L巯基试剂1-100 mmol/L抗CK-M抗体CK-M抑制>500 U/L镁盐1-100 mmol/L。
6.根据权利要求5所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，还含有如下浓度的成分0.5-20 mmol/L 0.001-0. 1 mmol/L 0.1-20 mmol/L 0.1-20 g/L。
7.根据权利要求1所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，其特征在于，所述肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂为双试剂，包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括以下成分二磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖激酶或己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、硫代氧化型辅酶、巯基试剂、抗CK-M抗体和镁盐，所述试剂2包括以下成分磷酸肌酸。
8.权利要求1飞任一项所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂的制备方法，其特征在于，将各成分溶于PH为5. (Γ9. 5的缓冲液中。
9.权利要求7所述的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂的制备方法，其特征在于，步骤为1)将第一剂的各成分溶于PH为5. (Γ9. 5的缓冲液中，备用；2)将第二剂的成分溶于pH 为5. (Γ9. 5的缓冲液中，备用。一磷酸腺苷二腺苷五磷酸稳定剂防腐剂
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为浓度为20-500 mmol/L的咪唑缓冲液、Bis-1Tris缓冲液或生物缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，含有硫代氧化型辅酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、巯基试剂、镁盐、葡萄糖激酶或己糖激酶、抗CK-M抗体、磷酸肌酸，二磷酸腺苷、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。其制备方法为将各成分溶于pH为5.0~9.5的缓冲液中。本发明的肌酸激酶MB同工酶活性测定试剂，检测灵敏度能放大数倍，测定结果具有高精密度、准确度。
文档编号C12Q1/50GK102154443SQ201110073890
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者不公告发明人 申请人:浙江东瓯诊断产品有限公司