心肌肌钙蛋白i-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶联检试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种定量检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶联检试纸条，所述试纸条包括底板和在底板上依次搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫、包被膜及吸水纸，所述第一结合垫上同时包被有两种不同粒径荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I第一抗体和生物素标记的识别不同表位的心肌肌钙蛋白第二抗体，所述第二结合垫包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌红蛋白第一抗体，所述第三结合垫包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌酸激酶同工酶第一抗体。本实用新型的试纸条能够实现心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检，且具有灵敏度高，使用便捷等优点。
【专利说明】心肌肌钙蛋白卜肌红蛋白-肌酸激酶同工酶联检试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种用于定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条。
【背景技术】
[0002]心肌肌妈蛋白I (Cardiac Troponin I，简称cTnl)是心肌细胞死亡的特异及敏感的标志物，其可在心肌损伤时进入血液中，而未发现在健康的或者受损伤的骨骼肌或者其他组织中表达。cTnl可在胸痛发作后3到6小时内在患者血液中被检测到，并在16到30小时内达到峰值，血液样品中cTnl浓度的升高可持续到症状出现后的5到8天。目前，cTnl作为心肌细胞死亡的标记物已经在临床诊断中广泛应用，如:对心肌损伤的诊断、AMI后溶栓治疗的指示、对围术期心肌梗死的诊断、对心肌炎的诊断以及与骨骼肌损伤的鉴别诊断等。
[0003]肌红蛋白(Myoglobin，简称Myo)是一个含有血红素的由153个氨基酸组成的小分子蛋白质，负责肌肉组织中氧气的储存。作为心肌损伤的标记物，肌红蛋白作为已经被应用了三十多年。肌红蛋白在患者症状出现I到3小时后出现于其血液中，8到12小时之内达到峰值。与心肌肌钙蛋白I(cTnl)相比，肌红蛋白缺乏心肌特异性。由于肌红蛋白大量存在于骨骼肌组织中，即使轻度的骨骼肌损伤都能导致血液中肌红蛋白浓度的显著升高。因此，肌红蛋白与cTnl —起被用于临床实践中以提高急性心肌梗死诊断的特异性。
[0004]肌酸激酶(Creatine Kinase，简称CK)主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，有三种形式的同工酶:CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK及其同工酶CK-MB是临床诊断急性心肌梗死常用的酶学指标，并利用其增高的时间与梯度观察患者的病情变化、治疗效果及愈后。肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于人体心肌细胞内，正常人血清中绝大部分为CK-MM的活性，只有少量的CK-MB，CK-MB占CK总活力少于5%。当炎症或梗死等原因引起心肌细胞受损或坏死，使得大量的CK-MB释放到血液中，会使血清中的CK-MB增高。一般情况下，CK-MB在急性心肌梗死发病后4-8小时内增高，24小时达到峰值，2-3天后恢复正常。CK-MB作为常用的心肌损伤标志物在临床检测中广泛应用。
实用新型内容
[0005]抟术问题
[0006]鉴于心肌损伤后cTn1、Myo和CK-MB释放动力学的差异，cTn1、Myo和C-MB三项联检对于急性心肌梗死的判断具有协同互补作用，比单独cTnl检测具有更有助于急性心肌梗死的早期判断，从而提高心梗的诊断率并制定出相应的治疗方案。因此，亟待需要开发出一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条。_7] 技术方案
[0008]本实用新型提供了一种心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶联检试纸条，其特征在于，所述试纸条包括:
[0009]I)用于接受来自全血、血浆或血清样品的样品垫；
[0010]2)同时包被有两种不同粒径荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I第一抗体和生物素标记的识别不同表位的心肌肌钙蛋白第二抗体的第一结合垫；
[0011]3)包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌红蛋白第一抗体的第二结合垫；
[0012]4)包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌酸激酶同工酶第一抗体的第三结合垫；
[0013]5)包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被膜，其中所述三条检测线依次固定有亲和素、识别不同表位的肌红蛋白第二抗体及识别不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗体，所述质控线固定有抗鼠IgG的抗体；
[0014]6)用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸；和
[0015]7)底板，其中所述底板上依次搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫、包被膜及吸水纸。
[0016]在一个实施方式中，所述两种不同粒径焚光微球的粒径范围均在50nm至500nm之间。
[0017]在一个实施方式中，所述第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫材质为玻璃纤维素膜或者聚酯膜。
[0018]在一个实施方式中，所述包被膜为硝酸纤维素膜。
[0019]在一个实施方式中，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
[0020]有益效果
[0021]本实用新型所提供的一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条兼顾了低值灵敏度和检测的线性范围，其对于急性心肌梗死的判断具有协同互补作用，比单项检测具有更有助于急性心肌梗死的早期判断。另外，该试剂条制备方法简单，可以实现批量生产，有利于大规模推广应用，具备广阔的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本实用新型所述一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条的侧视示意图；
[0023]图2是本实用新型所述一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条的俯视示意图；
[0024]附图标记表示为:1-样品垫、2-第一结合垫、3第二结合垫、4-第三结合垫、5-包被膜、6-吸水纸、7-底板、8-检测线(cTnI)、9-检测线(Myo)UO-检测线(CK-MB)和11-质控线。
【具体实施方式】
[0025]为了促进对于本实用新型的心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶三项联检的原理理解，以下将参照在附图中说明并描述于以下的说明书中的实施方案。应理解由此不意图限制本实用新型的范围。
[0026]图1为一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条的侧视示意图。
[0027]如图1所示，本实用新型的三项联检荧光层析试纸条包括底板6和在底板7上顺序搭接粘结的样品垫1、第一结合垫2、第二结合垫3、第三结合垫4、包被膜5和吸水层6。
[0028]样品垫I用于接受来自全血、血浆或血清样品，其可由选自玻璃纤维素膜或者聚酯膜、棉纤的材料制成。样品垫I可以起到过滤样品中的颗粒性不溶物。因此，与市售的部分试纸条相比，采用单独样品垫I的设计有助于提高检测灵敏度。
[0029]第一结合垫2、第二结合垫3和第三结合垫4由玻璃纤维素膜或者聚酯膜制成。第一结合垫2上同时包被有两种不同粒径荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I第一抗体和生物素标记的识别不同表位的心肌肌钙蛋白第二抗体。第二结合垫2上包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌红蛋白第一抗体。第三结合垫3上包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌酸激酶同工酶第一抗体。将针对不同目标蛋白的抗体分别包被于不同的结合垫上，可以有效降低了抗体之间的相互影响，由此提高了检测的灵敏度。
[0030]在本实用新型的试纸条中，对心肌肌钙蛋白的检测采用双抗体夹心结合生物素-亲和素级联放大的方法进行检测，对肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的检测采用双抗体夹心的方法进行检测。在双抗体夹心法中，同时使用分别识别目标蛋白不同表位的两种抗体来特异性结合目标蛋白，由此提高了检测的灵敏性。
[0031]进一步，小粒径荧光微球标记的抗体使得检测的线性范围可覆盖高值区域，大粒径荧光微球标记的抗体有利于低值的检测以达到灵敏度的要求。在一个实施方式中，所述两种不同粒径焚光微球的粒径范围均在50nm至500nm之间，优选10nm至400nm之间，更优选10nm至300nm之间，最优选分别为10nm和300nm。因此，本实用新型的试剂条可同时满足心肌肌钙蛋白1、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶测定对高灵敏度和宽检测线性范围的要求。
[0032]包被膜5包被有相间隔的三条检测线和一条质控线。三条检测线8、9和10(参见图2)依次固定有亲和素、识别不同表位的肌红蛋白第二抗体及识别不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗体。质控线11固定有抗鼠IgG的抗体。
[0033]检测线8、9和10之间的距离可以在0.1cm至0.6cm之间。在一个实施方式中，检测线8、9和10之间的距离在0.2cm至0.5cm之间，优选在0.2cm至0.4cm之间。检测线10和质控线11之间的距离可以在0.05cm至0.8cm之间。在一个实施方式中，检测线10和质控线11之间的距离在0.1cm至0.6cm之间，优选在0.3cm至0.5cm之间。质控线11用于确定反应体系是否成立，并通过计算检测线8、9和10与质控线11的荧光信号值以精确进行定量。
[0034]吸水层6用于提供检测所需的毛细作用力，其可由选自由棉绒、玻纤的材料制成，优选由棉绒制成。
[0035]需要说明，图1的各个层之间的搭接方式，例如一层逐渐高于一层或高低变化的搭接方式仅是示例性说明，诸如采用其它高低变化等搭接方式同样在本实用新型要求保护的试纸条的范围内。
[0036]试纸条的整体长度在8cm至12cm之间，整体宽度在0.2cm至0.5cm之间，优选在0.2cm至0.3cm之间，最优选为0.3cm。本实用新型的试纸条在提供灵敏度和检测线性范围的同时，通过降低试纸条的长度和/或宽度可降低抗体的用量，大大节约了生产成本。
[0037]图2是本实用新型所述一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条的俯视示意图。对图2中与图1相同的内容不再赘述。
[0038]以下将结合实施例来进一步说明本实用新型。
[0039]实施例
[0040]下述实施例中，所述心肌肌钙蛋白I第一抗体、心肌肌钙蛋白I第二抗体、肌红蛋白第一抗体、肌红蛋白第二抗体、肌酸激酶同工酶第一抗体、肌酸激酶同工酶第二抗体、抗鼠IgG抗体、荧光微球、亲和素、生物素、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、N，N' - 二环己基碳二亚胺(DCC)、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纤维素膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜、高强度吸水纸均为市售产品。
[0041]所述一种定量检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检荧光层析试纸条的制备方法为:
[0042]I)样品垫的制备
[0043]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入样品垫处理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3_5小时。
[0044]2)第一结合垫的制备
[0045]A、第一结合垫的预处理
[0046]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合垫处理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3_5小时。
[0047]B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
[0048]将心肌肌钙蛋白I第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。
[0049]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤小粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的心肌肌钙蛋白I第一抗体，使心肌肌钙蛋白I第一抗体与荧光微球的质量比为1: 8至1: 60，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0050]使用0.05M，pH4.5-5.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤大粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的心肌肌钙蛋白I第一抗体，使心肌肌钙蛋白I第一抗体与荧光微球的质量比为1: 20至1: 80，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0051]将上述标记心肌肌钙蛋白I第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1: 10到10: I的比例进行混匀，即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
[0052]C、生物素化抗体的制备
[0053]将心肌肌钙蛋白I第二抗体以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为5mg/ml-10mg/ml。
[0054]生物素的预活化:准确称取300mg生物素溶解于8ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，室温条件下加入183mg的N-轻基琥泊酰亚胺(NHS)，304mg的N，N' - 二环己基碳二亚胺(DCC)及0.1ml的吡啶，将反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去反应产生的尿素，滤液浓缩后通过硅胶柱色谱纯化，在异丙醇中重结晶得到的白色固体即为预活化的生物素。
[0055]用二甲基甲酰胺(DMF)溶解预活化的生物素，使其终浓度为0.05M，并加入到透析过的心肌肌钙蛋白I第二抗体中，使得心肌肌钙蛋白I第二抗体与生物素的摩尔比为I: 10-1: 25，室温反应I小时，以0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4°C透析过夜。
[0056]D、第一结合垫的制备
[0057]将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球与步骤C制备获得的生物素化抗体充分混勾，使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勾喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0058]3)第二结合垫的制备
[0059]A、第二结合垫的预处理
[0060]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合垫处理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3_5小时。
[0061]B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
[0062]将肌红蛋白第一抗体以0.1Μ，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为 2mg/ml-5mg/ml。
[0063]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤小粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的肌红蛋白第一抗体，使肌红蛋白第一抗体与荧光微球的质量比为1: 8至I: 60，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0064]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤大粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的肌红蛋白第一抗体，使肌红蛋白第一抗体与荧光微球的质量比为1: 20至I: 80，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0065]将上述标记肌红蛋白第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1: 10到10: I的比例进行混匀，即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
[0066]C、第二结合垫的制备
[0067]将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球混合物使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0068]4)第三结合垫的制备
[0069]A、第三结合垫的预处理
[0070]将玻璃纤维素膜或者聚酯膜放入结合垫处理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)中浸泡处理3_5小时后，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干3_5小时。
[0071 ] B、标记抗体的两种不同粒径荧光微球的制备
[0072]将肌酸激酶同工酶第一抗体以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液4°C透析过夜，调整浓度为2mg/ml-5mg/ml。
[0073]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤小粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的肌酸激酶同工酶第一抗体，使肌酸激酶同工酶第一抗体与荧光微球的质量比为1: 8至1: 60，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0074]使用0.05M，pH4.5-5.0的2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤大粒径荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的肌酸激酶同工酶第一抗体，使肌酸激酶同工酶第一抗体与荧光微球的质量比为1: 20至1: 80，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤荧光微球，用含有1% BSA和0.1% Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0075]将上述标记第一抗体的两种不同粒径的荧光微球按1: 10到10: I的比例进行混匀，即制备出标记抗体的两种不同粒径荧光微球。
[0076]C、第三结合垫的制备
[0077]将上述步骤B制备获得的标记抗体的两种不同粒径荧光微球混合物使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均匀喷涂于上述步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0078]5)包被膜的制备
[0079]A、检测线(用于cTnl检测)的制备:使用包被液(含有0.1_10 %海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到lmg/ml-5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0080]B、检测线(用于Myo检测)的制备:将肌红蛋白第二抗体以0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液4 °C透析过夜，使用包被液(含有0.1-10 %海藻糖的0.01-0.02Μ，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将透析后的肌红蛋白第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ Ι/cm均勾喷涂于硝酸纤维素膜上，于35_39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0081]C、检测线(用于CK-MB检测)的制备:将肌酸激酶同工酶第二抗体以0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液4 °C透析过夜，使用包被液(含有0.1-10 %海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将透析后的肌酸激酶同工酶第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0082]D、质控线的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以
0.8 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0083]E、包被膜的制备:用封闭液(含有1-10% BSA和1_10 %海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜封闭1_2小时，取出后置35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。
[0084]6)试纸条的组装
[0085]在湿度小于30%，温度20_30°C条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫、包被膜及吸水纸。在包被膜粘覆底板时，检测线的位置靠近结合垫，质控线的位置靠近吸水纸。吸水纸为高强度吸水纸。组装好后裁剪成试纸条。
【权利要求】
1.一种心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶联检试纸条，其特征在于，所述试纸条包括: 1)用于接受来自全血、血浆或血清样品的样品垫； 2)同时包被有两种不同粒径荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I第一抗体和生物素标记的识别不同表位的心肌肌钙蛋白第二抗体的第一结合垫； 3)包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌红蛋白第一抗体的第二结合垫； 4)包被有两种不同粒径荧光微球标记的肌酸激酶同工酶第一抗体的第三结合垫； 5)包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被膜，其中所述三条检测线依次固定有亲和素、识别不同表位的肌红蛋白第二抗体及识别不同表位的肌酸激酶同工酶第二抗体，所述质控线固定有抗鼠IgG的抗体； 6)用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸；和 7)底板，其中所述底板上依次搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫、包被膜和吸水纸。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述两种不同粒径荧光微球的粒径范围均在50nm至500nm之间。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述第一结合垫、第二结合垫、第三结合垫材质为玻璃纤维素膜或者聚酯膜。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述包被膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
【文档编号】G01N33/573GK204228719SQ201420674056
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】戈军, 宋芳, 朱世伟, 王义娜, 岳洋, 李鼎锋, 刘勇 申请人:江苏达骏生物科技有限公司