专利名称：：抗蚜虫基因ppa及其制备以及利用其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明属于新基因的制备，特别是指抗财虫基因,A及其制备以及利用其编码的蛋白。
背景技术：
：虫害是造成农业减产的重要原因之一，全球每年因管理和利用化学杀虫剂防治费用高达ioo亿美元。即使如此，每年虫害导致损失占农作物总产量的20%-30%。与化学药剂相比，利用抗虫基因资源开展作物抗虫遗传育种是最经济有效和安全的措施，但是传统育种方法培育抗虫品种技术难度大、周期长，很难获得突破性的进展。转基因抗虫植物的出现为防治植物病虫害开拓了新的思路，利用^抗虫转基因的植物取得了显著的成果，但是使用A基因抗源单一，且这类基因不能有效防治某些刺吸式害虫如財虫等害虫，尤其是这些重要的农业昆虫还是植物病毒的传播介体，因此筛选新的抗虫基因尤其是抗蚜虫的基因具有重要的意义。目前已开发的众多抗虫基因资源中，唯有植物凝集素能有效控制蚜虫。植物凝集素是一类能可逆和糖结合的蛋白质，可凝集人和动物的红细胞，具有多种活性功能，如抗虫、抗病毒、抗真菌等，但其最重要的功能还是体现为对蚜虫的抗性。植物凝集素是目前所知的唯一可以识别并结合昆虫肠胃及真菌、细菌等微生物表面的糖缀合物的植物蛋白，在植物中广泛存在，按氨基酸序列同源性和进化相关性分类为7个不同的植物凝集素家族，主要有豆科凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、几丁质结合凝集素、2型核糖体失活蛋白、木菠萝(jacalin)家族、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素等。人工饲喂试验及转凝集素基因植株的抗虫分析均表明，植物凝集素能显著抑制多种同翅目害虫(如蚜虫、褐飞虱等)的生存和繁殖。研究表明植物凝集素的抗虫活性与其特异性结合糖类的能力有关，能与同翅目昆虫消化道上皮细胞的糖蛋白结合，降低了昆虫消化道膜的通透性，影响营养物质的正常吸收。此外，凝集素还能在昆虫消化道内诱发病灶，促使消化道内细菌繁殖，使昆虫感病、拒食，生长发育受抑制，甚至死亡。1998年KeyanZhu-Salzman使用定点突变技术，使豆科凝集素GSII丧失了糖结合能力，发现该凝集素同时也丧失了抗虫活性。由此可见，凝集素的抗虫活性与其能与糖类可逆性结合的能力密切相关。大多数凝集素的特异结合活性通常不是针对植物细胞内的糖分子，而常常是微生物或害虫的内表面的寡糖，在结合糖的过程中，植物凝集素表面局部结构的构象会有所变化，这种变化有利于识别不同的糖而结合不同的外来糖缀合物，发挥其防御功能。目前成功用于植物抗病虫基因工程的植物凝集素主要有菜豆凝集素(尸力"eo/M^//^r/sagglutinin,PHA)、豌豆外源凝集素(Pealectin,P-lec)、雪花莲凝集素基因(^7犯""s"/rahagglutinin,GNA)、麦胚凝集素(Wheatgermagglutinin,WGA)等。研究最多、应用最广、抗虫活性较好的为石蒜科植物凝集素GNA,是由4个单体非共价结合形成的同源四聚体，每个单体含有3个相同的甘露糖结合位点(QNDY),属于单子叶植物甘露糖结合凝集素。单子叶植物甘露糖结合凝集素蛋白通常有2~4个11-14KD相同亚基组成二聚体或四聚体，每个亚基包含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点。在石蒜科、百合科、凤梨科、天南星科、兰科、葱属等植物中广泛存在。植物中几乎不含有甘露糖，但是甘露糖却是病毒、细菌和真菌表面以及低等动物胃肠上皮细胞的糖缀合物的非常普遍的成分，甘露糖结合凝集素在植物抵抗病原微生物和食植无脊推动物中起着重要作用。研究表明GNA对褐飞虱、贿虫等同翅目害虫具有较强的抗性。在人工饲料中加入0.1%(w/v)的GNA蛋白，用于饲喂褐飞虱，连续饲喂五天后，90%的虫体死亡，表明GNA对褐飞虱有很强的抗性。转GNA基因植株对桃蚜、水稻褐飞虱、棉蚜、麦长管蚜等害虫表现明显的抗性。到目前为止，虽然已发现了众多有抗虫活性的凝集素基因，然而对蚜虫等同翅目昆虫的抗性仍不尽如人意。尽管凝集素对蚜虫等同翅目害虫有抑制作用，但是现有的凝集素只能在一定程度上抑制害虫的发育，并不能完全抑制其发育和繁殖，害虫在转凝集素的植株上仍能以较低速度进行繁殖，因此，如何进一步提高凝集素的抗虫活性成为摆在人们面前的严峻事实。要解决这6一问题，一方面有必要深入研究凝集素的作用机制，从而制订相应策略提高抗虫效果；另一方面应着手新的抗虫基因的发掘，为获得高抗甚至具有致死效应的凝集素基因用于抗虫基因工程研究中。
发明内容本发明的目的在于提供一种抗蚜虫基因户^。本发明的第二个目的在于提供一种抗蚜虫基因月^的制备。本发明的第三个目的在于提供一种利用抗蚜虫基因PPA编码的蛋白。本发明的整体技术构思是抗蚜虫基因PPA,其序列如下atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggcctcgtcattcctcgggcagccgcggcagtgggcaccaaccacctgctgtccggcgaaaccctggacaccaacggccatctcaggaacagcgacttcgacttgatcatgcaggaagactgcaacgccgtcctgtacaatggcaactggcagtccgacacggccaacaaaggacgggactgcaagctcaccctcaccgaccgcggcgagctcgtcatcaaaaatggagacagatccatcgtctttaggagcggctcccagtccgacgtgaggggcaactacgccttggtcgtcc"ccggaggggaggctggtcatctacggcccatccgtgttcaagatcaacccttgggtccccggccgccacagcctgcggcagctcggcaacatccctgtcaccgacaacatgctcttctccggccaggtcctctacggcgacggcaagctcagggcgaggaaccacatgctcgtgatgcagggcgactgcaacctggttctgtacggcggcaagtacggctggcagtccaacacccacggcaacggcgagaactgcttcgtgaggctgagccacaagggcgagctcatcatcaaggacgacgacttccagaccatctggagcagccgatccggttccaagcagggtgactacgtcttcatcctccaggaggacggctttgccgtcatctacggccccgccatctgggccaccagctcgaagcgcccaattgccgcgtag。抗蚜虫基因户A的制备，以5'端TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC和3'端CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT为特异引物，以掌叶半夏cDNA为模板，釆用PCR扩增方法获得。抗蚜虫基因^"编码的蛋白，其序列如下MetAlaSerLysLeuLeuLeuPheLeuLeuProAlalieLeuGlyLeuVallieProArgAlaAlaAlaAlaValGlyThrAsnHisLeuLeuSerGlyGluThrEeuAspThrAsnGlyHisLeuArgAsnSerAspPheAspLeulieMetGinGluAspCysAsnAlaValLeuTyrAsnGlyAsnTrpGinSerAspThrAlaAsnLysGiyArgAspCysLysLeuThrLeuThrAsp人rgGlyGluLeuVallieLysAsnGlyAspArgSerlieValPheArgSerGlySerGinSerAspValArgGlyAsnTyrAlaLeuValValHisProGluGlyArgLeuVallieTyrGlyProSerValPheLyslieAsnProTrpValProGlyArgHisSerLeuArgGinLeuGlyAsnlieProValThrAspAsnMetLeuPheSerGlyGinValLeuTyrGlyAspGlyLysLeuArgAlaArgAsnHisMetLeuValMetGinGlyAspCysAsnLeuValLeuTyrGlyGlyLysTyrGlyTrpGinSerAsnThrHisGlyAsnGlyGluAsnCysPheValArgLeuSerHisLysGlyGluLeulielieLysAspAspAspPheGinThrlieTrpSerSerArgSerGlySerLysGinGlyAspTyrValPhelieLeuGinGluAspGlyPheAlaVallieTyrGlyProAlalieTrpAlaThrSerSerLysArgProlieAlaAla。本发明的制备方法中的具体工艺过程及反应条件还有所述的制备方法包括A、,A基因的3'RACE扩增；B、尸州基因5'RACE扩增；C、户A基因全序列扩增和克隆。步骤A是选用TaKaRa公司提供的3'RACE试剂盒，并按照其说明书进行；常规的RNA提取方法提取出掌叶半夏的叶片和块茎的总RNA,等量混合后用于随后的cDNA合成；具体方法如下根据国际基因库("e/7勘i)上的天南星科植物单子叶凝集素基因序列进行序列比对和分析，根据保守序列MQEDCNL设计合成了上游兼并引物5'-TTYATCATGCARGAAGACTG-3'，下游引物为OligO(dT18)。以提取的总RNA为模板，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链；取l吣cDNA进行常规PCR扩增，以cDNA为模板进行了2轮PCR扩增，第一次反应程序及条件为温度94。C、时间3分钟，温度94。C、时间30秒，温8度45t:、时间30秒，温度72。C、时间1分钟，35个循环；温度72'C、时间10分钟，4'C保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，退火温度提高至50。C,PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连接酶连接到质粒pGEM-T载体上，并转化大肠杆菌DH5ot,然后涂布到具有氨节青霉素的LB平板上，37X:过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得PPA基因的3端部分基因序列。步骤B是选用TaKaRa公司提供的5'RACE试剂盒，并按照其说明书进行；根据步骤A中3'RACE的测序结果，设计合成两个下游引物，PPA1:5-CAAGGCGTAGTTGCCCCTCAC-3,PPA2:5-GACGATGGATCTGTCTCCATT-3,用随机引物为上游引物，进行5端RACE扩增，以提取的总RNA为模板，以PPA1引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链；随后进行两轮PCR扩增，反应程序及反应条件为第一轮PCR反应用PPA1和随机引物进行扩增，温度94t:、时间3分钟，温度94。C、时间30秒，温度37。C、时间30秒，温度72。C、时间1分钟，35个循环；温度72。C、时间10min,犷C保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，以PPA2和随机引物进行扩增，扩增条件同第一轮PCR反应；PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物按上述说明的方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得PPA基因的5端基因序列。步骤C根据5'RACE和3'RACE的测序结果进行序列拼接，设计合成一对特异的引物，扩增全长的户/^基因，5'端PPAF:TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC,3'端引物PPAR:CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT;以PPAR引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链。随后釆用高保真的Taq酶进行PCR扩增，反应程序及条件为温度94。C、时间3分钟，温度94'C、时间30秒，温度57。C、时间30秒，温度72。C、时间l分钟，35个循环；温度72。C、时间IO分钟；PCR产物跑l"/。的琼脂糖电泳观察结果PCR产物按上述方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得全长的PPA基因序列。高保真的Taq酶为TaKaRa公司PrimeSTARHSDNAPolymerase产品。本发明根据RACE技术获得了^A基因的全长序列，将5端的P/^基因片段和3端的/V^基因片段拼接，然后按根据基因序列设计合成含有全长的,A基因的引物。采用RT-PCR技术经过常规克隆测序方法获得了全长的乃。^基因序列，序列全长如前述。本发明中的,A基因所编码的蛋白在N端有一个24个氨基酸的信号肽，信号肽位点位于"和V25之间，和天南星科的其他植物凝集素AHA、AMA很相似，切除信号肽后成为具有杀虫活性的成熟蛋白，如图IO、图12所示。该凝集素包含3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点(红色字体，如图12所示)，说明克隆的基因属于单子叶植物甘露糖结合凝集素基因。该基因与国际基因库上收录的异叶天南星(^r/^e鹏力We/7^力W/咖，AY338965)氨基酸序列的同源性分别为98.8%,而与报道的掌叶半夏凝集素(PPACK:AY451853)的氨基酸序列同源性只有85.5%。序列比对表明，天南星科植物凝集素基因的5'端序列比较保守，而3'端序列差异很大(如表1所示)。本发明根据报道的天南星科植物凝集素基因序列，设计同源兼并引物，釆用RACE技术克隆出了掌叶半夏凝集素AM基因，序列的结构和分析表明，其具有单子叶植物甘露糖结合凝集素基因的结构特征，包含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点，并有4个相同亚基组成，与国际基因库上收录的掌叶半夏凝集素基因(收录号AY451853)的同源性较低，氨基酸序列同源性在85.5%。对该基因进行了功能验证，转基因烟草接种蚜虫后表明该基因具有良好的抗虫性，尤其是与以往报道的凝集素基因不同的是，该基因具有杀死蚜虫的效应，有的植株接种后7天后蚜虫全部死亡，这是本发明的根本所在。所克隆的戶^基因为利用基因工程技术防治蚜虫、褐飞虱等重要的同翅目昆虫、有效减少农药和杀虫剂的污染提供了基因资源，具有极其重要的经济价值和生态意义。本发明与现有技术相比，所具有的实质性特点和显著技术进步在于1、，通过RACE和RT-PCR技术结合获得了一个全长的掌叶半夏凝集素尸^基因序列，其编码氨基酸组成的理论分子量为28,464Da的蛋白，在凝集素尸/M10的N端有一个24个氨基酸的信号肽，信号肽位点位于"和V25之间，该基因与以往的报道的天南星科植物凝集素基因序列具有一定的差异，证明该基因是一个新的凝集素基因。2、对该基因在植物中的拷贝数和不同组织中的表达进行了分析，Southernblot结果表明乃^基因为多拷贝数，说明植物凝集素基因是一个十分复杂的多基因家族，这为筛选获得不同的凝集素基因奠定了基础。Northern杂交该基因在组织中属于组成型表达，但是在不同组织中表达强度不同，表达的强弱依次为块茎、叶片、花序和茎段，^A基因在块茎中的表达最为强，在叶片、花序和茎段上的表达甚少。3、对新基因进行功能验证，构建了户A基因的植物表达载体pBI121-PPA,将户A基因整合到烟草植物基因组中并在mRNA水平上得到表达。转,A基因烟草接种蚜虫后表明，与以往报道的同类研究不同的是，该基因不仅表现了良好的抑制效果，而且具有杀死蚜虫的效应，有的植株接种7天后蚜虫全部死亡。这是本发明根本所在，即获得了具有杀死蚜虫效果的凝集素基因。4、本发明突破了以往植物凝集素基因只对蚜虫等同翅目昆虫具有一定的抑制效应的结果，表现了强烈的致死蚜虫的作用。利用本发明获得了全长的尸^基因及其构建的植物表达载体，可为进一步转化到重要作物棉花、小麦和水稻中培育抗同翅目昆虫的转基因植株奠定基础，可以大大减少农作物农药的使用量，达到保护环境的效果，具有极大的经济效益和应用价值。图l,A基因全长检测结果。表明扩增出现一条约780bp的特异带，含有全长的,A基因片段。M为DNAMarker,分子量从大到小依次为2000，1000,750，500,250，100bp;1为PPA基因扩增产物；2为5'RACE扩增产物大小；3为空白对照。图2天南星科植物凝集素基因的氨基酸序列同源性比较结果。表明该基因在氨基酸序列上与天南星科已经报道的基因不同，是一个新的凝集素基因。注国际基因库上的植物凝集素基因及其登录号^^:AY338965;J"为华南星/MW歴)AY557617;海芋C^/oc^/s鹏crorr力/zo》DQ340864;/TJ:AY191305,PPACK:AY451853。图3户A基因在植物基因组中的Southernblot分析结果。利用不同的限制性内切酶对基因组酶切后杂交表明乃^基因在植物基因组中的为多拷贝数。图中1、2、3泳道分别表示EcoRI、HindIII和BamHI酶切掌叶半夏基因组DNA后杂交的结果。图4尸尸力基因在植物不同组织中的Northernblot分析结果。,A基因在不同组织部位中，在块茎中表达最强，在叶片、茎段和花序中表达甚少，其中泳道l为块茎，泳道2为叶片，泳道3为茎段，泳道4为花序。图5PA基因植物表达载体的构建。pBI121-PPA质粒酶切结果表明/^^基因已经插入到植物表达载体pBI121中。泳道1为入-^/zdIIIdigestDNAMarker:分子量大小依次为23130，9416，6557，4361，2322，2027，564,125bp;2和3为XbaI和SmaI双酶切质粒的pBI121-PPA的产物。4为DNAMarker:分子量从大到小依次为2000,1000,750,500，250，100bp。图6转,/^基因烟草的PCR检测。表明尸A基因已经整合到烟草基因组中。1为DMMarker:分子量从大到小依次为2000，1000,750,500,250,100bp;2为空白对照；3为阳性质粒扩增结果，4为非转基因烟草阴性对照；5-16为转基因烟草。图7转基因烟草的半定量RT-PCR检测结果。表明尸A基因在烟草中在mRNA水平上得到表达。1为DNAMarker:分子量从大到小依次为2000，1000，750,500,250，100bp;2为空白对照；3为阴性烟草；4-15为转基因烟草。图8不同的转基因烟草对蚜虫虫口密度增长的抑制效率和作用。结果表明7号转基因烟草在接种7天后蚜虫全部死亡，说明尸W基因具有致死效应。图97号转基因烟草接种蚜虫15天的表现。表明釾虫在转基因烟草中全部死亡。图10/^J基因编码的氨基酸序列。箭头显示信号肽切割位点，方框显示凝集素的保守的甘露糖专一结合位点QDNY。图11,/"基因全长的核苷酸序列。全长为777bp。图12户A基因全长核苷酸序列及其推测的氨基酸序列。显示信号肽位点和保守的甘露糖结合保守位点QDNY。具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本实施例中的抗蚜虫基因序列以及编码的蛋白序列如前述，其具体制备及抗蚜虫功能鉴定包括A、,W基因的3'RACE扩增；B、户/M基因5'RACE扩增；C、,A基因全序列扩增和克隆。步骤A是选用TaKaRa公司提供的3'RACE试剂盒，并按照其说明书进行；常规的RNA提取方法提取出掌叶半夏的叶片和块茎的总RNA，等量混合后用于随后的cDNA合成；具体方法如下根据国际基因库(上的天南星科植物单子叶凝集素基因序列进行序列比对和分析，根据保守序列MQEDCNL设计合成了上游兼并引物5'-HTATCATGCARGAAGACTG-3'，下游引物为OligO(dT18)。以提取的总RNA为模板，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链；取l一LcDNA进行常规PCR扩增，以cDNA为模板进行了2轮PCR扩增，第一次反应程序及条件为温度94。C、时间3分钟，温度94。C、时间30秒，温度45'C、时间30秒，温度72。C、时间1分钟，35个循环；温度72。C、时间10分钟，4匸保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，退火温度提高至5(TC，PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连接酶连接到质粒PGEM-T载体上，并转化大肠杆菌DH5a，然后涂布到具有氨苄青霉素的LB平板上，37'C过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得户^基因的3端部分基因序列。步骤B是选用TaKaRa公司提供的5'MCE试剂盒，并按照其说明书进行；根据步骤A中3'RACE的测序结果，设计合成两个下游引物，PPA1:5-CAAGGCGTAGTTGCCCCTCAC-3,PPA2:5-GACGATGGATCTGTCTCCATT-3，用随机引物为上游引物，进行5端RACE扩增，以提取的总RNA为模板，以PPA1引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链；随后进行两轮PCR扩增，反应程序及反应条件为第一轮PCR反应用PPA1和随机引物进行扩增，温度94。C、时间3分钟，温度94。C、时间30秒，温度37。C、时间30秒，温度72i:、时间l分钟，35个循环；温度72r、时间10min，4。C保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，以PPA2和随机引物进行扩增，扩增条件同第一轮PCR反应；PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物按上述方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得PA基因的5端基因序列。步骤C根据5'RACE和3'RACE的测序结果进行序列拼接，设计合成一对特异的引物，扩增全长的户/^基因，5'端PPAF:TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC，3'端引物PPAR:CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT;以PPAR引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链。随后釆用高保真的Taq酶进行PCR扩增，反应程序及条件为温度94。C、时间3分钟，温度94T、时间30秒，温度57'C、时间30秒，温度72。C、时间1分钟，35个循环；温度72匸、时间10分钟；PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物按上述的方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得全长的乃M基因序列。其编码氨基酸组成的理论分子量为28,464Da的蛋白，在PPA的N端有一个24个氨基酸的信号肽，信号肽位点位于"和V25之间，和天南星科植物凝集素如AHA、AMA等很相似(如图1,图IO、11或12所示)。高保真的Taq酶为TaKaRa公司PrimeSTARHSDNAPolymerase产品。利用DNAman分析软件将分离克隆的尸/M基因与fo"勘/A上的天南星科植物凝集素基因比对分析(如图2，表l所示)，分别为异叶天南星凝集素"r/^e鹏agglutnin，AHA):AY289926;华南星凝集素(^r/sae则/c^"咖agglutnin,ALA):AY557617;海芋凝集素"/oc<357a鹏crorr力/zc^14agglutnin，AMA):即40864;三叶半夏凝集素(PTA):AY191305;疆南星凝集素"層露〃/"咖agglutnin,arum):U12198;雪花莲凝集素基因(犯Mmagglutnin,GNA1):AF413087;GNA4:M55556。结果表明我们获得,^基因与以往的报道的天南星科植物凝集素基因序列具有一定的差异(如表l,图2所示)，证明该基因是一个新的凝集素基因。表l户^基因与天南星科植物凝集素基因的氨基酸序列同源性比较(％)名称細細詹#刑細100.084.2細79.083.7j層70.371.368.382.980.278.570.8刑98.884.480.070.884.085.280.879.672.790.285.5(1)尸/w基因在植物的拷贝数及其不同组织中表达提取掌叶半夏植物基因组DNA,对尸W基因在基因组中的拷贝数进行了鉴定，Southernblot结果表明A^基因为多拷贝数(图3)。分别提取了掌叶半夏的块根、叶片、茎段和花序的植物总RNA，进行Northern杂交考察该基因在不同组织中的转录情况，结果表明，该基因在组织中属于组成型表达，但是在不同组织中表达强度不同，表达的强弱依次为块茎、叶片、花序和茎段，PA基因在块茎中的表达最为强，在茎段上的表达甚少(如图4所示)。说明尸^基因在不同组织表达存在差异，和以前报道的天南星科植物凝集素基因的表达相似。(2)尸A基因功能验证/^^基因植物表达载体的构建及转化釆用常规植物双元表达载体，优选植物双元表达载体pBI121(植物转基因中常用表达载体，在本发明中购自中国农业科学院作物研究所赵开军研究15员)和菌株EHA105，利用克隆测序的尸^基因序列，通过XbaI和SmaI双酶切后将尸"基因亚克隆到PBI121的相应位点上，构建成35S:,/W+6^5！NOS结构的植物表达载体pBI121-PPA,转化到农杆菌菌株EHA105中。按照王关林等的方法采用叶盘法转化烟草获得抗卡那霉素(";^n)标记的转化再生植株(王关林等，2002)。通过l。/。的琼脂糖电泳经XbaI和SmaI双酶切质粒的pBI121-PPA(如图5所示)，酶切产生两条片段，表明,A基因以正确的阅读框架插入到pBI121中。常规叶盘法转化烟草获得了抗抗卡那霉素(/^,11)标记的转基因烟草植株。①转基因植株PCR检测剪取转基因植株和非转基因植株的幼嫩叶片，釆用CTAB法提取基因组DNA,在室温干燥后用适量无菌双重蒸馏水悬浮，-2(TC保存。提取的DNA模板量调整为50ng/吣，取化L做模板进行PCR扩增，94"、3min;94°C、30S,57°C、30S,72°C、lmin,35个循环；72°C、10min。PCR产物跑l。/。的琼脂糖电泳观察结果。结果表明获得了/^J基因整合到烟草植物基因组的转基因植株(如图6所示)。②转基因植株的半定量RT-PCR检测以烟草幼嫩叶片为试验材料，按照Promega公司的TrizolRNA提取试剂盒说明书对用PCR检测的阳性植株提取总RNA，进行半定量RT-PCR，验证转外源？A基因在RNA转录水平上是否表达。参照马恢等的方法利用双重RT-PCR技术进行内标NADH基因和PPA基因的双重RT-PCR检测(马恢等，2007)。随机选用IO个转基因单株进行检测，结果表明户A基因在mRNA水平上得到表达，但是不同的转基因植株在体内表达水平不一样(如图7所示)。③转基因植株的抗蚜虫鉴定桃蚜(#/^^/7ew/we)采自河北省农林科学院植保所温室内烟草上自然发生的种群，于温室内饲养稳定一段时间后，选取健康活泼、生理状态一致的无翅成蚜供试。将室内饲养的桃蚜分别接种到810叶龄的转基因烟草和非转基因烟草植株中层叶片上，随机选取10个转基因植株株系，每株系3株烟苗，每株苗接无翅成蚜20头，置于同一条件下(23~25°C)饲养，隔日调查记载各处理烟苗上蚜虫数量，直至15天。按照袁正强等的方法以转基因烟草对蚜虫的种群抑制率作为指标(袁正强等，2001),来评价各转基因烟草对树虫的毒力效果种群抑制率(％)=(对照株活蚜数-处理区活蚜数)/对照株活財数x100。结果表明，从接虫后第15天结果来看，IO个转基因烟草对烟姆的种群抑制力由大到小为7、1、3、5、9、8、2、6、4、10(如表2,图8所示)；其中7号和1号对烟枒的种群抑制率最高分别达到了100%和92.02%，3号植株的抑制率也较高为78.85%,5号的抑制率也分别为58.84%，其余的转基因植株并不表现抗性，这可能与转基因沉默导致转基因不表达引起的。尤其是7号转基因植株在接种7天后烟蚜全部死亡，表现了致死效应，这是以往的同类研究中所没有报道的，以往的报道都是表现出抑制效应，而不是致死效应，这是本发明的所在(如表2，图9所示)。表2不同处理时间IO种转基因烟草对烟枒的种群抑率差异<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>权利要求1、抗蚜虫基因PPA，其特征在于其序列如下atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggcctcgtcattcctcgggcagccgcggcagtgggcaccaaccacctgctgtccggcgaaaccctggacaccaacggccatctcaggaacagcgacttcgacttgatcatgcaggaagactgcaacgccgtcctgtacaatggcaactggcagtccgacacggccaacaaaggacgggactgcaagctcaccctcaccgaccgcggcgagctcgtcatcaaaaatggagacagatccatcgtctttaggagcggctcccagtccgacgtgaggggcaactacgccttggtcgtccatccggaggggaggctggtcatctacggcccatccgtgttcaagatcaacccttgggtccccggccgccacagcctgcggcagctcggcaacatccctgtcaccgacaacatgctcttctccggccaggtcctctacggcgacggcaagctcagggcgaggaaccacatgctcgtgatgcagggcgactgcaacctggttctgtacggcggcaagtacggctggcagtccaacacccacggcaacggcgagaactgcttcgtgaggctgagccacaagggcgagctcatcatcaaggacgacgacttccagaccatctggagcagccgatccggttccaagcagggtgactacgtcttcatcctccaggaggacggctttgccgtcatctacggccccgccatctgggccaccagctcgaagcgcccaattgccgcgtag。2、根据权利要求1所述的抗蚜虫基因的制备，其特征在于以5'端TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC和3'端CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT为特异引物，以掌叶半夏cDNA为模板，釆用PCR扩增方法获得。3、根据权利要求2所述的抗蚜虫基因尸A的制备，其特征在于所述的制备方法包括A、尸/M基因的3'RACE扩增；B、尸/M基因5'RACE扩增；C、PW基因全序列扩增和克隆。4、根据权利要求3所述的抗蚜虫基因尸A的制备，其特征在于所述的步骤A是选用TaKaRa公司提供的3'RACE试剂盒，并按照其说明书进行；采用Promega公司的Trizol试剂盒从掌叶半夏的叶片和块茎中提取出总MA,等量混合后用于随后的cDNA合成；具体方法如下根据国际基因库(GenBank)上的天南星科植物单子叶凝集素基因序列进行序列比对和分析，根据保守序列MQEDCNL设计合成了上游兼并引物5'-HTATCATGCARGAAGACTG-3'，下游引物为OligO(dT18)。以提取的总RNA为模板，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链；取lpLcDNA进行常规PCR扩增，以cDNA为模板进行了2轮PCR扩增，第一次反应程序及条件为温度94t:、时间3分钟，温度9厂C、时间30秒，温度45。C、时间30秒，温度72'C、时间l分钟，35个循环；温度72"C、时间10分钟，4C保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，退火温度提高至50°C，PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连接酶连接到质粒pGEM-T载体上，并转化大肠杆菌DH5a,然后涂布到具有氨苄青霉素的LB平板上，37'C过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得PPA基因的3端部分基因序列。5、根据权利要求4所述的抗蚜虫基因户A的制备，其特征在于所述的步骤B是选用TaKaRa公司提供的5'RACE试剂盒，并按照其说明书进行；根据步骤A中3'RACE的测序结果，设计合成两个下游引物，PPA1:5-CAAGGCGTAGTTGCCCCTCAC-3,PPA2:5-GACGATGGATCTGTCTCCATT-3，用随机引物为上游引物，进行5端RACE扩增，以提取的总RNA为模板，以PPA1引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成c薩A第一链；随后进行两轮PCR扩增，反应程序及反应条件为第一轮PCR反应用PPA1和随机引物进行扩增，温度94。C、时间3分钟，温度94。C、时间30秒，温度37。C、时间30秒，温度72。C、时间l分钟，35个循环；温度72。C、时间10min，4。C保存；第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板，以PPA2和随机引物进行扩增，扩增条件同第一轮PCR反应；PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物按上述方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得PPA基因的5端基因序列。6、根据权利要求3、4或5所述的抗蚜虫基因的制备，其特征在于所述的步骤C根据5'RACE和3'RACE的测序结果进行序列拼接，设计合成一对特异的引物，扩增全长的PPA基因，5'端PPAF:TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC，3'端引物PPAR:CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT;以PPAR引物为互补引物，按照M-MLV试剂说明书合成cDNA第一链。随后釆用高保真的Taq酶进行PCR扩增，反应程序及条件为温度94'C、时间3分钟，温度94'C、时间30秒，温度57。C、时间30秒，温度72。C、时间l分钟，35个循环；温度72。C、时间10分钟；PCR产物跑1%的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物按上述方法克隆到质粒pGEM-T载体上，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得全长的PPA基因序列。7、根据权利要求6所述的抗財虫基因,/^的制备，其特征在于所述的高保真的Taq酶为TaKaRa公司PrimeSTARHSDMPolymerase产品。8、利用权利要求l所述的抗蚜虫基因？A编码的蛋白，其特征在于其序列如下MetAlaSerLysLeuLeuLeuPheLeuLeuProAlalieLeuGlyLeuVallieProArgAlaAlaAlaAlaValGlyThrAsnHisLeuLeuSerGlyGluThrLeuAspThrAsnGlyHisLeuArgAsnSerAspPheAspLeulieMetGinGluAspCysAsnAlaValLeu丁yrAsnGlyAsnTrpGinSerAspThrAlaAsnLysGlyArgAspCysLysIxuThrLeuThrAspArgGlyGluLeuVallieLysAsnGlyAspArgSerlieValPheArgSerGlySerGinSerAspValArgGlyAsnTyrAlaLeuValValHisProGluGlyArgLeuVallieTyrGlyProSerValPheLyslieAsnProTrpValProGlyArgHisSerLeuArgGinLeuGlyAsnlieProValThrAspAsnMetLeuPheSerGlyGinValLeuTyrGlyAspGlyLysJLeuArgAlaArgAsnHisMetLeuValMetGinGlyAspCysAsnLeuValLeuTyrGlyGlyLysTyrGlyTrpGinSerAsnThrHisGlyAsnGlyGluAsnCysPheValArgLeuSerHisLysGlyGluLeulielieLysAspAspAspPheGinThrlieTrpSerSerArgSerGlySerLysGinGlyAspTyrValPhelieLeuGinGluAspGlyPheAlaVallieTyrGlyProAlalieTrpAlaThrSerSerLysArgProlieAlaAla。全文摘要本发明属于新基因的制备，特别是指抗蚜虫基因PPA及其制备以及利用其编码的蛋白。包括以5′端TCTAGAATGGCCTCCAAGCTCCTCCTC和3′端CCCGGGCTACGCGGCAATTGGGCGCTT为特异引物，以掌叶半夏cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得对抗蚜虫基因PPA，并应用其编码了对蚜虫具有致死功能的蛋白。本发明解决了目前具有抗虫活性的凝集素基因不能完全抑制其发育和繁殖的问题，具有对蚜虫致死作用的效果，利用本发明获得了全长的PPA基因及其构建的植物表达载体，可为进一步转化到重要作物棉花、小麦和水稻中培育抗同翅目昆虫的转基因植株奠定基础，可大大减少农药的用量，达到环保的效果，具有极大的经济效益和应用价值。文档编号C12P19/34GK101497885SQ20091007381公开日2009年8月5日申请日期2009年2月24日优先权日2009年2月24日发明者铭刘,吴志明,周巧梅,温春秀,王玉海,伟田,董文琦,谢晓亮,陈劲枫申请人:河北省农林科学院经济作物研究所