专利名称：：一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达系统。
背景技术：
：微生物所产生的分子H2是通过氢化酶将微生物体内代谢产生的H+与电子结合释放到体外。^nfilf+2eH2自从1931年St印henson和Stickland第一次在大肠杆菌中发现了氢化酶，越来越多的研究关注于此。特别是最近2030年，随着矿产能源的不断枯竭和价格飚升，生物制氢技术以其清洁环保、可持续性和对传统能源的可替代性又再度掀起热潮，氢化酶作为代谢氢的关键酶也再度成为关注热点。氢化酶(Hydrogenase'Hpse)是氢代谢中的关键酶，根据氢化酶中金属离子组成可将其分为3种Ni-Fe氢化酶、Fe氢化酶和不含金属离子的氢化酶。它作为氢代谢的末端酶可逆性催化分子氢氧化，在微生物能量和产氢代谢中起着重要的作用。目前可用于生物工程的氢化酶基因资源较少，而且都存在异源表达缺陷，所以实际工业化生产中需要对氢化酶基因进行密码子偏爱性改造，导致技术要求高、生产成本提升。
发明内容本发明为了解决目前可用于生物工程的氢化酶基因资源少、都存在异源表达缺陷，需要进行密码子偏爱性改造，技术要求、生产成本高的问题；而提供了一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达系统，为实现大规模高效生物产氢提供了物质基础。本发明铁氢化酶基因序列如SEQIDN0:1所示。本发明的铁氢化酶基因开放阅读框全长为1743bp，其中A、C、G、T分别为344(19.74%)、518(29.72%)、570(32.70%)、311(17.84%)。起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。本发明铁氢化酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明铁氢化酶基因编码的氨基酸有580个氨基酸残基，分子量为63.19KD，理论等电点pl为5.33，理论疏水性为-0.157。铁氢化酶基因异源表达系统按以下步骤构建—、提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(EthanoligenensharbinenseYUAN-3)基因组总DNA;二、以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板进行PCR扩增，正向引物为hydA-HEF:5'-CGGGAGGTCTGACATATGGTAAACGTGA-3'，反向引物为hydA-HER:5'-GGTGTGTCCGTTTTGGAATTCTTTTTTCGCGG-3';PCR反应条件95"C预变性5min，然后35个循环的降落PCR，95t:变性35s、退火温度由6『C开始、每个循环退火温度降低0.rC、每个循环退火35s、72。C延伸90s，最后72。C延伸10rfiin;三、步骤二扩增得到的片段用NdeI和EcoRI双酶切，酶切体系为50iU由45iU10XHBuffer、2ii1限制性内切酶NdeI、2iU限制性内切酶EcoRI、30iUPCR扩增产物和余量的ddH20组成，37t:恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；四、原核表达载体pET28a用NdeI和EcoRI双酶切，酶切体系为50iU由5iU10XHBuffer、2iU限制性内切酶Nde工、2iU限制性内切酶EcoR工、30iU原核表达载体pET28a和余量的ddH20组成，37。C恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；五、将步骤三酶切的插入DNA片段与步骤四酶切的载体片段用T4DNA连接酶连接，酶连体系为20iU由2iU10XBuffer、1iilT4DNA连接酶、1yl载体片段、5yl插入DNA片段和余量的ddH20组成，16t:过夜连接；六、将步骤五获得的连接产物42t:热击转化入E.ColiDH5a感受态细胞，然后在含有卡那霉素的LB筛选平板上进行筛选，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定阳性重组子；七、抽提阳性重组子重组质粒42t:热击转化入E.ColiBL21感受态细胞，经菌落PCR鉴定，重组子为pET28a-hydA，即获得铁氢化酶基因异源表达系统。本发明铁氢化酶基因无需基因改造可直接与原核表达载体pET28a构建异源表达系统，含重组子pET28a-hydA的E.coliBL21菌液经IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)诱导6小时后，抽提蛋白经SDS-PAGE电泳检测获得目标蛋白条带，并使用Western-Blot方法鉴定条带确实为目标外源蛋白(分子量约为63KD)，然后对诱导后抽提的蛋白进行收集纯化，再经复性后采用还原甲基紫晶检测释放氢气的方法对该氢化酶蛋白进行活性分析，明显检测得到^产生。不能释放氢气的大肠杆菌E.coliBL21当被转入重组子后，37t:震荡培养24小时加入IPTG诱导后可明显检测到H2产生；并经检测确定本发明铁氢化酶活性为515iiMH2/iigprotein,证明本发明铁氢化酶基因异源表达成功。图1是具体实施方式二中铁氢化酶蛋白质三级结构预测模拟图。图2是具体实施方式二中铁氢化酶蛋白质三级结构预测模拟图。图3是具体实施方式三中原核表达载体pET28a的结构图谱。图4是具体实施方式三中原核表达载体pET28a的克隆表达区结构图。图5是具体实施方式三中铁氢化酶重组蛋白在不同诱导时间下的SDS-PAGE电泳图，图5中"M"泳道标样为Marker,"1"泳道标样为未经诱导的菌体蛋白，"2"泳道标样为经1小时诱导的菌体蛋白，"3"泳道标样为经2小时诱导的菌体蛋白，"4"泳道标样为经3小时诱导的菌体蛋白，"5"泳道标样为经4小时诱导的菌体蛋白，"6"泳道标样为经5小时诱导的菌体蛋白，"7"泳道标样为经6小时诱导的菌体蛋白。图6是具体实施方式三中铁氢化酶Western-blot电泳图。图7是具体实施方式三中对铁氢化酶超量表达蛋白纯化图，图6中"1"泳道标样为纯化后的蛋白，"2"泳道标样为空白，"3"泳道标样为蛋白分子量Marker，"4"泳道标样为空白，"5"泳道标样为诱导5小时的菌体蛋白，"6"泳道标样为未经诱导的菌体蛋白。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式铁氢化酶基因序列如下5ATGGTAAACGTGACGATCAACGGCACCCCCGTGCAGGCGGGCGAAGACACCACCATTCTGGAAGCGGCGGCTTCGGCGGGCATTCATATCCCCACGCTCTGCTACCTGAAGGGCCTCAATGAGATCGGCGCCTGCCGGGTTTGCCTGGTGGAGATTGAGGGCATTGAGAAGTTGGTGACGGCCTGCGGCAACAAGGTGGCGGAAGGCATGGTCATTTCCACCAACAGCCCGCGCGTGCGCGAGGCACGGCGCACCAATGTGGAGCTCATCCTCTCGCAGCACGACTGTTATTGCGCCAGTTGCGCGCGCAGCGGCAACTGCAACCTTCAGTCGCTTTCCAACGACCTCGGTATTCTCGATCTGCCCTACCGGCGGGAAATGCCGGTCTCTGAATGGAACAAGTCGTTTCCGCTCATCCGCGATTTTTCCAAGTGCATCAAGTGCATGCGTTGCGTGCAGGTTTGTGACAAGATCCAGGATATGAACATCTGGGACATTGCCAACACCGGCTCGCGCACCACGGTGGACGTGTCGCAGAACCGCAAAATGGAGGAATCGGACTGTACGCTCTGCGGCCAGTGCATCACGCACTGCCCGGTGGGCGCGCTGCGCGAGCGGGACGACACCGACAAGGCGTTTGCCGCGCTGGCCGATCCGGATACGATCACCGTGGTGCAGATCGCGCCCGCCGTGCGCGCCGCGTGGGGCGAATCACTTGGTCTGCCGCGGGAGCAGGCGACCGCCAAACGGCTGGTGGCCGCGCTGCGCAAGATCGGGTTCCGTTATATCTTCGACACTACGTTCAGCGCCGATCTCACCATCATGGAGGAGGGAAGTGAGTTCCTCGCAAAGCTCCGGAACCGGGAAAACGAAACGTTCCCCATGTTCACTTCCTGCTGTCCCGGTTGGGTGCGCTTTCTGAAATCGCAGTATCCGGACATGGTGCGCCAGCTTTCCACTGCGAAATCACCGCAGCAGATGTTCGGCGCCATCACGAAAAGCTATTATGCCAAGCTGTTGGATGTGGAGCCGGAACGCATCTGCTCCATTTCCGTCATGCCGTGCCTGGCTAAAAAACAGGAAGCCGCCTTGCCCACCATGGACACAGCGGGAGCGGGGCCGGATGTGGACATCGTGCTCACGACGCGGGAGATCGACCGCATGATCCGCGCGGAGGATATCCACCCGGGGGAGCTGCCGGAGGAGGAGTTCGACCAGCCGCTTGGCGTGGGCAGCGGCGCGGGCGTGATTTTCGGCGCCACGGGCGGCGTGATGGAAGCGGCCCTGCGCTCGGCCTACTATCTGGTCACCGGAAAAAATCCGGAGCCCGACGCGTTTGGAAACGTGCGGGGAATGGACGGCTGGAAGGAAGCGGCCATCGACATCGCGGGCACCACGGTGCGTGTAGCGGTGGCCAGTGGTCTGGGCAACGCCCGTCGGCTGGTGGAAGCCTTGCGCAAAGGCGATGTGCAGTACGATTTCGTGGAGATCATGGCCTGCCCCGGCGGCTGCTCAGGCGGCGGGGGGCAGCCCATCGCCGAGGGCGAGGAGCGGGCGGGCGTCCGCGCGGAGACCCTCTACGGGCTGGATAATATCAGCGCGCTGCGGTTTTCACATGAAAACCCGTCCATCGTGCAGGTGTACCGTGACTATCTGGACAAACCGCTCTCGCATCGCGCACATGAGCTGCTCCATACGGCGCATGACGCCTGGGAAATGCCCGGCGCCGCCGCGAAAAAATAA。本实施方式铁氢化酶基因按以下步骤获得1、铁氢化酶基因的克隆(1)提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(EthanoligenensharbinenseYUAN-3)的基因组总DNA:取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(EthanoligenensharbinenseYUAN-3)菌液5mL，用上海华舜生物工程有限公司生产的华舜小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取Ethanolige體sharbinenseYUAN-3基因组总DNA;(2)铁氢化酶基因保守区域PCR扩增用氢化酶兼并引物hydFl和hydR进行PCR扩增，正向引物为hydFl:5，-GCCGACCTKACMATMATGGA-3'，反向引物为hydRl:5'-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT_3，；PCR扩增反应中退火温度为5055t:，扩增循环数为3035;PCR扩增的反应体系如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)PCR产物的克隆PCR产物用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式小量胶回收试剂盒进行回收，回收产物与pMD19-T克隆载体在16t:连接过夜，连接体系为10ill:pMD19-T载体lii1(50ng)、PCR纯化产物2ii1(100200ng)、SolutionI5ii1、加ddH20至10ii1;连接产物转化入E.ColiDH5a感受态细胞中，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性重组子；其中A、采用CaCl2法制备E.ColiDH5a感受态细胞:l)E.ColiDH5a在LB平板上划线培养16h，挑取单菌落接入LB液体培养基中，37t:震荡过夜培养；2)取过夜活化的E.ColiDH5a菌液lml置于100ml新鲜的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D6。。值约为0.3;3)将菌液分装于两个预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min;4)4。C、4000r/min、离心10min，弃上清；5)加入10ml冰冷的0.1MCaCl2，重悬菌液，冰浴30min;6)4。C、4000r/min、离心10min，弃上清；7)加入2ml冰冷的0.1MCaCl2，重悬菌液；B、热击法转化E.ColiDH5a感受态细胞1)取200iU感受态细胞，置于冰上，加入lOiU连接产物，轻轻旋转混匀内容物；2)冰浴30min;3)42t:水浴中热击90s，勿摇动；4)冰浴3min;5)加入无抗生素的LB液体培养基补足lml，混匀，37°C200250r/min摇床振荡培养3小时；6)取100ill菌液涂布在加有50mg/LAmp、20y1IPTG禾P40X-gal的LB培养基上；7)待菌液被培养基吸收后，倒置平板37t:培养过夜；C、阳性重组子的筛选及鉴定1)蓝白斑反应筛选阳性重组子根据a-互补反应原理，在加有X_gal和IPTG的筛选培养基上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落，蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落，因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子；2)阳性重组子的菌落PCR鉴定挑取白斑菌落，利用通用引物RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')和M13-47(5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')进行PCR，PCR条件为95。C预变性10min，94。C变性30s、55。C退火30s、72。C延伸90s，共35个循环；72。C延伸10min，4t:保存；进行O.8%琼脂糖凝胶电泳，若电泳显示出与目标DNA(700bp)大小的条带，则证明质粒重组正确，是阳性重组子。本实施方式中采用的pMD19-T是一种常用的克隆载体，大小为2692bp，具有Amp抗性基因，带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息，此编码区插入了多克隆位点，若无外源基因插入，载体会与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补，即a互补，产生有完整活性的e-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，则破坏了其读码框，产生无a互补能力的肽段，因此，在加有X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌，蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。[OOSS](4)DNA序列测定与分析阳性重组子选用Jinsite金思特科技(南京)有限公司自动序列分析仪进行序列测定，序列同源性比较在http:〃www.ncbi.nlm.gov网站上用BLAST程序进行；(5)克隆铁氢化酶基因部分片段两侧序列CassettePCR的引物设计采用TaKaRaLAPCRinvitroCloningKit试剂盒克隆铁氢化酶基因片段两侧序列；以已经克隆得到的基因片段序列为基础，设计与试剂盒中Cassett印rimerCI和CassetteprimerC2引物分别匹配的上游引物hydA-FSl、hydA_FS2和下游引物hydA-RSl、hydA-RS2具体序列见表2:表2扩增铁氢化酶基因部分片段两侧序列的CassettePCR引物8引物名称引物序列CassetteprimerCl5，-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3，CassetteprimerC25，-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3，hydA-FS15，-TCCATTTCCGTCATGCCGTGCCTGGCTAAA-3，hydA-FS25，-AAAGCTATTATGCCAAGCTGTTGGATGTGGA-3，hydA-RSI5，-GCTTCCTTCCAGCCGTCCATTCCCCGCAC-3，hydA-RS25，-GATCTCCACGAAATCGTACTGCACATCGCCTTT-3，采用CassettePCR原理设计引物，由于Cassette的5'末端没有磷酸基，所以TargetDNA的3'末端和Cassette的5'末端的连接部位形成缺口；在第一次PCR反应的第一个循环时，从PrimerCI开始的延伸反应在连接部位终止，限制了PrimerCl和PrimerCI同一引物之间的扩增，从而控制了非特异性PCR扩增；只有从PrimerFSl或PrimerRSI开始延伸合成的DNA链才能成为PrimerCl的模板，进行DNA的特异性扩增反应；再用内侧Primer(PrimerC2，PrimerFS2或RS2)进行第二次PCR反应。本实施方式可高效特异性地扩增目的DNA。(6)克隆铁氢化酶基因部分片段两侧序列的CassettePCR扩增具体过程如下铁氢化酶下游序列的扩增选用EcoRI限制性内切酶酶切YUAN-3基因组DNA，酶切后的基因组DNA和EcoRI接头16。C连接3h;铁氢化酶上游序列的扩增选用PstI酶切YUAN-3基因组DNA，酶切后的基因组DNA与PstI接头于16。C连接3h;CassettePCR反应体系和反应条件如下A、DNA的限制酶酶切反应反应体系见表3。表3基因组DNA5tigEcoRI限制酶■10X限制酶Buffer5u1灭菌蒸馏水upto50ti1B、连接反应①按照下列组分配置连接反应液(表4)表49EcoRI酶切基因组DNA片段5u1EcoRICassette接头2.5u1LigationSolutionI15u1LigationSolutionII7.5u1②16。C反应3h;③反应结束后，进行乙醇沉淀回收DNA;溶解于51的灭菌蒸馏水中；C、PCR扩增①将(6)B-DNA溶液1y1加入到33.5灭菌蒸馏水中，94"加热10分钟；②按下列组分配制第一次(1st)PCR反应液(表5)。表5C-①的DNA溶液34.5ii1lOXLAPCRBufferll(Mg2+plus)5ii1TaKaRaUVT叫0.5ii1d證Mixture8ii1PrimerCl1ii1PrimerFSl或RSI1ii1③按以下条件进行1stPCR反应94°C30s，55。C2min，72。Clmin，共30个循环；④用灭菌水将(6)B-③的PCR反应液稀释(稀释110000倍)，再取1Pi进行(第二次)2ndPCR反应，2ndPCR反应液组分如表6:表6B-④的IstPCR反应稀释液1ii1lOXLAPCRBufferll(Mg2+plus)5ii1TaKaRaUVT叫0.5ii1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>⑤按以下条件进行2ndPCR反应94°C30s，55。C2min，72。Clmin，共30个循环；⑥反应结束后，取PCR反应液(5lOiU)进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收可以得到扩增到得PCR片段。本实施方式步骤(6)用铁氢化酶基因序列中不含有的限制性内切酶，而TaKaRaLAPCRinvitroCloningKit试剂盒中有该酶接头的限制性内切酶进行酶切。(7)铁氢化酶基因全长的PCR扩增、克隆和测序根据已经拼接的序列设计了全长验证引物hydA-F(5'-TCAAAGGCGGGAGGTCTGAAAGATGGTAAACGT-3')、hydA-R(5'-CGGTGTGTCCGTTTTGTATTTATTTTTTCGCG-3')，以EthanoligenensharbinenseYUAN-3基因组总DNA为模板扩增全长铁氢化酶基因，PCR反应体系为94°C5min，94。C30s、63。C30s(每个循环退火温度降落0.2°C)、72°C90sec，共35个循环，72"C延伸10min。本实施方式中所用到的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethano1igenensharbinenseYUAN-3)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1152;并且在我国2005年6月8日公开的发明专利(发明者付娜,任南琪,张璐,赵鑫,邢德峰申请人:哈尔滨工业大学