经扩增gnd基因发酵制备L－氨基酸的方法

专利名称：经扩增gnd基因发酵制备L－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，在所述棒状细菌中至少gnd基因是扩增的。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
发明目的本发明目的是提供新的用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸的改良方法。
本发明提供了用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，在该棒状细菌中编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC1.1.1.44)(gnd基因)的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
使用的菌株优选在gnd基因扩增之前已生产L-氨基酸。
优选的实施方案见于权利要求书。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体，如生产L-苏氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21649黄色短杆菌BB69黄色短杆菌DSM5399乳发酵短杆菌FERM-BP 269
乳发酵短杆菌TBB-10以及，如生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14309谷氨酸棒杆菌ATCC14310谷氨酸棒杆菌ATCC14311谷氨酸棒杆菌ATCC15168产氨棒杆菌ATCC6871以及，如生产L-色氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21850谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)以及，如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳发酵短杆菌FERM-P 1712谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P6464谷氨酸棒杆菌DSM5715谷氨酸棒杆菌DSM58-1谷氨酸棒杆菌DSM12866是棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌合适菌株的实例。
已发现在编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC1.1.1.44)的gnd基因过表达之后，棒杆菌以改良方式生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-色氨酸。
编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，其催化6-磷酸葡糖酸氧化脱羧为5-磷酸核酮糖。gnd基因的核苷酸序列揭示于JP-A-9-224662。本发明首次应用了在提及的参考文献中阐述的gnd基因。得自遗传密码简并或由于中性功能的有义突变导致的gnd基因的等位基因也可使用。
为获得扩增(如过表达)，例如可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增加表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改善表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998))，及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，6-磷酸葡糖酸脱氢酶借助于质粒被过表达。为此使用


图1所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。在将gnd基因掺入pEC-T18mob2的EcoRI切割位点之后，形成图2所示的质粒pECgnd。
能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体如pEKExl(Eikmarms等，基因10293-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同样方式使用。
另外，除编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，添补反应，戊糖磷酸途径或氨基酸输出的一或多种酶的过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。
因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被同时扩增尤其是过表达以生产L-苏氨酸·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2，63-72(1988))，或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144915-927(1998))，·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)·编码苏氨酸输出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)·zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)·编码烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被同时扩增尤其是过表达以生产L-赖氨酸·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遗传学224317-324)，·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)，·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)，·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)，·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·zwa1基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)，·编码烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
除扩增gnd基因之外，同时弱化选自以下一组的一或多个基因对L-氨基酸的生产也可以是有益的·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除过表达6-磷酸葡糖酸脱氢酶之外，消除非所需的副反应对L-氨基酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或非连续地通过分批法，补料分批法或重复补料发批法培养，以生产L-氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)所述反向HPLC进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)大肠杆菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏号DSM13244。
本发明包括以下附图
图1质粒pEC-T18mob2图。
图2质粒pECgnd图。
图3质粒pBGNA图。
图4质粒pCR2.1poxBint图。
碱基对数目是根据再现性获得的大约值。
图中所采用的缩写有如下含义
图1Tet四环素抗性基因oriV大肠杆菌的质粒编码的复制源点RP4mob转移质粒的mob区域rep来自谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点perpGA1的控制拷贝数的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)图2Tet四环素抗性基因rep来自谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点perpGA1的控制拷贝数的基因lacZ来自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆残存片段gnd6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因图3lacP大肠杆菌乳糖操纵子的启动子CMV巨细胞病毒的启动子ColE1质粒ColE1的复制源点TkpolyA聚腺苷酸化位点Kan r卡那霉素抗性基因SV40ori猴病毒40的复制源点gnd6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因图4ColE1 ori质粒ColE1的复制源点lacZlacZα基因片段的克隆残存片段fl ori噬菌体fl的复制源点KmR卡那霉素抗性
ApR氨苄青霉素抗性poxBintpoxB基因的内部片段另外，使用以下缩写AccI限制酶AccI的酶切位点BamHI限制酶BamHI的酶切位点EcoRI限制酶EcoRI的酶切位点HindIII限制酶HindIII的酶切位点KpnI限制酶KpnI的酶切位点PstI限制酶PstI的酶切位点PvuI限制酶PvuI的酶切位点SalI限制酶SalI的酶切位点SacI限制酶SacI的酶切位点SmaI限制酶SmaI的酶切位点SphI限制酶SphI的酶切位点XbaI限制酶XabI的酶切位点XhoI限制酶XhoI的酶切位点估计所得PCR产物的大小大约为252bp。
最佳PCR条件确定如下35次循环94℃ 1分钟55℃ 1分钟72℃ 30秒2.5-3.5mM MgCl2100-150ng AS019基因组DNA对所得PCR产物进行测序分析证实此产物是gnd基因的内部部分。用通用的正向和反向引物，和Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7测序试剂盒测序。PCR产物的序列示于SEQ ID NO1。2.克隆根据ёZap ExpressTM系统方案筛选AS019ёZap ExpressTM文库(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，Califomia 92037)。然后对分离的克隆进行Southem印迹分析。如Schleicher和Schuell方法手册所述，将NytranTM(“Nytran，修饰的尼龙-66滤膜”(1987年3月)，Schleicher和Schuell，Dassbl，德国)作为膜进行DNA的Southern转移。将使用上述相同引物和最佳PCR条件产生的双链DNA片段，用Amersham生命科学公司的MultiprimeTMDNA标记试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)，根据说明书用α-32p-dCTP放射标记。预杂交，杂交和冲洗条件如Schleicher和Schuell方法手册所述。根据Sambrook等所述方法，用AgFa Curix RPIL胶片进行放射自显影。由此鉴别一些gnd克隆。从称为pBGNA(图3)的一个克隆分离质粒DNA，并选择其进行进一步分析。3.测序通过Sanger等的Sanger双脱氧链终止法(美国科学院院报74，5463-5467(1977))，对pBGNA中克隆的插入体进行测序。用PharmaciaBiotech公司的T7测序试剂盒和α-32P-dCTP(St.Albans，Herts，UK)进行此方法。根据Pharmacia克隆和测序指导手册(“T7SequencingTM试剂盒”，ref.XY-010-00-19，Pharmacia Biotech，1994)，将样品在TBE缓冲液中于6％聚丙烯酰胺/尿素凝胶上，以恒定的50mA进行电泳3-8小时。用自内部gnd PCR产物的已知序列(SEQ ID NO1)设计的内部引物测序，以推导全部gnd基因序列。
内部引物的序列如下内部引物15’GGT GGA TGC TGA AAC CG 3’内部引物25’GCT GCA TGC CTG CTG CG 3’内部引物35’TTG TTG CTT ACG CAC AG 3’内部引物45’TCG TAG GAC TTT GCT GG 3’所得的序列在苹果麦金托什机计算上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究161829-1836)进行分析。这一程序可以进行限制性位点使用、开放读框分析和密码子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，253389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之间进行查询。DNA和蛋白质序列比较使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO2所示。核苷酸序列分析揭示一1377个碱基对的开放读框，命名为gnd基因，其编码一个459个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO3所示。实施例3穿梭载体pEC-T18mob2的制备根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。
此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的四环素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文库，登记号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，关于定量生物学的冷泉港讨论会43，77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子及多克隆位点(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1784-791)的mob区域。
将此构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿，美国)。通过将转化混合物铺板于补加5mg/l四环素的LB平板(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及随后经琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。
此质粒称为pEC-T18mob2并示于
图1。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德国)，保藏号DSM 13244。实施例4大肠杆菌-谷氨酸穿梭载体pEC-T18mob2中gnd基因的克隆用pBGNA作模板，经PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌的全长gnd基因和两侧上游和下游区域的DNA片段。用设计自SEQ ID NO2的寡核苷酸引物进行PCR反应。所用引物是gnd正向引物5’ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3’gnd反向引物5’CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3’PCR参数如下35次循环 95℃ 6分钟94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 45秒1mM MgCl2大约150-200ng pBGNA-DNA作模板。
将所得PCR产物克隆入购自Promega公司的pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360，Promega UK，Southampton)中，用大肠杆菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33103-119(1985))作宿主。全长gnd基因随后分离自pGEM-T载体的EcoRI片段，并克隆入大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2的lacZ EcoRI位点(
图1)，并称之为pECgnd(图2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德国)进行的限制酶分析显示pEC-T18mob2的lacZα基因中gnd基因的正确方向(即在lac启动子下游)。实施例5制备具有扩增的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的氨基酸生产菌株通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123343-347(1994))，将实施例3的质粒pECgnd电穿孔入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399和DSM5714中。DSM5399菌株是生产苏氨酸的菌株，见于EP-B-0358940所述。DSM5714菌株是生产赖氨酸的菌株，见于EP-B-0435132所述。将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上选择转化体，所用LB琼脂已补加25mg/l卡那霉素。以此方式形成菌株DSM5399/pECgnd和DSM5714/pECgnd。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是脑心浸液(Merck，Darmstadt，德国)。向此培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM-苏氨酸用作主培养物。
培养基MM-苏氨酸CSL5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/l
MgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定苏氨酸生成量。
实验结果示于表1。
表1
实施例7制备赖氨酸将实施例5中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5714/pECgnd，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.05。培养基MM用作主培养物。
培养基MMCSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表2。
实施例8制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒文库如Tauch等(1995，质粒33168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报842160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，将细菌置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。实施例9poxB基因的分离与测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离单个菌落的粘粒DNA(实施例8)，并用限制性内切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AJ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报745463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(291)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。
所得原始序列数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进-步分析。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，对该核苷酸序列的分析显示一1737碱基对的开放读框，其被称为poxB基因，poxB基因编码579个氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。实施例10制备整合载体以整合诱变poxB基因从菌株ATCC13032中，通过Eikmanns等所述方法(微生物学1401817-1828(1994))分离染色体DNA。基于从实施例9中已知的谷氨酸棒杆菌的poxB基因序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应poxBint15’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’poxBint25’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’所示引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，通过Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法指导和应用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离大约0.9kb的DNA片段，其携带poxB基因的内部片段，并如SEQ ID NO6所示。
将扩增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，美国；Catalogue Number K4500-01)，连接在载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技术9657-663)中。然后将连接混合物电穿孔入大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国，1985)。将转化混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞，所用LB琼脂已补加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。此质粒称为pCR2.1poxBint(图4)。
质粒pCR2.1poxBint以大肠杆菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德国)，保藏号DSM13114。实施例11在赖氨酸生产菌DSM5715中整合诱变poxB基因将实施例10中所述的载体pCR2.1poxBint，通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123343-347(1994))，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pCR2.1poxBint在DSM5715中不能独立复制，并只有已整合入DSM5715的染色体中时，才在细胞中保留。通过将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB琼脂已补加15mg/l卡那霉素。为检测整合情况，将poxBint片段用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒，通过Boehringer Mannheim GmbH的“进行滤膜杂交的DIG系统使用指导”(Mannheim，德国，1993)进行标记。潜在整合子的染色体DNA是通过Eikmanns等的方法(微生物学1401817-1828(1994))分离的，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并在68℃用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒杂交。实施例9中所述的质粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色体中的染色体poxB基因内。此菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint。实施例12过表达gnd基因同时消除poxB基因对赖氨酸制备的作用12.1制备菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd通过Libel等所述电穿孔方法(FEMS微生物学通信，53299-303(1989))，将菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用质粒pECgnd转化。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/lBacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/lNaCl，和18g/lBacto-琼脂，并补加5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃温育2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，用限制性内切酶AccI酶切，并通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测此质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd。12.2制备L-赖氨酸将实施例12.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素和25mg/l的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIIINaCl 2.5g/l
Bacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MMCSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 58g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表3。
表3
序列表<110>国立爱尔兰大学戈尔韦分校德古萨-于尔斯股份公司<120>用棒状细菌发酵制备L-氨基酸的方法<130>990229 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>252<212>DNA<2l3>谷氨酸棒杆菌<400>1atggtccaca acggcatcga gtacgccgac atgcaggtca tcggcgaggc ataccacctt 60ctgccctacg cagcaggcat gcagccagct gaaatcgctg aggttttcaa ggaatggaac 120gcaggcgacc tggattccta cctcatcgaa atcaccgcag aggttctctc ccaggtggat 180gctgaaaccg gcaagccact aatcgacgtc atcgttgacg ctgcaggtca gaagggcacc 240ggcaagtgga ct 252<210>2<211>2335<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(474)..(1850)<223>gnd<400>2ttgttcggcc acgatgacac cggagctcac agcagaaatg aagtcggtgt tgttgttgat 60gccgacgacc atttttccag gggcggaaat catgctggcg actgatccag tggattcggc 120gatggcggcg tagacaccac cgttgaccaa gcccaccact tgcaggtgct tggatgccac 180gtgaagttcg ctgaccaccc ggccgggctc gatggtggtg tagcgcagcc ccagattgcg 240gtcgaggcca taattggcgt tgttgagtgc ttcaagttcg tctgtggtta aagctctggt 300ggcggcaagt tctgcaagcg aaagcagatc ttggggttga tcatcgcggg aagtcataat 360taattactct agtcggccta aaatggttgg attttcacct cctgtgacct ggtaaaatcg 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1.一种通过发酵棒状细菌制备L-氨基酸的方法，包括进行以下步骤a)发酵产生所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少gnd基因是扩增的，b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及c)分离产生的L-氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中使用的细菌中，所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因也被扩增，尤其是过表达。
3.权利要求1的方法，其中使用制备L-苏氨酸，L-赖氨酸，L-异亮氨酸或L-色氨酸的棒状细菌。
4.权利要求3的方法，其中使用制备L-赖氨酸的的棒状细菌。
5.如权利要求2发酵制备L-赖氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-赖氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增、特别是过表达5.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，5.2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，5.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，5.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，5.5编码转酮酶的tkt基因，5.6编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，5.7编码赖氨酸输出的lysE基因，5.8zwal基因，5.9编码烯醇化酶的eno基因。
6.如权利要求2发酵制备L-苏氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-苏氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增、尤其是过表达6.1编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因，6.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，6.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.4编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因，6.5编码转酮酶的tkt基因6.6编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，6.7编码苏氨酸输出的thrE基因，6.8zwal基因，6.9编码烯醇化酶的eno基因。
7.权利要求2的方法，其中为制备L-氨基酸尤其L-赖氨酸或L-苏氨酸，发酵这样的细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因被同时弱化7.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，7.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，7.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.4zwa2基因。
8.权利要求2-6任一项的方法，其中为实现扩增，所述基因或核苷酸序列的拷贝数，通过用携带这些基因或核苷酸序列的质粒载体转化微生物而提高。
9.
图1所示的质粒载体pEC-T18mob2，其以在大肠杆菌K-12DH5α中的形式保藏，保藏号DSM 13244。
10.一种通过导入权利要求9的质粒载体而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属，所述载体另外还含有gnd基因。
全文摘要
本发明涉及一种通过发酵棒状细菌制备L－氨基酸的方法,包括进行以下步骤:a)发酵产生所需L－氨基酸的细菌,该细菌中至少gnd基因是扩增的,b)浓缩培养基或细菌细胞中的L－氨基酸,及c)分离产生的L－氨基酸。
文档编号C12P13/08GK1350586SQ00807548
公开日2002年5月22日 申请日期2000年7月5日 优先权日2000年3月20日
发明者L·K·杜尼肯(死亡), 阿什令·麦科麦克, 克里奥娜·斯特普尔顿, 凯文·伯克, 贝蒂娜·默克尔 申请人:德古萨股份公司, 国立爱尔兰大学