用扩增zwf基因制备L－氨基酸的方法

专利名称：用扩增zwf基因制备L－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用棒杆菌制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸的方法，其中至少zwf基因编码的间酶(Zwischenferment)蛋白被扩增。
现有技术L-氨基酸用于动物营养，用于人类医药及制药工业。
已知氨基酸是通过棒状细菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发酵而生产的。由于其极其重要，持续进行着改良生产方法的尝试。所述方法的改良可涉及发酵措施。如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的纯化方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法。以此方式可获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)、赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)有抗性的菌株，或者对于调节重要性代谢物是营养缺陷的并产生L-氨基酸例如苏氨酸或赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也已经用于生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株的改良。
发明目的本发明的目的是提供使用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸的新的改良方法。
发明概述L-氨基酸用于人类医药及制药工业、食品业，特别用于动物营养。因此需要提供制备氨基酸的新的改良方法。
本发明提供了使用棒状细菌制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的方法，所用棒状细菌中由zwf基因的核苷酸序列编码的间酶蛋白(Zwf蛋白)被扩增，尤其是过表达。
缩写词“zwf”是间酶的代号(Jeffrey H.MillerA Short Course InBacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1992)，也称作葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化为-6-磷酸葡糖酸内酯，伴随NADP还原为NADPH。其活性被NADPH及多种其它代谢物抑制(Sugimoto and Shiio，Agricultural and Biological Chemistry 51(1)，pp.101-108(1987))。
发明详述优选应用的菌株是在zwf基因扩增之前已经生产L-氨基酸的菌株。
优选的实施方案见权利要求书。
文中术语“扩增”描述了微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性的增加，例如通过增加所述一或多种基因的拷贝数、使用强力启动子或者使用编码具有高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因进行，任选组合这些措施。
通过扩增措施，特别是过表达，相应酶或蛋白质的活性基于野生型酶或蛋白质或者起始微生物中所述酶或蛋白质的活性或浓度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。
本发明提供的微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或者从甘油和乙醇中制备L-氨基酸。所述微生物是棒状细菌的代表物，特别是棒状杆菌(Corynebacterium)属。对于棒状杆菌属，特别可以提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
合适的棒状杆菌属菌株，特别是谷氨酸棒杆菌，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020，及从中制备的生产L-氨基酸的突变体，例如生产L-苏氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21649黄色短杆菌BB69黄色短杆菌DSM5399乳糖发酵短杆菌FERM-BP 269乳糖发酵短杆菌TBB-10，及例如生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 14309
谷氨酸棒杆菌ATCC 14310谷氨酸棒杆菌ATCC 14311谷氨酸棒杆菌ATCC 15168产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC 6871，及例如生产L-色氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21850谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)，及例如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464谷氨酸棒杆菌ATCC 13032谷氨酸棒杆菌DM58-1谷氨酸棒杆菌DSM12866。
已经发现棒状细菌在分别编码Zwf蛋白或Zwf多肽的zwf基因过表达之后以改良的方式生产L-氨基酸，特别是L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸。
JP-A-09224661揭示了黄色短杆菌MJ-223(FERM BP-1497)的zwf基因的核苷酸序列，并指出由zwf基因编码的蛋白质是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。JP-A-09224661揭示的序列信息示于SEQ ID NO7和8。JP-A-09224661描述了Zwf多肽的N末端氨基酸序列为Met Val Ile PheGly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu(SEQ ID NO8)。
然而，还不能证实确实如此。相反已经发现如下N末端氨基酸序列Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp(SEQ ID NO10)。包括编码序列在内的相应的zwf基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。N位的甲硫氨酸残基可以在翻译后修饰中被分裂，获得Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp的N末端氨基酸序列。
因此，本发明提供了如SEQ ID NO9的第538-2079位核苷酸示出的棒状细菌的新zwf基因的核苷酸序列。
可任选使用编码革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(Escherichiacoli)或其它革兰氏阳性细菌例如链霉菌属或芽孢杆菌属的Zwf蛋白的基因。
另外可以使用得自遗传密码简并或者中性功能的有义突变的zwf基因的等位基因。
优选使用内源基因，特别是来自棒状细菌的内源基因。“内源基因”或者“内源核苷酸序列”是指在一个种群中可获得的基因和核苷酸序列。
为了实现扩增(例如过表达)，可提高相应基因的拷贝数，或者可突变位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式起作用。也可以通过可诱导型启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增强表达。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养程序，也可获得被研究的基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的描述，Martin etal.(Bio/Technology 5，137-146(1987))，Guerrero et al.(Gene 138，35-41(1994))，Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))，Eikmanns et al.(Gene 102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS 0 472 869，美国专利4,601,893，Schwarzer and Puehler(Bio/Technology 9，84-87(1991)，Reinscheid et al.(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))，LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres et al.(Gene 134，15-24(1993))，日本特许公开说明书JP-A-10-229891，Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58，191-195(1998))，及已知的遗传学和分子生物学教科书。
例如，Zwf蛋白借助于质粒过表达。为此使用

图1所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。在将zwf基因掺入pEC-T18mob2的KpnI/SalI切割位点之后，形成图2所示质粒pEC-T18mob2zwf。
能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体例如pEKEx1(Eikmannset al.，Gene 10293-98(1991))或pZ8-1(EP-B-0 375 889)可以相同方式使用。
在本发明的另一方面中，发现SEQ ID NO10所示的zwf基因产物的氨基酸序列的第369和373位和/或第241和246位之间片段中的氨基酸置换能扩增其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，特别是其对NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原形式)抑制的抗性，及改良分别包含相应的zwf基因或zwf等位基因或者其编码的Zwf蛋白的棒状细菌的氨基酸尤其是赖氨酸的生产。N末端位置的甲硫氨酸残基可以在翻译后修饰期间通过宿主的甲硫氨酸氨肽酶除去。
因此，本发明提供了包含SEQ ID NO10氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸(proteinogenic aminoacid)置换。
因此，本发明进一步提供了编码包含SEQ ID NO10氨基酸序列的蛋白质的分离的多核苷酸，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
特别地，Zwf蛋白的氨基酸序列中的置换包含选自如下一组的至少一或多个氨基酸置换在SEQ ID NO10第370位的L-精氨酸由任何其它蛋白质氨基酸例如L-甲硫氨酸置换，在SEQ ID NO10第372位的L-缬氨酸由任何其它蛋白质氨基酸例如L-丙氨酸置换，在SEQID NO10第242位的L-甲硫氨酸由任何其它蛋白质氨基酸例如L-亮氨酸或L-丝氨酸置换，在SEQ ID NO10第243位的L-丙氨酸由任何其它蛋白质氨基酸例如L-苏氨酸置换，在SEQ ID NO10第244位的L-谷氨酸由任何其它蛋白质氨基酸置换，及在SEQ ID NO10第245位的L-天冬氨酸由任何其它蛋白质氨基酸例如L-丝氨酸置换。
极特别地，(SEQ ID NO10)第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸置换，如SEQ ID NO22所示。这个蛋白质也称作Zwf(A243T)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(A243T)。见SEQ ID NO21。
另外，(SEQ ID NO10)第370位的L-精氨酸可以由L-甲硫氨酸置换，如SEQ ID NO29所示。这个蛋白质也称作Zwf(R370M)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(R370M)。见SEQ ID NO28。
另外，(SEQ ID NO10)第372位的L-缬氨酸可以由L-丙氨酸置换，如SEQ ID NO31所示。这个蛋白质也称作Zwf(V372A)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(V372A)。见SEQ ID NO30。
另外，(SEQ ID NO10)第242位的L-甲硫氨酸可以由L-亮氨酸置换，如SEQ ID NO33所示。这个蛋白质也称作Zwf(M242L)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(M242L)。见SEQ ID NO32。
另外，(SEQ ID NO10)第242位的L-甲硫氨酸可以由L-丝氨酸置换，如SEQ ID NO35所示。这个蛋白质也称作Zwf(M242S)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(M242S)。见SEQ ID NO34。
另外，(SEQ ID NO10)第245位的L-天冬氨酸可以由L-丝氨酸置换，如SEQ ID NO37所示。这个蛋白质也称作Zwf(D245S)蛋白，编码所述蛋白质的等位基因称作zwf(D245S)。见SEQ ID NO36。
本发明的Zwf蛋白可进一步含有一或多个氨基酸的取代、缺失或插入，其基本不改变所述Zwf蛋白变体的酶学性质。
本领域已知对蛋白质功能具有中性或几乎中性作用的氨基酸取代是保守氨基酸置换。在芳香族氨基酸的情况中，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以彼此置换。在疏水性氨基酸的情况中，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸可以彼此置换。在极性氨基酸的情况中，谷氨酰胺和天冬酰胺可以彼此置换。在碱性氨基酸的情况中，精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以彼此置换。在酸性氨基酸的情况中，天冬氨酸和谷氨酸可以彼此置换。在含有羟基基团的氨基酸的情况中，丝氨酸和苏氨酸可彼此置换。
例如，在存在抑制剂NADPH时，酶活性改变小于大约2.5-3.5％或者2.5-4.5％可以认为是基本上无差异。在其它参数情况中，例如Michaelis常数(KM)或最大速率(Vmax)或者其它结合常数差异如小于大约5、10、25、50、100、150或200％或者甚至更大差异如300或400％可以认为是基本上无差异。
因此，Zwf(A243T)蛋白包含选自如下的至少一个氨基酸序列相应于SEQ ID NO22的第241-246位氨基酸的Thr Met Thr Glu Asp Ile序列，优选相应于SEQ ID NO22的第230-250位氨基酸的氨基酸序列，更优选相应于SEQ ID NO22的第225-260位氨基酸的氨基酸序列，更优选相应于SEQ ID NO22的第210-270位氨基酸的氨基酸序列。
相似地，Zwf蛋白变体Zwf(M242L)、Zwf(M242S)和Zwf(D245)包含选自如下的至少一个氨基酸序列SEQ ID No33、35和37的第237-250位氨基酸的氨基酸序列，优选SEQ ID No33、35和37的第227-260位氨基酸的氨基酸序列，更优选SEQ ID No33、35和37的第217-270位氨基酸的氨基酸序列，更优选SEQ ID No33、35和37的第202-285位氨基酸的氨基酸序列。
相似地，Zwf蛋白变体Zwf(R370M)和Zwf(V372A)包含选自如下的至少一个氨基酸序列SEQ ID No29和31的第365-377位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No29和31的第355-387位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No29和31的第345-397位氨基酸的氨基酸序列，及SEQ ID No29和31的第325-417位氨基酸的氨基酸序列。
另外，Zwf蛋白变体可包含选自如下氨基酸序列的N末端氨基酸序列相应于SEQ ID NO10的第1-10位氨基酸的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO10的第1-16位氨基酸的氨基酸序列，相应于SEQID NO10第1-20位氨基酸的氨基酸序列，及相应于SEQ ID NO10的第1-30位氨基酸的氨基酸序列。
另外，通过缺失和表达分析发现相应于一或多种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶蛋白的30个N末端氨基酸的核苷酸序列的缺失分别导致酶活性丧失。这30个N末端氨基酸相应于例如SEQ ID NO10或者SEQ IDNO22、29、31、33、35或37的第1-30位。
术语蛋白质氨基酸是指在微生物、植物、动物和人体天然发生的蛋白质中发现的那些氨基酸。这些氨基酸包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-硒代半胱氨酸。
第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸取代可优选通过将SEQ ID NO9第1264位的核碱基鸟嘌呤由腺嘌呤取代而实现。这种鸟嘌呤腺嘌呤转换也示于SEQ ID NO21的第1034位。SEQ ID NO9的第1264位和SEQ ID NO21的第1034位均相应于zwf基因和zwf(A243T)等位基因编码序列的第727位(在这种情况中起始密码子GTG的第一个G在第1位)。
zwf(A243T)等位基因的内部片段示于SEQ ID NO23。其相应于SEQ ID NO21的第898-1653位。
与野生型蛋白质相比，本发明这一方面的Zwf蛋白的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性对NADPH抑制作用较不易受影响或者有抗性。与在包含所述突变蛋白的菌株中在未加入NADPH时的活性相比，在暴露于大约260μM(μ表示微)浓度的NADPH时残余活性为至少30％或35％，优选至少40％、45％或50％。与在未加入NADPH时的活性相比，在暴露于大约400μM浓度的NADPH时残余活性为至少20％，优选至少25％。
诱导所述突变或等位基因的诱变可以通过针对细菌细胞的常规诱变方法进行，使用诱变剂例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍或者紫外光，如Manual of Methods for General Bacteriology(Gerhard et al.(Eds.)，American Society for Microbiology，Washington，DC，USA，1981)所述。然后分离适当的突变体并通过例如测序方法或者通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性进行鉴别。
因此，本发明提供了包含多核苷酸的分离的棒状细菌或突变体，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
谷氨酸棒杆菌DM658是这种棒状细菌的例子。其是在进行多次诱变、选择和筛选循环后获得的，在其染色体中含有编码具有SEQID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白(Zwf(A243T))的zwf等位基因(zwf(A243T))，其中在第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸取代，如SEQID NO22所示。
诱变也可以通过使用针对多核苷酸的体外方法进行，例如用羟胺处理(Molecular and General Genetics 145，101 pp.(1978))，或者用诱变寡核苷酸处理(T.A.BrownGentechnologie fuer Einsteiger，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或者用聚合酶链反应(PCR)处理，如Newton和Graham(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1994)所著手册或者通过Papworth等(Strategies 9(3)，3-4(1996))所述方法使用Stratagene(La Jolla，California，USA)的QuikChange定向诱变试剂盒进行，或者使用本领域已知的相似方法进行。
对相应的等位基因或突变进行测序并通过基因取代方法通过重组导入合适菌株的染色体中，如Schwarzer和Puehler(Bio/Technology9，84-87(1991)对于谷氨酸棒杆菌lysA基因所述的方法或者Peters-Wendisch等(Microbiology 144，915-927(1998))对于谷氨酸棒杆菌的pyc基因所述的方法进行。
因此，本发明提供了包含编码本发明Zwf蛋白的多核苷酸的重组棒状细菌，所述蛋白质例如包含SEQ ID NO10的氨基酸序列，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
谷氨酸棒杆菌DSM5715zwf2_A243T是这种菌株的例子。其染色体中包含菌株DM658的zwf等位基因突变，即zwf(A243T)。
谷氨酸棒杆菌菌株DM1697_zwfD245S是这种菌株的另一个例子。其染色体中包含通过体外诱变获得的zwf等位基因zwf(D245S)突变。
相应的等位基因也可以通过基因重复方法导入合适的菌株的染色体中，例如Reinscheid等(Applied and Environmental Microbiology60(1)，126-132(1994))对于hom-thrB操纵子所述方法，或者通过Jetten等(Applied Microbiology and Biotechnology 43，76-82(1995))对于ask基因所述方法进行。
因此，本发明进一步提供了包含分离的多核苷酸的棒状细菌，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
谷氨酸棒杆菌DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)是这种菌株的例子。其染色体中包含含有zwf(A243T)等位基因的分离的DNA。
等位基因也可以通过上述任何方法过表达，例如使用质粒、可诱导型启动子或者本领域已知的任何其它方法。
由此获得的菌株用于发酵生产氨基酸。因此，本发明还提供了使用本发明的棒状细菌生产L-氨基酸的方法。
另外，除了扩增本发明的zwf基因或等位基因之外，扩增特殊生物合成途径、糖酵解、添补反应、磷酸戊糖途径、糖摄取或者氨基酸输出的一或多种酶对于生产L-氨基酸是有益的。
因此，例如特别对于制备L-苏氨酸而言，选自如下的一或多个基因可以同时被扩增，特别是被过表达●hom基因，其编码高丝氨酸脱氢酶(Peoples et al.，MolecularMicrobiology 2，63-72(1988))，或者homdr等位基因，其编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶(Archer et al.，Gene 107，53-59(1991)，●gap基因，其编码甘油醛3-磷酸脱氢酶(Eikmanns et al.，Journal of Bacteriology 1746076-6086(1992))，●pyc基因，其编码丙酮酸羧化酶(Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144915-927(1998))，●mqo基因，其编码苹果酸醌氧化还原酶(Molenaar et al.，European Journal of Biochemistry 254，395-403(1998))，●tkt基因，其编码转羟乙醛酶(欧洲分子生物学实验室数据库(European Molecular Biologies Laboratories databank)(EMBL，Heidelberg，Germany)登录号AB023377)，●gnd基因，其编码-6-磷酸葡糖酸脱氢酶(JP-A-9-224662)，●thrE基因，其编码苏氨酸输出蛋白(DE 199 41 478.5；DSM12840)，●zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM 13115)，●eno基因，其编码烯醇化酶(DE199 41 478.5)。
因此，例如特别对于制备L-赖氨酸而言，选自如下的一或多个基因可以被同时扩增，特别是被过表达●dapA基因，其编码二氢吡啶二羧酸合酶(EP-B 0 197 335)，●lysC基因，其编码反馈抗性天冬氨酸激酶(Kalinowski et al.(1990)，Molecular and General Genetics 224317-324)，●gap基因，其编码甘油醛3-磷酸脱氢酶(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)，●pyc基因，其编码丙酮酸羧化酶(DE-A-198 31 609)，●tkt基因，其编码转羟乙醛酶(欧洲分子生物学实验室数据库(EMBL，Heidelberg，Germany)登录号AB023377)，
●gnd基因，其编码-6-磷酸葡糖酸脱氢酶(JP-A-9-224662)，●lysE基因，其编码赖氨酸输出蛋白(DE-A-195 48 222)，●zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM 13115)，●eno基因，其编码烯醇化酶(DE 199 47 791.4)。
优选使用内源基因。
除了扩增、特别是过表达本发明的zwf基因或等位基因之外，同时弱化特别是缺失选自如下的一或多个基因对于L-氨基酸的生产也是有益的●pck基因，其编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(DE 199 50 409.1；DSM 13047)，●pgi基因，其编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(US 09/396,478，DSM12969)，●poxB基因，其编码丙酮酸氧化酶(DE 199 51 975.7；DSM13114)，●zwa2基因(DE199 59 327.2；DSM 13113)。
文中术语“弱化”是指降低或抑制微生物中一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度，所述酶或蛋白质是由相应的DNA编码的，例如使用弱启动子或者编码具有低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因或者使相应的酶或蛋白质失活及任选组合这些措施进行。
通过弱化措施，相应酶或蛋白质的活性或浓度与野生型酶或蛋白质或者与起始微生物中所述酶或蛋白质的活性或浓度相比一般降低到0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。
除了Zwf蛋白的扩增、特别是过表达之外，消除非所需的副反应对于L-氨基酸的生产也是有益的(Nakayama″Breeding of Amino AcidProducing Micro-organisms″，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续或非连续通过分批法(分批培养)，补料分批法(补料方法)或重复补料分批法(重复补料方法)培养，以生产L-氨基酸。已知培养方法由Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1.Introduction to Bioprocess Technology(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)]所述或者由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen[Bioreactors and Peripheral Equipment](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定微生物的要求。关于多种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的手册“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。可使用的碳源是糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源是有机含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。
氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应的含钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。上述起始物质可以单批形式或在培养期间以适当形式加入到培养物中。
可以适当方式应用碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾，氨，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制pH。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。具有选择性作用的适当物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
因此，本发明进一步提供了通过发酵棒状细菌制备氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤a)发酵生产氨基酸的细菌，其中至少编码间酶蛋白的zwf基因是过表达的，及b)浓缩培养基或细菌细胞中的氨基酸，其中所述间酶蛋白包含至少相应于SEQ ID NO22第241-246位氨基酸的氨基酸序列，及任选SEQ ID NO10的第1-10位氨基酸或者SEQ ID NO10的第2-10位氨基酸的N末端序列。
本发明进一步提供了通过发酵分离的棒状细菌制备氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤a)发酵生产氨基酸的细菌，所述细菌包含编码具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多个氨基酸和/或第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换，及b)浓缩培养基或细菌细胞中的氨基酸。
本发明进一步提供了通过发酵棒状细菌制备氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤a)发酵包含一种分离的或重组多核苷酸的、生产氨基酸的细菌，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的Zwf蛋白，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换，及
b)浓缩培养基或细菌细胞中的氨基酸。
然后从培养基或者细菌细胞中分离所述氨基酸。
使用本发明的措施，所述细菌或发酵方法的性能在产物浓度(产物/体积)、产物产量(形成的产物/消耗的碳源)、产物形成(形成的产物/体积和时间)或其它工艺参数及其组合中均可改良至少0.5％，至少1％或至少2％。
L-氨基酸的分析可以通过阴离子交换层析随后茚三酮衍生化作用进行，如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述，或者可以通过反相HPLC进行，如Lindroth等(AnalyticalChemistry(1979)51.1167-1174)所述。
如下微生物作为纯培养物保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)●大肠杆菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2根据布达佩斯条约于2000年1月20日保藏，保藏号DSM 13244。
●谷氨酸棒杆菌DM658于1993年1月27日长期保藏，保藏号DSM 7431；这个保藏物于2002年10月17日转为根据布达佩斯条约的保藏物。
●谷氨酸棒杆菌DSM5715zwf2_A243T根据布达佩斯条约于2002年10月11日保藏，保藏号为DSM 15237。
●谷氨酸棒杆菌DM1697_zwfD245S根据布达佩斯条约于2003年5月23日保藏，保藏号为DSM 15632。
附图简述图1质粒pEC-T18mob2图谱图2质粒pEC-T18mob2zwf图谱图3质粒pAMC1图谱图4质粒pMC1图谱图5质粒pCR2.1poxBint图谱图6质粒pK18mobsacB_zwf(A243T)图谱图7质粒pK18mobsacB_zwf图谱图8质粒pK18mobsacB_zwf(D245S)图谱图9质粒pCRBluntII_AB1CD1图谱图10质粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp图谱图11质粒pCRBluntII_zwfL图谱图12质粒pCRBluntII_zwfS图谱图13质粒pZ8-1zwfL图谱图14质粒pZ8-1zwfS图谱碱基对数目是根据再现性获得的大约值。
图1和2所用缩写具有如下含义Tet四环素抗性基因OriV大肠杆菌的质粒编码的复制起点RP4mob移动质粒的mob区域rep谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制起点per控制pGA1拷贝数的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N-末端)lacZalpha′lacZα基因片段的5′末端′lacZalphalacZα基因片段的3′末端图3和4所用缩写具有如下含义Neor新霉素/卡那霉素抗性ColE1 ori质粒ColE1的复制起点
CMV巨细胞病毒启动子lacP乳糖启动子pgi磷酸葡萄糖异构酶基因lacZβ-半乳糖苷酶基因的一部分SV403′splice猿猴病毒40的3′剪接位点SV40polyA猿猴病毒40的聚腺苷酸化位点f1(-)ori丝状噬菌体f1的复制起点SV40 ori猿猴病毒40的复制起点kan r卡那霉素抗性pgi insertpgi基因的内部片段ori质粒pBGS8的复制起点图5所用缩写具有如下含义ColE1 ori质粒ColE1的复制起点lacZlacZα基因片段的克隆残余物fl ori噬菌体f1的复制起点KmR卡那霉素抗性ApR氨苄青霉素抗性PoxBintpoxB基因的内部片段图6所用缩写具有如下含义RP4mob具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域KanR卡那霉素抗性基因oriV复制起点Vzwf(A243T)zwf(A243T)等位基因sacBsacB基因图7和8所用缩写具有如下含义zwfzwf基因zwf(D245S)zwf(D245S)等位基因oriV复制起点VRP4mob具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域KanR卡那霉素抗性基因sacBsacB基因XbaI限制酶XbaI的切割位点PstI限制酶PstI的切割位点图9和10所用缩写具有如下含义deltazwf90含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Kan卡那霉素抗性基因pUC ori复制起点sacBsacB基因RP4mob具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域oriV复制起点VXbaI限制酶XbaI的切割位点图11和12所用缩写具有如下含义zwfLzwf等位基因的克隆的DNA片段zwfS含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Km卡那霉素抗性基因pUC origin复制起点SalI限制酶SalI的切割位点图13和14所用缩写具有如下含义zwfLzwf等位基因的克隆的DNA片段zwfS含有zwf等位基因90bp缺失的克隆的DNA片段Km卡那霉素抗性基因rrnB-Terminator转录终止Ptac启动子rep复制起点SalI限制酶SalI的切割位点。
本领域已知多种限制酶的缩写的含义(例如BamHI，EcoRI等等)，例如由Kessler和Hoeltke(Gene 47，1-153(1986))或者Roberts等(Nucleic Acids Research 27，312-313(1999))所概述。
如下实施例进一步例证了本发明。本发明使用的分子生物学技术例如质粒DNA分离、限制酶处理、连接、大肠杆菌的标准转化等，(除非特别说明)均由Sambrook等(Molecular Cloning.A LaboratoryManual(1989)Cold Spring Harbor Laboratories，USA)所描述。
实施例1Zwf蛋白的表达1.1质粒pEC-T18mob2的制备根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。该载体含有质粒pGA1的复制区rep，包括复制效应子per(US-A-5,175,108；Nesvera et al.，Journal of Bacteriology 179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的授予四环素抗性的tetA(Z)基因(US-A-5,158,891；gene library entry at the National Center for BiotechnologyInformation(NCBI，Bethesda，MD，USA)，登录号AF121000)，质粒pMB1的复制区oriV(Sutcliffe，Cold Spring Harbor Symposium onQuantitative Biology 43，77-90(1979))，lacZα基因片段，其包括lac启动子和一个多克隆位点(mcs)(Norrander et al.Gene 26，101-106(1983))，及质粒RP4的mob区(Simon et al.，(1983)Bio/Technology1784-791)。将构建的载体转化大肠杆菌菌株DH5α(Brown(ed.)Molecular Biology Labfax，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK，1991)。通过将转化批次物铺板在补加了5mg/l四环素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过用限制酶EcoRI和HindIII限制随后进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。
所述质粒称为pEC-T18mob2，如图1所示。其以大肠杆菌K-12菌株DH5αpEC-T18mob2形式保藏在DSMZ(德国微生物保藏中心，Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM 13244。
1.2质粒pEC-T18mob2zwf的制备首先将来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因通过聚合酶链反应(PCR)利用如下寡核苷酸引物首先进行扩增zwf-正向(SEQ ID NO11)5′-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3′zwf-反向(SEQ ID NO12)5′-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3′
所述PCR反应在存在200μM脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)的情况下进行30次循环，每次于热循环仪(Thermocycler，PTC-100，MJ Research，Inc.，watertown，USA)中使用1μM相应的寡核苷酸，100纳克(ng)谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA，1/10体积的10倍反应缓冲液和2.6单位的热稳定Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand High Fidelity PCR System，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，在如下条件下进行反应94℃30秒，64℃1分钟及68℃3分钟。
随后借助于SureClone连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，根据厂商指导将大约1.8kb的扩增片段连接进载体pUC18的SmaI切割位点。将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant etal.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America USA(1990)874645-4649)用全部的连接批次物转化。借助于其羧苄青霉素抗性在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板上鉴别转化体。从7个转化体中制备质粒，并通过限制分析检测作为插入体的1.8kb PCR片段的存在情况。以这种方式形成的重组质粒在下文称作pUC18zwf。
为了构建pEC-T18mob2zwf，将pUC18zwf用KpnI和SalI消化，并借助于Macherey-Nagel(Dueren，Germany)的NucleoSpin提取试剂盒根据厂商指导分离产物，然后将其与已经用KpnI和SalI切割并去磷酸化的载体pEC-T18mob2连接。将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grantet al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America USA(1990)874645-4649)用全部的连接批次物转化。借助于转化体的四环素抗性在含有5μg/mL四环素的LB琼脂平板上鉴别转化体。从12个转化体中制备质粒并通过限制分析检测作为插入体的1.8kb PCR片段的存在情况。以这种方式分离的重组质粒称作pEC-T18mob2zwf(图2)。
实施例2具有扩增的zwf基因的氨基酸生产株的制备生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌DSM5715在EP-B-0435132中描述，生产L-苏氨酸的菌株黄色短杆菌DSM5399在EP-B-0385940中描述。这两个菌株均根据布达佩斯条约保藏在Braunschweig的德国微生物保藏中心(德国)。
2.1菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf的制备将菌株DSM5715和DSM5399用质粒pEC-T18mob2zwf使用Liebl等(FEM S Microbiology Letters，53299-303(1989))所述电穿孔方法转化。在补加了5mg/l四环素、包含18.5g/l脑心肉浸汁，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l Bacto琼脂的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃保温2天。
每次通过常规方法从转化体中分离质粒DNA(Peters-Wendisch etal.，1998，Microbiology 144，915-927)，用限制性核酸内切酶XbaI和KpnI切割，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒。以这种方式获得的菌株称为DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf。
2.2L-苏氨酸的制备将在实施例2.1中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399/pEC-T18mob2zwf在适于苏氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中苏氨酸含量。
为此，首先将菌株在具有相应抗生素的琼脂平板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上在33℃保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。完全培养基CgIII用作预培养物的培养基。
培养基Cg IIINaCl2.5g/lBacto-胨10g/lBacto-酵母提取物10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)将pH调节为pH7.4向其中加入四环素(5mg/l)。将此预培养物在33℃以240rpm在摇床上保温16小时。从这个预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始OD(660nm)为0.1。培养基MM用于主培养物。
培养基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(吗啉代丙烷磺酸)20g/l葡萄糖(单独高压灭菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O5.0mg/l生物素(过滤灭菌)0.3mg/l硫胺素*HCl(过滤灭菌)0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水将CSL，MOPS和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的苏氨酸量。
实验结果示于表1。
表1
2.3L-赖氨酸的制备将在实施例2.1中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf在适于赖氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中赖氨酸含量。
为此，首先将该菌株在具有相应抗生素的琼脂平板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上在33℃保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。完全培养基CgIII用作预培养的培养基。
培养基Cg IIINaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母提取物 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH 7.4向其中加入四环素(5mg/l)。将此预培养物在33℃以240rpm在摇床上保温16小时。从这个预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始OD(660nm)为0.1。培养基MM用于主培养物。
培养基MMCSL(玉米浸液)5g/lMOPS(吗啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O1.0g/lCaCl2*2H2O10mg/lFeSO4*7H2O10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
实验结果示于表2。
表2
实施例3谷氨酸棒杆菌菌株ASO19的基因文库的构建谷氨酸棒杆菌菌株ASO19(Yoshihama et al.，Journal ofBacteriology 162，591-597(1985))的DNA文库使用λZap ExpressTM系统(Short et al.，(1988)Nucleic Acids Research，167583-7600)构建，如O′Donohue(O′Donohue，M.(1997).The Cloning and MolecularAnalysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes fromCorynebacterium glutamicum.Ph.D.Thesis，National University ofIreland，Galway)所述。λZap ExpressTM试剂盒购自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，California 92037)并根据厂商指导使用。将AS019-DNA用限制酶Sau3A消化并连接进BamHI处理并去磷酸化的λZap ExpressTM臂中。
实施例4pgi基因的克隆与测序4.1克隆将如Kupor和Fraenkel(Journal of Bacteriology 1001296-1301(1969))所述具有pgi和pg1基因突变的大肠杆菌菌株DF1311用实施例3所述的大约500ng的AS019λZap ExpressTM质粒文库转化。在含有50mg/l浓度卡那霉素的M9基本培养基(Sambrook et al.，(1989).Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，USA)上选择转化体，并在37℃保温48小时。根据Birnboim和Doly(Nucleic Acids Research 71513-1523(1979))所述从一个转化体中分离质粒DNA，称作pAMC1(图3)。
4.2测序为了对pAMC1克隆的插入体进行序列分析，应用Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74，5463-5467(1977))所述方法，使用经有色荧光标记不同标记的引物进行分析。使用Perkin Elmer Applied Biosystems(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，Connecticut，U.S.A)的ABI prism 310遗传分析仪和PerkinElmer的ABI prism Big DyeTMTerminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit进行。
起始序列分析使用得自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，AL13AW，UK)的通用正向和M13反向引物进行通用正向引物GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C(SEQ ID NO13)M13反向引物GGA AAC AGC TAT GAC CAT G(SEQ ID NO14)
随后从获得的序列中设计内在引物，由此可以推导全部的pgi基因。内在引物的序列如下内在引物1(SEQ ID NO15)GGA AAC AGG GGA GCC GTC内在引物2(SEQ ID NO16)TGC TGA GAT ACC AGC GGT然后使用DNA Strider程序(Marck，(1988).Nucleic Acids Research161829-1836)，1.0版本在Apple Macintosh计算机上分析获得的序列。这个程序可以分析如限制位点使用，开放读框分析和密码子使用确定。获得的DNA序列与EMBL和Genbank数据库中的那些序列之间的搜索使用BLAST程序(Altschul et al.，(1997).Nucleic AcidsResearch，253389-3402)进行。DNA和蛋白质序列使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1988 Gene 73237-244)排列对比。
由此获得的序列示于SEQ ID NO1。获得的核苷酸序列分析显示一个1650碱基对的开放读框，称作pgi基因，其编码具有550个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO2所示。
实施例5整合诱变pgi基因的整合载体的制备pgi基因的内部片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用分离自谷氨酸棒杆菌AS019(Heery and Dunican，(1993)Applied andEnvironmental Microbiology 59791-799)的基因组DNA作为模板。使用的pgi引物是正向引物ATG GAR WCC AAY GGH AA(SEQ ID NO17)反向引物YTC CAC GCC CCA YTG RTC(SEQ ID NO18)其中R＝A+G；Y＝C+T；W＝A+T；H＝A+T+C。
PCR参数如下35次循环
94℃1分钟47℃1分钟72℃30秒1.5mM MgCl2大约150-200ng DNA模板将获得的PCR产物克隆进商购自Promega公司(Promega UK，Southampton.)的pGEM-T载体中，使用大肠杆菌菌株JM109，(Yanisch-Perron et al.，1985.Gene，33103-119)为宿主。该PCR产物的序列示于SEQ ID NO3。然后将克隆的插入体切割为EcoRI片段并与用EcoRI预处理的质粒pBGS8(Spratt et al.，Gene 41337-342(1986))连接。使用的限制酶得自Boehringer Mannheim UK Ltd.，(BellLane，Lewes East Sussex BN7 1LG，UK.)，根据厂商指导使用。然后将大肠杆菌JM109用这个连接混合物转化，并在补加了浓度分别为1mM、0.02％和50mg/l的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)、XGAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖吡喃糖苷)和卡那霉素的Luria琼脂上选择电转化体。
将琼脂平板在37℃保温12小时。从一个转化体中分离质粒DNA，使用EcoRI、BamHI和SalI通过限制酶分析鉴定，称作pMC1(图4)。
质粒pMC1以大肠杆菌菌株DH5α/pMC1的形式根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号DSM 12969。
实施例6在赖氨酸生产株DSM 5715中pgi基因的整合诱变将实施例5所述的载体pMC1通过Tauch等(FEMSMicrobiological Letters，123343-347(1994))所述电穿孔方法电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是一种AEC-抗性赖氨酸生产菌株。载体pMC1在DSM5715中不能独立复制，只有整合进DSM 5715染色体中时才能保留在细胞中。通过将电穿孔批次物铺板在补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)上选择pMC1整合进染色体中的克隆。
为了检测整合，将内在pgi片段(实施例5)使用得自BoehringerMannheim的Dig杂交试剂盒标记，通过Boehringer Mannheim GmbH的“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”的方法(Mannheim，Germany，1993)进行标记。转化体的染色体DNA通过Eikmanns等的方法(Microbiology 1401817-1828(1994))分离，并且每次用限制酶SalI、SacI和HindIII切割。形成的片段通过琼脂糖凝胶分离，在68℃用得自Boehringer的Dig杂交试剂盒杂交。在这种方式中发现质粒pMC1插入在菌株DSM5715的染色体pgi基因中。这个菌株称作DSM5715∷pMC1。
实施例7zwf基因过表达及同时pgi基因消除对赖氨酸制备的作用7.1菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf的制备将实施例1.2所述的载体pEC-T18mob2zwf通过Tauch等(1994，FEMS Microbiological Letters，123343-347)所述电穿孔方法电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715∷pMC1中。通过将电穿孔批次物铺板在补加了15mg/l卡那霉素和5mg/l四环素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上选择携带质粒的细胞。通过常规方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，并通过用限制酶KpnI和SalI处理及随后的琼脂糖凝电泳检测。所述菌株称作DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf。
7.2赖氨酸的制备将实施例7.1中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf在适于赖氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中赖氨酸含量。
为此，首先将菌株在具有相应抗生素的琼脂平板(具有四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上在33℃保温24小时。根据其对抗生素的抗性补加对比菌株的培养物。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。完全培养基CgIII用作预培养的培养基。
培养基Cg IIINaCl2.5g/lBacto-胨10g/lBacto-酵母提取物10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)pH7.4向其中加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(5mg/l)。将此预培养物在33℃以240rpm在摇床上保温16小时。从这个预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始OD(660nm)为0.1。培养基MM用于主培养物。
培养基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(吗啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL、MOPS和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
实验结果示于表3。
表3
实施例8从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032制备基因组粘粒基因文库谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA如Tauch等(1995，Plasmid 33168-179)所述进行分离，并用限制酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，Germany，Product Description Sau3AI，Code no.27-0913-02)部分切割。将该DNA片段用虾碱性磷酸酶(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，Germany，Product DescriptionSAP，Code no.1758250)去磷酸化。将得自Stratagene(La Jolla，USA，Product Description SuperCosl Cosmid Vektor Kit，Code no.251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl et al.(1987)Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 842160-2164)的DNA用限制酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany，Product DescriptionXbaI，Code no.27-0948-02)切割，并同样用虾碱性磷酸酶去磷酸化。
然后将粘粒DNA用限制酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany，Product Description BamHI，Code no.27-0868-04)切割。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA混合，并将该批次物用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany，Product Description T4-DNA-Ligase，Code no.27-0870-04)处理。然后将连接混合物借助于Gigapack II XL PackingExtracts(Stratagene，La Jolla，USA，Product Description Gigapack IIXL Packing Extract，Code no.200217)在噬菌体中包装。为了感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh et al.1988，Nucleic Acid Res.161563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液等份混合。如Sambrook等(1989，Molecular CloningA laboratory Manual，ColdSpring Harbor)所述对粘粒文库进行感染和滴定，将细胞铺板在LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1190)+100μg/ml氨苄青霉素上。在37℃保温过夜后，选择重组的各个克隆。
实施例9poxB基因的分离与测序各个菌落的粘粒DNA(实施例7)使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Product No.27106，Qiagen，Hilden，Germany)根据厂商指导进行分离，并使用限制酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany，Product Description Sau3AI，Product No.27-0913-02)部分切割。将该DNA片段用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany，Product Description SAP，Product No.1758250)去磷酸化。通过凝胶电泳分离后，将大小在1500-2000bp范围的粘粒片段使用QiaExII凝胶提取试剂盒(Product No.20021，Qiagen，Hilden，Germany)分离。得自Invitrogen的测序载体pZero-1的DNA(Groningen，Holland，Product Description Zero Background CloningKit，Product No.K2500-01)用限制酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany，Product Description BamHI，Product No.27-0868-04)切割。通过Sambrook等(1989，Molecular CloningA laboratoryManual，Cold Spring Harbor)所述方法在测序载体pZero-1中连接所述粘粒片段，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)一起保温过夜。
然后将此连接混合物电穿孔(Tauch et al.1994，FEMS MicrobiolLetters，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.，874645-4649)中，并铺板于具有50μg/ml zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1190)上。重组克隆的质粒制备使用Biorobot 9600(ProductNo.900200，Qiagen，Hilden，Germany)进行。测序通过Zimmermann等(1990，Nucleic Acids Research，181067)修改的Sanger等(1977，Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A.，745463-5467)的双脱氧链终止方法进行。使用PE Applied Biosystems的“RRdRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit”(Product No.403044，Weiterstadt，Germany)。在具有PE Applied Biosystems(Weiterstadt，Germany)的测序仪的ABI Prism 377测序仪的Rotiphoresis NFAcrylamide/Bisacrylamide″Gel(291)(Product No.A 124.1，Roth，Karlsruhe，Germany)上进行凝胶电泳分离及测序反应的分析。
然后将获得的原始序列数据使用Staden程序包(1986，NucleicAcids Research，14217-231)版本97-0处理。pZero1衍生物的各个序列被装配成连续重叠群(contig)。用XNIP程序(Staden，1986，Nucleic Acids Research，14217-231)进行计算机辅助的编码区分析。另外使用BLAST搜索程序(Altschul et al.，1997，Nucleic AcidsResearch，253389-3402)对国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行分析。
所得核苷酸序列示于SEQ ID NO4。核苷酸序列分析示出一个1737碱基对的开放读框，将其称作poxB基因。poxB基因编码579个氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。
实施例10进行poxB基因整合诱变的整合载体的制备从菌株ATCC 13032中通过Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))所述方法分离染色体DNA。基于从实施例8中已知的谷氨酸棒杆菌的poxB基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应poxBint1(SEQ ID NO19)5`TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3`poxBint2(SEQ ID NO20)5`GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反应通过Innis等(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)的标准PCR方法进行，使用Boehringer的Pwo聚合酶。借助于聚合酶链反应，分离一个大小大约0.9kb的DNA片段，其携带poxB基因的内部片段，如SEQ ID NO6所示。
将扩增的DNA片段与Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，USA；Catalogue Number K4500-01)在载体pCR2.1-TOPO(Mead at al.(1991)Bio/Technology 9657-663)中连接。然后将大肠杆菌菌株DH5α用连接批次物电穿孔(Hanahan，InDNA cloning.APractical Approach.Vol.I，IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。将转化批次物铺板在补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞。质粒DNA借助于Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化体中分离，并通过用限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。这个质粒称作pCR2.1poxBint(图5)。
质粒pCR2.1poxBint以大肠杆菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM 13114。
实施例11在赖氨酸生产菌株DSM 5715中poxB基因的整合诱变将实施例10所述的载体pCR2.1poxBint通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS Microbiological Letters，123343-347(1994))电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是AEC抗性赖氨酸生产菌株。载体pCR2.1poxBint在DSM5715中不能独立复制，只有整合进DSM5715的染色体中才能保留在细胞中。将电穿孔批次物铺板在补加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)上，选择pCR2.1poxBint整合进染色体中的克隆。为了检测整合，通过Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)的“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”的方法将poxBint片段用Boehringer的Dig杂交试剂盒标记。
潜在整合体的染色体DNA通过Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))所述的方法分离，并每次用限制酶SalI、SacI和HindIII切割。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，在68℃用Boehringer的Dig杂交试剂盒杂交。实施例9所述的质粒pCR2.1poxBint插入DSM5715染色体的poxB基因中。该菌株称作DSM5715∷pCR2.1poxBint。
实施例12zwf基因过表达同时poxB基因消除对赖氨酸生产的作用12.1菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf的制备使用Liebl等所述电穿孔方法(FEMS Microbiology Letters，53299-303(1989))，将菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用质粒pEC-T18mob2zwf进行转化。在包含18.5g/l脑心肉浸汁、0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨、2.5g/l Bacto-酵母提取物、5g/l NaCl和18g/lBacto-琼脂并补加了5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃保温2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology 144，915-927)每次从转化体中分离质粒DNA，用限制性核酸内切酶XbaI和KpnI切割，并将质粒通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测。以这种方式获得的菌株称作DSM5715pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf。
12.2L-赖氨酸的制备将实施例12.1中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/EC-T18mob2zwf在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，确定培养上清中的赖氨酸含量。
为此，首先将菌株在具有相应抗生素的琼脂平板(具有四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上在33℃保温24小时。根据其抗生素抗性补加对比菌株。从这个琼脂平板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。完全培养基Cg III用作预培养的培养基。
培养基Cg IIINaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母提取物 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH 7.4向其中加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。将此预培养物在33℃以240rpm在摇床上保温16小时。从这个预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始OD(660nm)为0.1。培养基MM用于主培养物。
培养基MMCSL(玉米浸液) 5g/lMOPS(吗啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌)0.1g/lCaCO325g/l
用氨水将CSL、MOPS和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
实验结果示于表4。
表4
实施例13zwf等位基因zwf(A243T)分离与测序谷氨酸棒杆菌菌株DM658通过从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中经过多重、非定向诱变、突变体选择及筛选而制备。该菌株对L-赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性，并且具有对L-赖氨酸、L-赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和L-苏氨酸的混合物不敏感的反馈抗性天冬氨酸激酶。菌株DM658保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM7431。
通过常规方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))，从菌株DM658中分离染色体DNA。借助于聚合酶链反应(PCR)，扩增携带zwf基因或等位基因的DNA片段。基于谷氨酸棒杆菌的zwf基因的序列，选择如下实施例1.2中的引物寡核苷酸进行PCRzwf-正向(SEQ ID NO11)5′-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3′zwf-反向(SEQ ID NO12)5′-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通过Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)的标准PCR方法进行PCR。所述引物扩增出长度为大约1.85kb的、携带zwf等位基因的DNA片段。
通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴别携带菌株DM658的zwf等位基因的、长度为大约1.85kb的扩增的DNA片段，从凝胶中分离并通过常规方法(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden，Germany)纯化。
扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过MWG Biotech(Ebersberg，Germany)测序而确定。该PCR产物的序列示于SEQ IDNO21。借助于Patentin程序获得的间酶蛋白(Zwf蛋白)的氨基酸序列示于SEQ ID NO22。
菌株DM658的zwf等位基因的编码区的核苷酸序列在第727位具有碱基腺嘌呤。zwf等位基因编码区的核苷酸序列中第727位相应于SEQ ID NO21所示核苷酸序列的第1034位。
在野生型基因编码区的核苷酸序列的第727位核苷酸是碱基鸟嘌呤。野生型基因编码区的核苷酸序列的第727位相应于SEQ ID NO9的第1264位。
菌株DM658的间酶蛋白(Zwf(A243T))的氨基酸序列在第243位具有氨基酸苏氨酸(SEQ ID NO22)。在野生型蛋白的相应位置是氨基酸丙氨酸(SEQ ID NO10)。因此，所述等位基因称作zwf(A243T)。
SEQ ID NO23示出包含鸟嘌呤腺嘌呤转换(见SEQ ID NO23的第137位)的zwf(A243T)等位基因的编码序列的一个内部节段。
实施例14zwf等位基因zwf(A243T)的转移14.1携带zwf(A243T)等位基因的DNA片段的分离通过常规方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))，从菌株DM658中分离染色体DNA。借助于聚合酶链反应扩增携带zwf(A243T)等位基因的DNA区域，所述等位基因在编码区(CDS)的第727位含有碱基腺嘌呤代替野生型基因在此位置含有的碱基鸟嘌呤。基于谷氨酸棒杆菌的zwf基因的序列，选择如下引物寡核苷酸引物进行聚合酶链反应zwf_XL-A1(SEQ ID NO24)5`gatct aga-agc tcg cct gaa gta gaa tc 3`zwf_XL-E1(SEQ ID NO25)5`gatct aga-gat tca cgc agt cga gtt ag 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通过Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)标准PCR方法进行PCR反应。所述引物扩增出携带zwf(A243T)等位基因的、长度为大约1.75kb的一个DNA片段(SEQ IDNO26)。所述引物另外含有限制性核酸内切酶XbaI的切割位点的序列，其在上述核苷酸序列中以下划线标明。
携带zwf(A243T)等位基因的、长度为大约1.75kb的扩增的DNA片段用限制性核酸内切酶XbaI切割，通过在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳进行鉴别，然后通过常规方法从凝胶中分离并纯化(QIAquick GelExtraction Kit，Qiagen，Hilden)。
14.2置换载体的构建将含有zwf(A243T)等位基因的长度为大约1.75kb的XbaI DNA片段(见实施例14.1)掺入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715的染色体中，通过Schaefer等所述的sacB系统(Gene，14，69-73(1994))进行置换诱变。这个系统通过同源重组可以制备并选择发生的等位基因置换。
将可移动的克隆载体pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，并将末端用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，Germany)去磷酸化。将以这种方式制备的载体与大约1.75kb大小的zwf(A243T)片段混合，将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。
然后将大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1784-791，1993)用该连接批次物转化(Hanahan，In.DNA cloning.APractical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)。将转化批次物铺板在补加了25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择携带质粒的细胞借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，通过用酶PstI限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳进行检测。该质粒称作pK18mobsacB_zwf(A243T)，示于图6。
14.3等位基因的转移将实施例14.2中所述的载体pK18mobsacB_zwf(A243T)通过接合移至谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715中，通过Schaefer等所述方法(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))进行。该载体在DSM5715中不能独立复制，只有通过重组事件整合进染色体中才保留在细胞中。将接合批次物铺板在补加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择转接合子，即具有整合的pK18mobsacB_zwf(A243T)的克隆。将卡那霉素抗性转接合子铺板在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上，在33℃保温24小时。卡那霉素抗性转接合子称作DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)。作为质粒载体pK18mobsacB_zwf(A243T)整合进菌株DSM5715染色体中的结果，获得的菌株即DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)含有zwf野生型基因和zwf(A243T)等位基因。
为了选择其中由于二次重组事件所致的切除了所述质粒的突变体，将菌株DSM5715∷pK18mobsacB_zwf(A243T)的细胞在LB液体培养基中非选择性培养24小时，然后铺板在具有10％蔗糖的LB琼脂上，保温30小时。
质粒pK18mobsacB_zwf(A243T与起始质粒pK18mobsacB一样，除了卡那霉素抗性基因之外，还含有编码枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的果聚糖蔗糖酶的sacB基因拷贝。可由蔗糖诱导的表达导致果聚糖蔗糖酶形成，其催化对于谷氨酸棒杆菌是毒性的产物果聚糖的合成。只有其中由于二次重组事件而切除了整合的质粒pK18mobsacB_zwf(A243T)的那些克隆在含有蔗糖的LB琼脂上生长。依赖于关于突变位点的二次重组事件的位置，发生等位基因置换(即掺入突变)或者原始拷贝(即野生型基因)保留在宿主的染色体中。
对大约40-50个菌落测试“在存在蔗糖时的生长”和“在存在卡那霉素时的不生长”的表型。在示出“在存在蔗糖时的生长”和“在存在卡那霉素时的不生长”的表型的4个菌落中，对跨越zwf(A243T)突变的zwf基因的一个区域测序，从测序引物zf_1(SEQID NO27)(GATC Biotech AG，Konstanz，Germany制备)开始，以论证染色体中存在zwf(A243T)等位基因突变。引物zf_1的核苷酸序列如下zf_1(SEQ ID NO27)5`ggc tta cta cct gtc cat tc 3`以这种方式鉴别在zwf基因编码区(CDS)第727位含有碱基腺嘌呤并因此在其染色体中具有zwf(A243T)等位基因的克隆。这个克隆称作菌株DSM5715zwf2_A243T。
菌株DSM5715zwf2_A243T根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM15237。
实施例15葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的鉴定和确定15.1菌株DM658的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了鉴定zwf等位基因zwf(A243T)编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将菌株DM658在LB培养基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在具有档板的250ml锥形瓶中在33℃以200rpm在摇床上进行的。为了进行对比，平行培养野生型菌株ATCC 13032。通过离心收集生物量并随后在pH7.8的Tris-HCl(100mM)缓冲液中洗涤。使用Ribolyser系统(Hybaid AG，Heidelberg，Germany)使细胞溶解。通过这种方法，使用1.6g玻璃珠(直径0.2μm)和含有上述细胞的pH 7.8的、0.6g Tris-HCl(100mM)/NaCl缓冲液(520mM)对细胞进行机械化溶解。离心后，分离上清并用作粗提物。通过比色BCA方法(Pierce，Rockford，IL，USA，Order No.23235ZZ)，使用等份上清确定总蛋白质浓度。将另一等份用于确定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)催化如下反应葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡糖酸-δ-内酯+NADPH确定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的分析系统含有100mM Tris-HCl(pH 7.8)，10mM MgCl2和260μM NADP+。加入葡萄糖-6-磷酸至终浓度为7mM葡萄糖-6-磷酸开始反应。NADPH的吸收在25℃在340nm使用Hitachi U3200分光光度计(Nissei Sangyo，Duesseldorf，Germany)监测。
为了计算单位/毫升的容量酶活性，使用如下公式
为了计算单位/毫克总蛋白的酶比活性(U/mg；mU＝毫单位/mg)，将酶活性除以粗提物的蛋白质浓度。
在存在NADPH时葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定在含有100mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、260μM NADP+和260μMNADPH的分析系统中进行。加入葡萄糖-6-磷酸至终浓度为7mM开始反应。在存在NADPH时酶活性的计算以如前述相同方式进行。
实验结果示于表5。
表5
15.2菌株DSM5715zwf2_A243T的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了确定菌株DSM5715zwf2_A243T中含有的、zwf等位基因zwf(A243T)编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将该菌株在LB培养基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在250ml具有档板的锥形瓶中，在33℃以200rpm在摇床上进行。为了进行对比，平行保温具有野生型zwf基因的亲代菌株DSM5715。生物量的制备如实施例15.1所述进行。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性在存在其反应终产物NADPH的情况中的测定在含有100mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、260μMNADP+、7mM葡萄糖-6-磷酸和400μM NADPH的分析系统中进行。在存在NDDPH时的酶活性以前述相同方式计算。
实验结果示于表6。
表6
实施例16L-赖氨酸的生产将在实施例14中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715和DSM5715zwf2_A243T在适于赖氨酸产生的营养培养基中培养，确定培养上清中赖氨酸含量。
为此，首先将菌株在33℃在琼脂平板上保温24小时。从这个琼脂平板培养物开始，每次接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。培养基MM用作预培养的培养基。将预培养物在33℃以240rpm在摇床上保温24小时。在所有情况下，从这些预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始OD(660nm)为0.1。培养基MM也用于主培养。
培养基MMCSL 5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l盐(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O1.0g/lCaCl2*2H2O10mg/lFeSO4*7H2O10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素*HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l
用氨水将CSL(玉米浸液)、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(Hamburg，Germany)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
实验结果示于表7。
表7
实施例17菌株DM1697的zwf野生型基因被zwf(D245S)等位基因置换17.1携带zwf基因的DNA片段的分离谷氨酸棒杆菌菌株DM1697通过从谷氨酸棒杆菌ATCC21527中经多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。ATCC21527对于L-亮氨酸和L-高丝氨酸是营养缺陷的。相反，菌株DM1697对于L-亮氨酸和L-高丝氨酸是原养型的，对赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且具有对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸和苏氨酸(在所有情况中均为25mM)混合物的抑制作用不敏感的反馈抗性天冬氨酸激酶。
通过常规方法(Eikmanns et al.，Microbiology 1401817-1828(1994))从菌株DM1697中分离染色体DNA。携带zwf基因的DNA片段借助于聚合酶链反应扩增。基于从实施例1中已知的谷氨酸棒杆菌zwf基因序列，选择如下寡核苷酸引物进行聚合酶链反应zwf_XL-Al(SEQ ID NO24)5`gatctagaagc tcg cct gaa gta gaa tc 3`zwf_XL-E1(SEQ ID NO25)5`gatctagagat tca cgc agt cga gtt ag 3`所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR反应通过Innis等的标准PCR方法进行(PCR Protocols.A Guide to Methodsand Applications，1990，Academic Press)。引物可以扩增长度为大约1.75kb的、携带zwf基因的DNA片段(SEQ ID NO38)。所述引物另外含有限制性核酸内切酶XbaI的切割位点的序列，在如上所示核苷酸序列中以下划线标示。
将携带zwf基因的、长度为大约1.75kb的扩增的DNA片段用限制性核酸内切酶XbaI切割，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳鉴别，然后通过常规方法从凝胶中分离和纯化(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Hilden)。
17.2置换载体pK18mobsacB_zwf的构建将可移动的克隆载体pK18mobsacB用限制酶XbaI消化，并将末端用碱性磷酸酶去磷酸化(Alkaline Phosphatase，BoehringerMannheim，Germany)。将以这种方式制备的载体与大小大约1.75kb的zwf片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Brown(ed.)Molecular BiologyLabfax，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK，1991)用连接批次物转化(Hanahan，In.DNA cloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。将转化批次物铺板在补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择携带质粒的细胞。
借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，通过用酶XbaI限制性切割及随后的琼脂糖凝胶电泳进行检测。该质粒称作pK18mobsacB_zwf，示于图7。
17.3通过野生型zwf基因的定点诱变构建zwf(D245S)等位基因使用QuikChange Site-Directed诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，USA)进行定点诱变。在SEQ ID NO38所示zwf野生型基因的核苷酸序列中导入三个点突变(取代)。这些取代是核苷酸序列第861位的鸟嘌呤由胸腺嘧啶取代、第862位的腺嘌呤由胞嘧啶取代及第863位的胸腺嘧啶由腺嘌呤取代。以这种方式产生的核苷酸序列示于SEQID NO39，其编码在其氨基酸序列第245位由丝氨酸代替天冬氨酸的变体Zwf蛋白。
该等位基因称作zwf(D245S)。为了产生所述突变，选择如下寡核苷酸引物进行线性扩增DM_D245Sa(SEQ ID NO40)5′AGATCACCATGGCTGAA(TCA)ATTGGCTTGGGTGGAC 3′DM_D245Sb(SEQ ID NO41)5′GCACGTCCACCCAAGCCAAT(TGA)TTCAGCCATGGTG 3′所示引物由MWG Biotech合成。在衍生自zwf基因的氨基酸序列第245位取代天冬氨酸的丝氨酸密码子在上述核苷酸序列中以括号标示。将实施例17.2所述的质粒pK18mobsacB_zwf和与质粒的链均互补的两个引物一起应用，通过Pfu Turbo DNA聚合酶进行线性扩增。通过这种引物延长，形成了具有断续的环形链的突变质粒。将线性扩增的产物用DpnI处理-这种内切酶特异性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。新合成的、断续的、突变的载体DNA转化大肠杆菌菌株XL1 Blue(Bullock，Fernandez and Short，BioTechniques(5)376-379(1987))。转化后，XL1 Blue细胞修复突变质粒中的缺口。在具有50mg/l卡那霉素的LB培养基上选择转化体。获得的质粒通过在分离DNA之后限制性切割而检测，并通过电泳鉴别。突变的DNA片段的DNA序列通过测序检测。PCR产物的序列相应于SEQ ID NO39所示核苷酸序列。所得质粒称作pK18mobsacB_zwf(D245S)。质粒的图谱示于图8。
17.4菌株DM1697的zwf野生型基因由zwf(D245S)等位基因置换将实施例实施例17.3所述的质粒pK18mobsacB_zwf(D245S)如实施例14.3所述通过接合移至谷氨酸棒杆菌菌株DM1697中。如实施例14.3所述针对谷氨酸棒杆菌DM1697染色体中的靶定重组事件进行选择。依赖于质粒切割期间二次重组事件的位置，含有突变的zwf等位基因出现在染色体zwf基因座中，或者保留宿主原始的zwf基因座。
对大约40-50个菌落测试“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型。在示出“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型的6个菌落中，对跨越zwf(D245S)突变的zwf基因的一个区域测序，从测序引物zf_2(SEQ ID NO42)(GATCBiotech AG，Konstanz，Germany制备)开始，以论证染色体中存在zwf(D245S)等位基因突变。引物zf_2的核苷酸序列如下zf_2(SEQ ID NO42)5`TTC TGT GTT CCG CAT CGA CC 3`以这种方式鉴别了在zwf基因编码区(CDS)第733、734和735位分别含有碱基胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤并因此在其染色体中具有zwf(D245S)等位基因(SEQ ID NO36)的克隆。zwf等位基因编码区的核苷酸序列的第733、734和735位相应于SEQ ID No39的第861、862和863位。这个克隆称作菌株DM1697_zwf(D245S)。
菌株DM1697_zwf(D245S)根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM15632。
17.5菌株DSM15632的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了确定由菌株DSM15632中含有的zwf(D245S)等位基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将该菌株在LB培养基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在具有档板的250ml锥形瓶中在33℃以200rpm在摇床上进行的。为了进行对比，平行保温具有野生型zwf基因的亲代菌株DM1697。生物量的制备如实施例15.1所述制备。
在存在其反应终产物NADPH的情况中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定是在含有100mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mM MgCl2，260μMNADP+、7mM葡萄糖-6-磷酸和400μM NADPH的分析系统中进行。在存在NADPH的情况中的酶活性以前述相同方式计算。
实验结果示于表8。
表8
17.6L-赖氨酸的制备将在琼脂平板(脑心琼脂)上在33℃生长24小时的实施例17.4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM15632的细胞接种于在500ml具有档板的锥形瓶中50ml的LSS1培养基(Ohnishi et al.，Applied Microbiologyand Biotechnology 58217-223(2002))中，培养基中5％蔗糖用5％葡萄糖代替。在最初加入的糖全部消耗之后的早期稳定阶段停止在33℃在旋转摇床上的培养。使用4ml种子肉汤接种含有1000ml LPG1培养基(Ohnishi et al.，Applied Microbiology and Biotechnology 58217-223(2002))的2L发酵罐(Biostat B reactor，B.Braun，Melsungen，Germany)。
在最初加入的糖消耗之后，持续加入含有50％(w/v)葡萄糖和3.5％(w/v)(NH4)2SO4的溶液，直至发酵罐中总培养体积达到2000ml。培养在pO2＞20％，充气＞0.51/分钟，和33℃下进行。pH保持在7.0。用Eppendorf-BioTronik公司(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
实验结果示于表9。
表9
实施例18谷氨酸棒杆菌DM1698的构建谷氨酸棒杆菌菌株DM1698基于实施例17.1所述的谷氨酸棒杆菌DM1697构建。其携带使用实施例14.2构建的置换载体pK18mobsacB_zwf(A243T)导入菌株DM1697中的zwf(A243T)等位基因。zwf(A243T)等位基因如实施例14.3所述通过接合、置换和选择移至DM1697中。所得菌株称作DM1698，在这个实施例中使用。
如实施例16对于菌株DSM5715和DSM5715zwf2_A243T所描述，突变zwf(A243T)整合进zwf基因改良了L-赖氨酸的生产。这同样也用于携带zwf(A243T)等位基因的菌株DM1698，结果是比亲代菌株DM1697更好的L-赖氨酸生产株。
实施例19在菌株DM1697的zwf野生型基因中导入90个碱基对缺失并确定编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性设计实施例19和实施例20的实验以论证谷氨酸棒杆菌的zwf基因编码序列的5’末端的90个碱基对(见例如SEQ ID NO9所示的zwf野生型基因或者SEQ ID NO21所示的zwf(A243T)等位基因)是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性所必需的，所述90个碱基对未包括在JP-A-092244661所述的zwf基因的编码序列中(见SEO ID NO7)。
在实施例19，论证了野生型基因(SEQ ID NO9)和编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO10)。在实施例20中，论证了实施例13所述的zwf(A243T)等位基因(SEQ ID NO21)和编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(SEQ ID NO22)。
在这个实施例中，谷氨酸棒杆菌菌株DM1697(见实施例17.1)的zwf野生型基因缺失90个碱基对，以比较在90个碱基对缺失前后野生型等位基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性。
19.1zwf缺失片段克隆进载体pCRBluntII TOPO中通过Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)从菌株ATCC13032中分离染色体DNA。基于从实施例1已知的谷氨酸棒杆菌zwf基因的序列，选择下述寡核苷酸通过聚合酶链反应(PCR)产生zwf缺失片段，通过基因SOEing方法(Gene Splicing by OverlapExtension，Horton，Molecular Biotechnology 393-98(1995))进行。
zwfA(SEQ ID NO43)5′-ATTCTAGACAC CTT GAT CTT CTC CGT TG-3′zwfB(SEQ ID NO44)5′-GAT GGT AGT GTC ACG ATC CT-3′zwfC(SEQ ID NO45)5′-AGG ATC GTG ACA CTA CCA TCA TGG TGA TCT TCG GTG TCA C-3′zwfD(SEQ ID NO46)5′-ATTCTAGAGCG GAG GTT TTA TCC AAT GG-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，PCR通过Innis等的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)进行，使用NewEnglandBiolabs的Vent DNA聚合酶(Germany，Product Description Vent DNAPolymerase)。
在所有情况中，引物zwfA和zwfD均含有限制酶XbaI的一个插入的切割位点，在上述核苷酸序列中以下划线标示。引物zwfC的前20个碱基含有引物zwfB的反向互补序列。
借助于聚合酶链反应，引物zwfA和zwfB使得一个710bp的DNA片段扩增，引物zwfC和zwfD使得一个850bp的DNA片段扩增。扩增物随后通过在0.8％琼脂糖凝胶中的琼脂糖凝胶电泳而检测，使用High Pure PCR产物纯化试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Deutschland)从琼脂糖凝胶中分离，并在使用引物zwfA和zwfD的另一个PCR反应中一起用作DNA模板。这样导致zwf缺失片段产生，大小为1560bp(见SEQ ID NO47所示)。
扩增的产物随后在0.8％琼脂糖凝胶中检测。
将获得的PCR产物克隆进载体pCRBluntII TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Deutschland)中，然后根据厂商指导将大肠杆菌菌株TOP10(Grant et al.，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)用该连接批次物转化。将转化批次物铺板在补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择携带质粒的细胞。
借助于High Pure质粒分离试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)从转化体中分离质粒DNA，并通过用限制酶XbaI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。该质粒称作pCRBluntII_AB1CD1，示于图9。
19.2取代载体pK18mobsacB_zwfdelta90bp的构建图9和10中称作“deltazwf90”的zwf缺失片段是通过用限制酶XbaI对实施例19.1中获得的载体pCRBluntII_AB1CD1进行完全切割而分离的。在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1600bp的zwf缺失片段借助于High Pure PCR产物纯化试剂盒(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)从琼脂糖凝胶中分离。
以这种方式处理的zwf缺失片段用于与可移动的克隆载体pK18mobsacB(Schfer et al.，Gene 1469-73(1994))连接。所述载体预先用限制酶XbaI切开，然后用虾碱性磷酸酶(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)去磷酸化。将该载体DNA与zwf缺失片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。
然后将大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1784-791，1993)用该连接批次物转化。将转化批次物铺板在补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual.2ndEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择携带质粒的细胞。
借助于High Pure质粒分离试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Deutschland)从转化体中分离质粒，并通过用限制酶XbaI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。另外，克隆的zwf缺失片段通过GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)测序核实。该质粒称作pK18mobsacB_zwfdelta90bp，示于图10。
19.3在菌株DM1697的zwf野生型基因中导入90碱基对缺失菌株DM1697在实施例17.1中描述，其携带zwf野生型基因。
将实施例19.2中描述的质粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp如实施例14.3所述通过接合移至谷氨酸棒杆菌菌株DM1697中(Schifer etal.，Applied and Environmental Microbiology 60，756-759(1994))。如实施例14.3所述针对谷氨酸棒杆菌DM1697染色体中靶定重组事件进行选择。依赖于二次重组事件的位置，在质粒切除后，携带90bp缺失的zwf等位基因出现在染色体zwf基因座，或者保留宿主原始的zwf基因座。
对大约40-50个菌落测试“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型。在示出“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型的30个菌落中，对跨越zwf缺失的zwf基因的一个区域通过聚合酶链反应扩增，使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，Hilden，Germany)通过Innis等所述标准PCR方法(PCRprotocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行，以论证染色体中存在zwf等位基因中90bp缺失。
PCR反应使用下述寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)进行zwfi1(SEQ ID NO48)5`-GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT-3`zwfi2(SEQ ID NO49)5`-GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT-3`这导致581bp大小的PCR片段扩增，表示存在90bp缺失，或者671bp大小的PCR片段扩增，表示存在zwf野生型序列。
扩增产物随后在0.8％琼脂糖凝胶中检测。
因此鉴别了含有zwf缺失等位基因的谷氨酸棒杆菌菌株，分离并将其称作DM1697deltazwf90bp。
19.4菌株DM1697deltazwf90bp的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了确定菌株DM1697deltazwf90bp中含有的zwf缺失等位基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将该菌株在LB培养基(MerckKG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在具有档板的250ml锥形瓶中在33℃以200rpm在摇床上进行的。为了进行比较，将亲代菌株DM1697平行保温。生物量的制备如实施例15.1所述进行。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系统中进行。以如前述相同方式计算酶活性。
实验结果示于表10。
表10
实施例20在菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因中导入90个碱基对缺失并确定编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性20.1在菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因中导入90个碱基对缺失将实施例19.2所述的质粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp如实施例14.3所述通过接合(Schfer et al.，Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，756-759(1994))移至谷氨酸棒杆菌菌株DM1698(见实施例18)。如实施例14.3所述针对谷氨酸棒杆菌DM1698染色体中的二次重组事件进行选择。依赖于二次重组事件的位置，在质粒切除后，携带90个碱基对缺失的zwf等位基因出现在染色体zwf基因座，或者保留宿主原始的zwf基因座。
对大约40-50个菌落测试“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型。在示出“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”的表型的30个菌落中，对跨越zwf缺失的zwf基因的一个区域通过聚合酶链反应扩增，使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，Hilden，Germany)通过Innis等所述标准PCR方法(PCRprotocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)进行，以论证染色体中存在zwf等位基因中的缺失。
使用如下所述寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)进行PCRzwfi1(SEQ ID NO48)5`-GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT-3`zwfi2(SEQ ID NO49)5`-GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT-3`
这导致携带90bp缺失、581bp大小的DNA片段形成，或者携带相应的zwf野生型序列、671bp大小的DNA片段形成。
扩增产物随后在0.8％琼脂糖凝胶中检测。
分离含有zwf缺失等位基因的谷氨酸棒杆菌菌株，并将其称作DM1698deltazwf90bp(A243T)。
将实施例19.2的质粒pK18mobsacB_zwfdelta90bp用于将90个碱基对缺失整合进菌株DM1698的zwf(A243T)等位基因。该质粒中含有的zwf缺失片段的核苷酸序列从其核苷酸序列(SEQ ID NO47)的第711-1554位具有野生型基因编码序列(SEQ ID NO9)的第91-934位核苷酸。它们编码zwf野生型蛋白质(SEQ ID NO10)的第31-311位氨基酸，包括在氨基酸序列第243位的野生型序列。接合的结果可能是菌株DM1698的zwf(A243T)突变在接合中由取代载体pK18mobsacB_zwfdelta90bp的zwf野生型等位基因取代。
为了核实突变zwf(A243T)仍存在于菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)的染色体中，借助于LightCycler(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)检测突变。
LightCycler组合了热循环仪和荧光检测设备。
通过Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)从菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)中分离染色体DNA。在第一阶段，借助于PCR反应(Innis et al.，PCR protocols.A guide to methods andapplications，1990，Academic Press)扩增DM 1698deltazwf90bp(A243T)染色体的大约0.3kb的DNA片段，其含有zwf(A243T)突变。PCR反应使用如下寡核苷酸(由MWG Biotech，Ebersberg合成)进行LC-zwfl(SEQ ID NO50)5′-tccgcatcgaccactatttg-3′LC-zwf2(SEQ ID NO51)
5′-cgctggcacgaaagaaattg-3′在第二阶段，使用两种不同大小的、用不同荧光标记物标记的寡核苷酸(LightCycler(LC)-Red640和荧光素)。在序列内发生杂交，突变zwf(A243T)位于其中。借助于“荧光共振能量转移(FluorescenceResonance Energy Transfer)”方法(FRED)，可以检测突变的存在。用于杂交的如下寡核苷酸由TIB MOLBIOL(Berlin，Germany)合成zwf243-C(SEQ ID No52)5`-LC-Red640-tatcttcagtcatggtgatc-(P)3`zwf243-A(SEQ ID No53)5`-gtcgtagtaaccagcacgtccacccaagcc-荧光素3`这样证实了菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)仍含有突变zwf(A243T)。其携带zwf等位基因zwfdelta90bp(A243T)，示于SEQID NO54；编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的相应氨基酸序列示于SEQID NO55。
20.2菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了确定菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)中含有的zwfdelta90bp(A243T)等位基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将该菌株在LB培养基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在具有档板的250ml锥形瓶中在33℃以200rpm在摇床上进行。为了进行比较，将具有zwf(A243T)等位基因的亲代菌株DM1698平行保温。生物量的制备如实施例15.1所述进行。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系统中进行。酶活性如前述相同方式计算。
实验结果示于表10。
表10
实施例21两个质粒编码zwf等位基因的表达的确定在这个实施例中，构建表达两个不同zwf等位基因的两个质粒，并测试在实施例20.1中获得的菌株DM1698zwfdelta90bp(A243T)失活的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性的恢复。测试的zwf等位基因是zwfL和zwfS，其中L是长的缩写，S是短的缩写。等位基因zwfL携带突变zwf(A243T)，包括zwf基因编码序列的5’区域的90个碱基对(如SEQ ID NO9所示野生型基因及SEQ ID NO21所示zwf(A243T)等位基因所示)。等位基因zwfS也携带突变zwf(A243T)，但是缺失zwf基因编码序列的5’区域的90个碱基对(如SEQ ID NO7所示野生型基因所示)。
21.1等位基因zwfS和zwfL的扩增zwf等位基因zwfS和zwfL使用聚合酶链反应(PCR)及如下述合成的寡核苷酸进行扩增。通过Tauch等所述方法(1995，Plasmid 33168-179)从菌株DM658中分离携带等位基因zwf(A243T)的染色体DNA。基于从实施例1已知的谷氨酸棒杆菌zwf基因的序列，选择引物以便扩增片段含有zwf等位基因的编码区及其上游区域的25个碱基对，而非可能的启动子区域。另外，插入使得可以克隆进靶载体中的适当的限制酶位点。PCR引物和插入的限制酶SalI切割位点(下划线序列)的序列如下所述zwfRBS1(SEQ ID NO56)5′-ATGTCGACAAG AAA GGA TCG TGA CAC TAC-3′zwfRBS2(SEQ ID NO57)5′-ATGTCGACCCC CCG CAT CGC TGG CC-3′zwfRBSE(SEQ ID NO58)5′-ATGTCGACATC GCT TTC GGA GTC AGT GA-3′示出的引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，通过Innis等所述标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)使用NewEnglandBiolabs(Germany，Product Description Vent DNA Polymerase)的Vent DNA聚合酶进行PCR反应。
借助于聚合酶链反应，引物zwfRBS1和zwfRBSE扩增出称作zwfL(SEQ ID NO60)的1732bp DNA片段(SEQ ID NO59)，其包括表达由514个氨基酸组成的Zwf蛋白质的编码序列。引物zwfRBS2和zwfRBSE扩增称作zwfS(SEQ ID NO62)的1642bp DNA片段(SEQ IDNO61)，其包括表达由484个氨基酸组成的Zwf蛋白质的编码序列。扩增物通过随后在0.8％琼脂糖凝胶中的琼脂糖凝胶电泳检测，使用High Pure PCR产物纯化试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)从琼脂糖凝胶中分离。
将获得的PCR产物克隆进载体pCRBluntII TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Germany)中，然后将大肠杆菌菌株TOP 10(Grant et al.，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA，87(1990)4645-4649)根据厂商指导用该连接批次物转化。将转化批次物铺板于补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2naEd.，Cold Spring Harbor，New York，1989)上，选择携带质粒的细胞。
借助于High Pure质粒分离试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)从转化体中分离质粒DNA，通过用限制酶SalI限制及随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。获得的质粒称作pCRBluntII_zwfL(示于图11)和pCRBluntII_zwfS(示于图12)。
21.2等位基因zwfS和zwfL在载体pZ8-1中的克隆应用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pZ8-1(EP 0 375 889)作为在谷氨酸棒杆菌以及在大肠杆菌中表达的基本载体。这个质粒的DNA用限制酶SalI(Invitrogen，Germany)完全切割，然后用虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)去磷酸化。
zwfL等位基因通过用限制酶SalI对实施例21.1中获得的载体pCRBluntII_zwfL进行完全切割而分离。zwfS等位基因通过用限制酶SalI对实施例21.2中获得的载体pCRBluntII_zwfS进行完全切割而分离。在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，借助于High Pure PCR产物纯化试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)从琼脂糖凝胶中分离大小大约1.7kb的zwfL片段和大小大约1.6kb的zwfS片段。
将分离自琼脂糖凝胶的zwfL片段和zwfS片段与如上述制备的载体pZ8-1混合，将批次物用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。
将连接批次物转化进大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，InDNAcloning.A Practical Approach.Vol.I.IRL-Press，Oxford，WashingtonDC，USA)中。将转化批次物铺板于补加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1190)上选择携带质粒的细胞。在37℃保温过夜后，选择重组的各个克隆。借助于High Pure质粒分离试剂盒t(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)根据厂商指导从转化体中分离质粒DNA，通过用限制酶SalI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检测。另外，使用如下引物通过GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)测序核实克隆的zwf等位基因GATC-R1neu-29234(SEQ ID NO63)5`-GGAACACAGAAGATTCTG-3`GATC-F1_neu-29233(SEQ ID NO64)5`-CCGTGTTACTGAGATTGC-3`GATC-zwf_int-27334(SEQ ID NO65)5`-TGGCTGAATCCACCGAAGAA-3`所得质粒称作pZ8-1_zwfL(示于图13)和pZ8-1_zwfS(示于图14)。
21.3制备菌株DM1698/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS将没有插入片段的载体pZ8-1通过Tauch等所述电穿孔方法(1994，FEMS Microbiological Letters，123343-347)电穿孔进谷氨酸棒杆菌DM 1698中。
将实施例21.2所述的载体pZ8-1_zwfL和pZ8-1_zwfS及没有插入片段的载体pZ8-1通过Tauch等所述的电穿孔方法(FEMSMicrobiological Letters，123(1994)343-347)电穿孔进实施例20所述的谷氨酸棒杆菌DM1698zwfdelta90bp(A243T)中。
将电穿孔批次物铺板在补加了15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)上选择携带质粒的细胞。在所有情况中，通过常规方法(Peters-Wendisch et al.，1998，Microbiology 144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，通过用限制酶SalI限制和随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。
菌株称作DM1698/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1、DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS。
21.4获得的菌株的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的确定为了确定菌株DM1698deltazwf90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL和DM1698deltazwf90bp(A243T)/pZ8-1_zwfS中含有的不同zwf等位基因编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，将菌株在补加了25mg/l卡那霉素的LB培养基(Merck KG，Darmstadt，Germany)中保温24小时。培养是以25ml体积在具有档板的250ml锥形瓶中在33C以200rpm在摇床上进行。
为了进行对比，将亲代菌株DM1698和如实施例20所述在染色体中具有两个不同zwf等位基因的菌株DM1698zwfdelta90bpA243T及具有载体pZ8-1的菌株DM1698/pZ8-1和DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1平行保温。由于DM1698和DM1698zwfdelta90bpA243T不含有任何质粒，因此它们用未加入卡那霉素的培养基保温。
生物量的制备如实施例15.1所述进行。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定在含有100mM Tris-HCl(pH 7.5)+1mM DTT、15mM MgCl2、1.5mM NADP+和10mM葡萄糖-6-磷酸的分析系统中进行。酶活性以如前述相同方式计算。
这个实验的结果示于表11。
表11
原始保藏的接受按照细则7.1由页底所示国际保藏单位公布
1应用细则6.4(d)，所述日期是国际保藏机构获得的日期。
表格DSMZ-BP/4(单页)0196
存活证明按照细则10.2由页底所示国际保藏单位公布
1表示原始保藏、进行新的保藏或转移日期、最近相关日期(新保藏日期或转移日期)2根据细则12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉号表示4信息已被要求并且测试结果为阴性表格DSMZ-BP/4(单页)0196
原始保藏的接受按照细则7.1由页底所示国际保藏单位公布
1应用细则6.4(d)，所述日期是国际保藏机构获得的日期。
表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
存活证明按照细则10.2由页底所示国际保藏单位公布
1表示原始保藏、进行新的保藏或转移日期、最近相关日期(新保藏日期或转移日期)2根据细则12.2(a)(i)和(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉号表示4信息已被要求并且测试结果为阴性表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
原始保藏的接受按照细则7.1由页底所示国际保藏单位公布
1应用细则6.4(d)，所述日期是国际保藏机构获得的日期。
表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
存活证明按照细则10.2由页底所示国际保藏单位公布
1表示原始保藏、进行新的保藏或转移日期、最近相关日期(新保藏日期或转移日期)2根据细则12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用叉号表示4信息已被要求并且测试结果为阴性表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
原始保藏的接受按照细则7.1由页底所示国际保藏单位公布
1应用细则6.4(d)，所述日期是国际保藏机构获得的日期。
表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
存活证明按照细则10.2由页底所示国际保藏单位公布
1表示原始保藏、进行新的保藏或转移日期、最近相关日期(新保藏日期或转移日期)2根据细则12.2(a)(i)利(ii)，指最近存活日期3符合的位置用义号表示4信息已被要求并且测试结果为阴性表格DSMZ-BP/4(单页)12/2001
序列表<110>德古萨股份公司<120>用扩增zwf基因制备L-氨基酸的方法<130>990239BT<160>65<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2811<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(373)..(2022)<223>pgi<400>1aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc120aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa180gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg240acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac300cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa360gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac411Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp
1 5 10att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac459Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn15 20 25ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc507Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala30 35 40 45gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag555Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys50 55 60aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa603Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu65 70 75gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac651Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His80 85 90ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt699Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu95 100 105cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat747Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp110 115 120 125gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc795Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg130 135 140tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc843Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val145 150 155aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag891Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys160 165 170gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc939Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser175 180 185aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca987Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala190 195 200 205gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag 1035Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu210 215 220acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc 1083Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu225 230 235ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct 1131Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala
240 245 250gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc1179Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe255 260 265tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt1227Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu270 275 280 285tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt1275Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly290 295 300gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag1323Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu305 310 315aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc1371Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe320 325 330tat ggt gca gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag gat ctc agc1419Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser335 340 345cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag1467Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys350 355 360 365tca gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att1515Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile370 375 380tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg1563Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu385 390 395atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct1611Ile His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala400 405 410cgt cca aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt1659Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu415 420 425ttg atg agc aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag1707Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys430 435 440 445aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac1155Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn450 455 460cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag1803His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu465 470 475gaa ctt acc cct tct att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac1851Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His
480 485 490acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa 1899Thr Val Met Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln495 500 505tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct 1947Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala510 515 520 525gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca 1995Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser530 535 540ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt2042Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa2102tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg2162ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc2222tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc2282catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat2342ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc2402tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt2462ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca2522tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc2582ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc2642gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg2702gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc2762aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc2811<210>2<211>550<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr1 5 10 15
Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala20 25 30Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr35 40 45Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu50 55 60Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly65 70 75 80Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn85 90 95Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu100 105 110Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu115 120 125Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn130 135 140Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly145 150 155 160Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg165 170 175Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp180 185 190Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr195 200 205Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser210 215 220Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu225 230 235 240Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val245 250 255
Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp260 265 270Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met275 280 285Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His290 295 300Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro305 310 315 320Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala325 330 335Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala340 345 350Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His355 360 365Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly370 375 380Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln385 390 395 400Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys405 410 415Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser420 425 430Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu435 440 445Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val450 455 460Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr465 470 475 480Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met485 490 495
Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val500 505 510Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly515 520 525Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys530 535 540Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550<210>3<211>462<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<400>3atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac120cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt180cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag240gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg300gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt360accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc420gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462<210>4<211>2160<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS
<222>(327)..(2063)<223>poxB<400>4ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt120ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt180gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg240aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac300aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu1 5att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val10 15 20 25ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att 449Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile30 35 40gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly45 50 55gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt 545Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys60 65 70ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg75 80 85aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag 641Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln90 95 100 105att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys110 115 120gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu125 130 135cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val140 145 150tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac 833Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp
155 160 165ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc 881Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe170 175 180 185ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala190 195 200aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala205 210 215cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg1025Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala220 225 230ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc1073Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly235 240 245atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag1121Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu250 255 260 265gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc1169Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe270 275 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile285 290 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala300 305 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser315 320 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330 335 340 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro350 355 360gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg1457Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val365 370 375ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc1505Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile380 385 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly
395 400 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410 415 420 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met430 435 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag1697Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys445 450 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met460 465 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn475 480 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490 495 500 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro510 515 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile525 530 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala540 545 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala555 560 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct 2160<210>5<211>579<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum
<400>5Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln1 5 10 15Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile20 25 30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn35 40 45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly50 55 60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu65 70 75 80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala85 90 95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln100 105 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu115 120 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile130 135 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr165 170 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala180 185 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys195 200 205Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu210 215 220Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile
225 230 235 240Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr245 250 255Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu260 265 270Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala275 280 285Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys290 295 300Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro305 310 315 320His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys325 330 335Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn340 345 350Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu355 360 365Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met370 375 380Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg385 390 395 400Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro405 410 415His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala420 425 430Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr435 440 445Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser450 455 460
Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu465 470 475 480Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala485 490 495Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu500 505 510Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile515 520 525Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu530 535 540Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly545 550 555 560Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile565 570 575Pro Thr Pro<210>6<211>875<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<400>6tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac120gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg180gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg240ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt300aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt360gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg420gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac480gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg540
gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca600gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta660gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct720attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat780gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc840cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875<210>7<211>2260<212>DNA<213>Brevibacterium flavum MJ-233<220>
<221>CDS<222>(629)..(2080)<223>Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase(EC 1.1.1.49)；JP-A-09-22461<400>7gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag120cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt180tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt240ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct300gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag360accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct420cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg480atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatcgtg540agcacaaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc aggataaacg600actcccccgc atcgctggcc cttccggc atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc 652Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly1 5gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca aac 700
Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn10 15 20cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc 748Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg25 30 35 40gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt 796Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser45 50 55gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc 844Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala60 65 70gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc 892Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe75 80 85gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc 940Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr90 95 100gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc gca 988Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala105 110 115 120gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa1036Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu125 130 135gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc1084Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu140 145 150gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa1132Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu155 160 165tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa1180Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln170 175 180aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg1228Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp185 190 195 200aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg gct gaa gat att1276Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile205 210 215ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc1324Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg220 225 230gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg1372Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met235 240 245gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag atc1420
Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile250 255 260aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc1468Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser265 270 275 280gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc aag1516Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys285 290 295gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag act1564Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr300 305 310ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg1612Phe Ala Ala CVs Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val315 320 325ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag1660Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu330 335 340att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc gac1708Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp345 350 355 360atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag cct1756Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro365 370 375gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc1804Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala380 385 390atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc1852Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe395 400 405act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctt atc ttg gat gcg ctg1900Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu410 415 420ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc1948Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser425 430 435 440tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa1996Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu445 450 455cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat gaa2044Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu460 465 470atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg 2090Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro475 480gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 2150
tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt2210cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc accaatgaag 2260<210>8<211>484<212>PRT<213>Brevibacterium flavum MJ-233<400>8Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His
165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr
405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>9<211>2259<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(538)..(2079)<223>Zwf-Protein<220>
<221>nucleotide guanine<222>(1264)..(1264)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<400>9gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag120cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt180
tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt240ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct300gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag360accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct420cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg480atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatc 537gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 585Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 633Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc 681Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg 729Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 777Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat 825Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt 873Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc 921Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att 969Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc gca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 1017Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 1065Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 1113Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190
aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg1161Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag1209Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc1257Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac1305Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc1353Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag1401Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac1449Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag1497Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1545Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1593Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1641Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1689Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1737Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1785Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1833Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430
tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1881Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctt atc ttg gat gcg ctg ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac1929Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1977Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt2025Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc2073Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taatttaggg gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag 2129Arg Procaaatttcca agaccctaac tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga 2189gtgctcaccc tcatcgtggt cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc 2249accaatgaag 2259<210>10<211>514<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>10Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Aspl 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>11<211>20
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf-forward<400>11tcgacgcggt tctggagcag 20<210>12<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf reverse<400>12ctaaattatg gcctgcgcca g 21<210>13<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Universal forward Primer<400>13gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>14<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>M13 reverse primer<400>14ytccacgccc caytgrtc 18<210>15<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal Primer 1<400>15ggaaacaggg gagccgtc 18<210>16<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Internal Primer 2<400>16tgctgagata ccagcggt 18<210>17<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>fwd.primer<400>17
atggarwcca aygghaa17<210>18<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>rev.primer<400>18ytccacgccc caytgrtc 18<210>19<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer poxBint1<220>
<221>misc_feature<223>Primer poxBint1<400>19tgcgagatgg tgaatggtgg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer poxBint2
<400>20gcatgaggca acgcattagc 20<210>21<211>1857<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(308)..(1849)<223>
<220>
<221>mutation<222>(1034)..(1034)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<220>
<221>nucleotide adenine<222>(1034)..(1034)<223>corresponds to position 727 of the coding sequence<400>21tcgacgcggt tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag 60aagctgacgc tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc120aggtcctgga gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt180ccatggaagc tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc240gaattagttc gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac300taccatc gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg 349Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu1 5 10
cgc gac ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc397Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly15 20 25 30atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc445Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu35 40 45ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc493Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe50 55 60tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa541Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu65 70 75aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt589Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg80 85 90gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc637Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly95 100 105 110aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag685Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys115 120 125cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg733Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu130 135 140tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt781Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg145 150 155tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc829Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile160 165 170gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag877Glu Lvs Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln175 180 185 190ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac925Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His195 200 205tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct973Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala210 215 220aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 1021Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val225 230 235cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 1069Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr240 245 250
tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc1117Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile255 260 265 270cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca1165Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro275 280 285gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg1213Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro290 295 300tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt1261Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly305 310 315tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc1309Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe320 325 330aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc1357Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile335 340 345 350acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag1405Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys355 360 365cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca1453Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala370 375 380cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac1501Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn385 390 395gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc1549Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe400 405 410ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg1597Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met415 420 425 430gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac1645Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr435 440 445gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct1693Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro450 455 460acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt1741Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu465 470 475gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg1789Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr480 485 490
tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc1837Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr495 500 505 510tgg cgc agg cca taatttag 1857Trp Arg Arg Pro<210>22<211>514<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>22Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>23<211>756<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(756)<223>Internal segment of the coding sequence of the zwf(A243T) allele<220>
<221>nucleotide adenine<222>(137)..(137)
<223>Corresponding to position 727 of the coding sequence of the zwf(A243T)allele<400>23agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct 60ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca120cgtccagatc accatgactg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg180catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc240catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct300ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc360cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga420gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg480tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt540ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca600aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa660ggttccaggt tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc720cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcct 756<210>24<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwf_XL-Al<400>24gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatc28<210>25<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer zwf_XL-E1<400>25gatctagaga ttcacgcagt cgagttag28<210>26<211>1763<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>PCR product<222>(1)..(1763)<223>
<400>26gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg840tccagatcac catggctgaa gatattgact tgggtggacg tgctggttac tacgacggca900
tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac1740tcgactgcgt gaatctctag atc1763<210>27<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zf_1<400>27ggcttactac ctgtccattc 20<210>28<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(R370M)allele<400>28gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175
cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 768Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt atg cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Met Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415
aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>29<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-Vitro mutagenesis<400>29Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Met Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>30
<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(V372A)allele<400>30gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 768Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gca act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Ala Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>31<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>31Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Ala Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510
Arg Pro<210>32<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(M242L)allele<400>32gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Ash Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly LVs Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc ctt gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Leu Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct 1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 1104
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>33<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>33
Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240
Thr Leu Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>34<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(M242S)allele<400>34gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc tca gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Ser Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro<210>35<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>35Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Ser Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>36<211>1545<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<220>
<221>CDS<222>(1)..(1542)<223>zwf(D245S)allele<400>36gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 96Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc144Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg192Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac240Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat288Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt336Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc384Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att432Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc480Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag528Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc576Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg624Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag672Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc720Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa tca att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac768Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc816Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag864Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac912
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct1008Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct1056Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt1104Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac1152Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc1200Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc1248Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc1296Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc1344Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac1392Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca1440Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt1488Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc1536Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa1545Arg Pro
<210>37<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Obtained by in-vitro mutagenesis<400>37Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>38<211>1763<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1763)<223>PCR-product<400>38gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120
ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg840tccagatcac catggctgaa gatattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca900tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct 1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg 1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt 1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg 1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg 1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa 1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg 1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct 1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat 1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc 1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa 1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg 1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1740tcgactgcgt gaatctctag atc 1763<210>39<211>1763
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product<220>
<221>mutation<222>(861)..(861)<223>nucleotide thymine，corresponding to position 733 of the codingsequence of the zwf(D245S)allele<220>
<221>mutation<222>(862)..(862)<223>nucleotide cytosine，corresponding to position 734 of the codingsequence of the zwf(D245S)-Allele<220>
<221>mutation<222>(863)..(863)<223>nucleotide adenine，corresponiding to position 735 of the codingsequence of the zwf(D245S)-Allele<400>39gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca120ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc180aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg240gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc300tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg360aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt420gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt480
tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact 540gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc 600gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt 660tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag 720aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg 780ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg 840tccagatcac catggctgaa tcaattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca 900tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct1020ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg1080gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt1140ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg1200tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg1260tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa1320acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg1380ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct1440tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat1500ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc1560ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa1620agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg1680gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac1740tcgactgcgt gaatctctag atc1763<210>40<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer DM_zwfD245Sa
<400>40agatcaccat ggctgaatca attggcttgg gtggac 36<210>41<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer DM_D245Sb<400>41gcacgtccac ccaagccaat tgattcagcc atggtg 36<210>42<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zf_2<400>42ttctgtgttc cgcatcgacc 20<210>43<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfA
<400>43attctagaca ccttgatctt ctccgttg28<210>44<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfB<400>44gatggtagtg tcacgatcct 20<210>45<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfC<400>45aggatcgtga cactaccatc atggtgatct tcggtgtca39<210>46<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfD
<400>46attctagagc ggaggtttta tccaatgg28<210>47<211>1560<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Productzwf deletion fragment<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(710)<223>upstream region of the zwf-gene<220>
<221>misc_feature<222>(711)..(1560)<223>Internal segment of the coding sequence of the zwf-gene(SEQ ID NO9)，starting from nucleotide 91 of the zwf gene.Nucleotide 711 is identically to nucleotide 1 of the coding sequence of the zwf-gene mentioned in JP-A-09-22461 as shown in SEQ ID NO7).
<400>47attctagaca ccttgatctt ctccgttgct cgctaccgcg aggtcatcgc tgcgttcatc 60gagggcatca agcaggctgc tgcaaacggc cacgacgtct ccaagatcca ctctgtggct120tccttcttcg tctcccgcgt cgacgttgag atcgacaagc gcctcgaggc aatcggatcc180gatgaggctt tggctctgcg cggcaaggca ggcgttgcca acgctcagcg cgcttacgct240gtgtacaagg agcttttcga cgccgccgag ctgcctgaag gtgccaacac tcagcgccca300ctgtgggcat ccaccggcgt gaagaaccct gcgtacgctg caactcttta cgtttccgag360ctggctggtc caaacaccgt caacaccatg ccagaaggca ccatcgacgc ggttctggag420cagggcaacc tgcacggtga caccctgtcc aactccgcgg cagaagctga cgctgtgttc480tcccagcttg aggctctggg cgttgacttg gcagatgtct tccaggtcct ggagaccgag540
ggtgtggaca agttcgttgc ttcttggagc gaactgcttg agtccatgga agctcgcctg 600aagtagaatc agcacgctgc atcagtaacg gcgacatgaa atcgaattag ttcgatctta 660tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cactaccatc atggtgatct 720tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa 780accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca 840aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc 900gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg 960atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca1020ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc1080accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca1140tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg1200cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc1260aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact1320acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt1380actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg1440ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga1500tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctctagaat1560<210>48<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfi1<400>48ggcgttgact tggcagatgt 20
<210>49<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer zwfi2<400>49gcagaccgct gtgaaggaat 20<210>50<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer LC-zwf1<400>50tccgcatcga ccactatttg 20<210>51<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Primer LC-zwf2<400>51cgctggcacg aaagaaattg 20<210>52<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Oligonucleotide zwf243-C<400>52tatcttcagt catggtgatc 20<210>53<211>30<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>Oligonucleotide zwf243-A<400>53gtcgtagtaa ccagcacgtc cacccaagcc 30
<210>54<211>1455<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>allele<222>(1)..(1455)<223>zwfdelta90bp(A243T)allele<220>
<221>CDS<222>(1)..(1452)<223>zwfdelta90bp(A243T)allele<400>54atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc 48Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc 96Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa144Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt192Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc240Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag288Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg336Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt384
Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc 432Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag 480Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac 528Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct 576Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 624Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 672Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc 720Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca 768Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg 816Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt 864Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc 912Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc 960Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag1008Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca1056Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac1104
Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc1152Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg1200Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac1248Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct1296Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt1344Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg1392Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc1440Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480tgg cgc agg cca taa1455Trp Arg Arg Pro<210>55<211>484<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>55Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45
Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly275 280 285
Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>56<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer zwfRBS1<400>56atgtcgacaa gaaaggatcg tgacactac 29<210>57<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfRBS2<400>57atgtcgaccc cccgcatcgc tggcc 25<210>58<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Primer zwfRBSE<400>58atgtcgacat cgctttcgga gtcagtga28<210>59<211>1732<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfL
<220>
<221>CDS<222>(34)..(1575)<223>zwf-allele zwfL<400>59atgtcgacaa gaaaggatcg tgacactacc atc gtg agc aca aac acg acc ccc54Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro1 5tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac ccg cag gat aaa cga ctc ccc102Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro10 15 20cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac150Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp25 30 35ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc198Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg40 45 50 55gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa246Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu60 65 70tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct294Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala75 80 85ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag342Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu90 95 100ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac390Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp105 110 115aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc438Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala120 125 130 135ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg486Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala140 145 150gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa534Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu155 160 165gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa582Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu170 175 180tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct630
Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Pne Pro Glu Ser185 190 195tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac 678Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn200 205 210 215atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac 726Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn220 225 230tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg act gaa gat att ggc 774Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly235 240 245ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac 822Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp250 255 260gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa 870Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu265 270 275gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag 918Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys280 285 290 295gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct 966Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala300 305 310cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga1014Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly315 320 325ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag act ttt1062Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe330 335 340gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg1110Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro345 350 355ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att1158Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile360 365 370 375gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg1206Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met380 385 390act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat1254Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp395 400 405gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg1302Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met410 415 420gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act1350
Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr425 430 435gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta1398Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu440 445 450 455gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg1446Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp460 465 470aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca1494Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro475 480 485gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg1542Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met490 495 500ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg gcaaaaaatg 1595Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro505 510atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac tcgactgcgt 1655gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt cactgactcc 1715gaaagcgatg tcgacat 1732<210>60<211>514<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfL<400>60Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>61
<211>1642<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfS<220>
<221>CDS<222>(34)..(1485)<223>zwf-allele zwfS<400>61atgtcgaccc cccgcatcgc tggcccttcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act54Met Val Ile Phe Gly Val Thr1 5ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca102Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala10 15 20aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc150Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg25 30 35cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca198Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala40 45 50 55agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc246Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu60 65 70gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct294Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala75 80 85ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc342Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly90 95 100acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc390Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe105 110 115aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc438Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr120 125 130 135gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac486
Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn140 145 150ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca534Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro155 160 165gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt582Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val170 175 180caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg630Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu185 190 195tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg act gaa gat678Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp200 205 210 215att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc726Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala220 225 230cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc774Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala235 240 245atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag822Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys250 255 260atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc870Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr265 270 275tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc918Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val280 285 290 295aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag966Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu300 305 310act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt 1014Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly315 320 325gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act 1062Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr330 335 340gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc 1110Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly345 350 355gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag 1158Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln360 365 370 375cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct 1206
Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser380 385 390gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc1254Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser395 400 405ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg1302Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala410 415 420ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg1350Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu425 430 435agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga1398Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly440 445 450 455gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat1446Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp460 465 470gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg 1495Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro475 480gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1555tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt 1615cactgactcc gaaagcgatg tcgacat 1642<210>62<21l>484<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR-Product zwfS<400>62Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu1 5 10 15Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe20 25 30Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu35 40 45
Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg50 55 60Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly65 70 75 80Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys85 90 95Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu100 105 110Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg115 120 125Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile130 135 140Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln145 150 155 160Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His165 170 175Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala180 185 190Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val195 200 205Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile225 230 235 240Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro245 250 255Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro260 265 270Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly
275 280 285Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe290 295 300Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile305 310 315 320Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys325 330 335Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala340 345 350Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn355 360 365Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe370 375 380Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met385 390 395 400Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr405 410 415Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro420 425 430Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu435 440 445Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr450 455 460Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr465 470 475 480Trp Arg Arg Pro<210>63<211>18<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>Primer GATC-R1_neu-29234<400>63ggaacacaga agattctg 18<210>64<211>18<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>Primer GATC-F1_neu-29233<400>64ccgtgttact gagattgc 18<210>65<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)
<223>Primer GATC-zwf_int-27334<400>65tggctgaatc caccgaagaa 20
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少在第369-373位的一或多个氨基酸和/或在第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少选自如下一组的一或多个氨基酸由任何其它蛋白质氨基酸置换第370位的L-精氨酸、第372位的L-缬氨酸、第242位的L-甲硫氨酸、第243位的L-丙氨酸、第244位的L-谷氨酸和第245位的L-天冬氨酸。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其编码选自如下一组的一种蛋白质包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸置换；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第242位的L-甲硫氨酸由L-亮氨酸置换；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第242位的L-甲硫氨酸由L-丝氨酸置换；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第245位的L-天冬氨酸由L-丝氨酸置换；包含SEQ IDNO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第370位的L-精氨酸由L-甲硫氨酸置换及包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质，其中至少第372位的L-缬氨酸由L-丙氨酸置换。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO22的氨基酸序列的至少第241-246位氨基酸及任选地SEQ ID NO10的氨基酸序列的第1-10位氨基酸的蛋白质。
5.权利要求3的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO21的核苷酸序列的第308-1849位核苷酸。
6.权利要求1的分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO33、35和37的氨基酸序列之一的至少第237-250位氨基酸及任选地SEQ IDNO10的氨基酸序列的第1-10位氨基酸的蛋白质。
7.权利要求3的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO32、34和36的核苷酸序列之一的第1-1542位核苷酸。
8.权利要求1-7任一项的分离的多核苷酸，其中所述编码的蛋白质具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。
9.权利要求8的分离的多核苷酸，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性对NADPH的抑制作用有抗性。
10.权利要求5或6的分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO21、33、35和37之一的序列或其编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的蛋白质的片段组成。
11.权利要求10的分离的多核苷酸，其编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的蛋白质，其中所述蛋白质包含至少SEQ ID NO10的N末端序列的第1-10位氨基酸。
12.一种包含权利要求1-11任一项的分离的多核苷酸的细菌。
13.权利要求12的细菌，其中所述分离的多核苷酸包含在所述细菌的染色体中。
14.权利要求13的细菌，其中所述细菌是棒状细菌或大肠杆菌。
15.一种包含权利要求1-11任一项的分离的多核苷酸的载体。
16.权利要求15的载体，其中所述载体是质粒。
17.一种分离的细菌，其包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多个氨基酸和/或第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换。
18.权利要求17的分离的细菌，其包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，其中选自如下一组的至少一或多个氨基酸由任何其它的蛋白质氨基酸置换第370位的L-精氨酸、第372位的L-缬氨酸、第242位的L-甲硫氨酸、第243位的L-丙氨酸、第244位的L-谷氨酸及第245位的L-天冬氨酸。
19.权利要求17的分离的细菌，其包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，其中至少第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸置换。
20.权利要求17的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质包含至少SEQ ID NO22氨基酸序列的第241-246位氨基酸。
21.权利要求17的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包含至少SEQ ID NO10氨基酸序列的第1-10位氨基酸及SEQ ID NO22氨基酸序列的第241-246位氨基酸。
22.权利要求17的分离的细菌，其包含一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO22核苷酸序列的第308-1849位核苷酸。
23.权利要求17的分离的细菌，其包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，其中至少第245位的L-天冬氨酸由L-丝氨酸置换。
24.权利要求17的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质包含至少SEQ ID NO33、35和37氨基酸序列之一的第237-250位氨基酸。
25.权利要求17的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包含至少SEQ ID NO10氨基酸序列的第1-10位氨基酸及SEQ ID NO33、35和37氨基酸序列之一的第237-250位氨基酸。
26.权利要求17的分离的细菌，其包含一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO32、34和36序列之一的第1-1542位核苷酸。
27.权利要求17-26任一项的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。
28.权利要求27的分离的细菌，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性对NADPH的抑制作用有抗性。
29.权利要求17-26任一项的分离的细菌，其包含编码一种蛋白质的多核苷酸，其中所述蛋白质的N末端甲硫氨酸在所述细菌中进行加工期间被除去。
30.权利要求17-26任一项的分离的细菌，其中所述细菌是棒状细菌。
31.谷氨酸棒杆菌DM658，保藏号为DSM7431。
32.谷氨酸棒杆菌DSM5715zwf2_A243T，保藏号为DSM15237。
33.谷氨酸棒杆菌DSM1697_zwfD245S，保藏号为DSM15632。
34.一种通过发酵分离的棒状细菌制备氨基酸的方法，包括a)发酵生产氨基酸的细菌，该细菌包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多个氨基酸和/或第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换；和b)浓缩培养基中或细菌细胞中的氨基酸。
35.权利要求28的方法，其中所述细菌包含编码包含SEQ IDNO22的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。
36.权利要求34的方法，其中所述细菌包含编码包含SEQ IDNO33、35和37氨基酸序列之一的蛋白质的多核苷酸。
37.一种通过发酵棒状细菌制备氨基酸的方法，包括如下步骤a)发酵生产氨基酸的细菌，该细菌包含编码包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的分离的或重组的多核苷酸，其中至少第369-373位的一或多个氨基酸和/或第241-246位的一或多个氨基酸由另外的蛋白质氨基酸置换；及b)浓缩培养基中或细菌细胞中的氨基酸。
38.权利要求32的方法，其中所述分离的多核苷酸编码包含SEQID NO22的氨基酸序列的蛋白质。
39.权利要求37的方法，其中所述分离的多核苷酸编码包含SEQID NO33、35和37氨基酸序列之一的蛋白质。
40.一种通过发酵分离的棒状细菌制备氨基酸的方法，包括a)发酵包含一种多核苷酸的生产氨基酸的细菌，所述多核苷酸编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、包含至少SEQ ID NO22的第241-246位氨基酸或者SEQ ID NO33、35和37的第237-250位氨基酸的蛋白质；b)浓缩培养基中或细菌细胞中的氨基酸。
41.一种通过发酵棒状细菌制备氨基酸的方法，包括如下步骤a)发酵包含一种分离或重组的多核苷酸的生产氨基酸的细菌，所述多核苷酸编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、包含至少SEQ IDNO22的第241-246位氨基酸或者SEQ ID NO33、35和37的第237-250位氨基酸的蛋白质；和b)浓缩培养基中或细菌细胞中的氨基酸。
42.权利要求34-41任一项的方法，其中所述氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸。
43.权利要求34-42任一项的方法，其包含分离所述L-氨基酸。
44.权利要求40-41任一项的方法，其中所述蛋白质进一步包含SEQ ID NO10的N末端序列的第1-10位氨基酸。
45.权利要求34-41任一项的方法，其中由poxB基因编码的丙酮酸氧化酶的胞内活性额外地被降低或关闭。
46.权利要求34-41任一项的方法，其中由pgi基因编码的葡萄糖-6-磷酸异构酶的胞内活性额外地被降低或关闭。
全文摘要
本发明涉及通过发酵棒状细菌制备L－氨基酸的方法，所述方法包括进行如下步骤a)发酵生产L－氨基酸的细菌，其中至少zwf基因是扩增的；b)浓缩培养基或者细菌细胞中的L－氨基酸，及c)分离产生的L－氨基酸。
文档编号C12N15/77GK1906291SQ200480041034
公开日2007年1月31日 申请日期2004年1月29日 优先权日2004年1月29日
发明者斯特凡·汉斯, 布里吉特·巴斯, 亚历山大·雷特, 格奥尔格·蒂尔巴赫, 卡罗琳·克罗伊策, 贝蒂娜·黑德里希 申请人:德古萨股份公司