拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1和其碱基序列的制作方法

专利名称：拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1和其碱基序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗逆转录调控因子AtbZIPl和其碱基序列。
背景技术：
低温、干旱和盐碱等非生物胁迫严重影响作物的产量与质量，是制约我国农业生 产和亟待解决的重要问题。在对植物逆境信号传导的研究中发现，转录因子发挥着至关重要的作用。 在胁迫 刺激下它们不断合成，并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化 的改变。其中，DREB类和bZIP类转录因子是植物中参与非生物胁迫反应的重要的转录因 子。DREB类转录因子可以和许多胁迫诱导基因上游的DRE/CRT及AREB顺式作用元件相结 合，从而调控胁迫诱导基因的表达，如RD17，RD29A，RD29B，C0R15A和C0R15B等。bZIP类转 录因子可与胁迫诱导基因上游的AREB元件相结合，参与ABA依赖的信号传导途径。Chinnusamy等利用图位克隆的手段，在拟南芥icel突变体中分离了 ICEl转录因 子，编码一个MYC类的bHLH蛋白，它能与CBF/DREB基因的启动子结合而激活CBF/DREB的 转录。Thomashow等对CBF2上游启动子序列进行分析发现在CBF2上游-189 -65的区 域含有三个关键的蛋白识别位点ICErl (CACATG) XACGTG核心序列、ICEr2 (ACTCCG)。研究 表明，单独的ICErl或是ICEr2元件对低温只有微弱的应答反应，而这两段序列协同作用， 对低温却有明显的应答。ICErl的核心序列包括了 bHLH蛋白的识别位点CANNTG，其可能是 ICEl蛋白的结合位点。但目前还未分离得到能够与ICEr2元件相结合的转录因子，对该元 件的核心序列也没有科学的验证。

发明内容
本发明的目的是为了解决目前还未获得能够与ICEr2元件相结合的转录因子，因 此对ICEr2元件没有科学的验证的缺陷，而提供的一种拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 和其碱基序列。本发明拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨基 酸序列之一①如SEQ ID NO 1 所示；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。上述拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的碱基序列所编码的拟南芥抗逆转录调 控因子AtbZIPl具有非生物胁迫抗性。本发明拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl与ICEr2顺式作用元件相互作用可提高 植物抗逆性能。本发明将拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的基因导入植物细胞，可获得对非生 物胁迫耐受能力增强的转基因细胞系及转基因植株。使用AtbZIPl·构建植物表达载体 时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物 中表达的选择性标记基因(GUS基因，荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大 霉素标记物，卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基 因，直接以逆境筛选转化植株。本发明拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl受多种非生物胁迫诱导，拟南芥抗逆 转录调控因子AtbZIPl基因超表达的拟南芥幼苗较野生型植株表现出较高的盐，渗透， 冷胁迫抗性，但超表达植株幼苗对碱的耐受力较野生型弱。拟南芥抗逆转录调控因子 AtbZIPl基因超表达的拟南芥幼苗对ABA处理表现为不敏感，说明拟南芥抗逆转录调控因 子AtbZIPl基因通过ABA非依赖途径提高了植物对干旱，低温，盐渍等非生物胁迫的抵抗能力。


图1是具体实施方式
三中重组酵母不同浓度的SD/-Trp/-His固体培养基上的生 长结果图，图2是具体实施方式
四步骤一中重组酵母在含50mM 3-AT的SD/_Hi s/-Leu/-Trp 平板上划线培养的结果图，图3是具体实施方式
五中各阳性转化子在SD/-Trp和 SD/-Trp/-His培养基上划线培养的结果图，图4是具体实施方式
六中亚细胞定位载体pCEG 的载体图谱，图5是具体实施方式
六中拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl在植物细胞内的 亚细胞定位分析的激光共聚焦显微镜观察图，图6是具体实施方式
七步骤四中琼脂糖凝胶 电泳检测检测结果图，图7是具体实施方式
八步骤一 3中琼脂糖凝胶电泳检测检测结果图， 图8是具体实施方式
四步骤三中拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl突变体重组酵母在含 50mM 3-AT的SD/-His/-Leu/-Trp平板上划线培养的结果图，图9是具体实施方式
四步骤二 1中SDS-PAGE电泳检测结果图，图10是具体实施方式
四步骤二 3的检测结果图，图11是具 体实施方式八步骤二 1中抗盐实验结果图，图12是具体实施方式
八步骤二 2中抗渗透胁迫 实验结果图，图13是具体实施方式
八步骤二 3中抗低温胁迫实验结果图，图14是具体实施 方式八步骤二 4中ABA敏感性实验结果图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl具有非生物胁迫 抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ ID NO 1 所示；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。本实施方式中拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的氨基端第13至93位氨基酸残 基序列为bZIP结构域，在该结构域有一个BR结构域(氨基端第13至38位氨基酸残基序 列)和一个LZ结构域(氨基端第39至93位氨基酸残基序列)，属于Sl亚家族。本实施方式②中取代、缺失或叠加氨基酸的数量在10个以内，且氨基端第16 26 位氨基酸残基不可缺失。
具体实施方式
二 本实施方式拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的碱基序列所编码的拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl具有非生物胁迫抗性。本实施方式拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的碱基序列所编码的拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl可提高植物抗逆性能，并与ICEr2顺式作用元件相互作用。在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 所述高严谨条件可为用0. IX SSPE (或0. 1XSSC),0. 1% SDS的溶液，在65 °C下杂交并洗膜。携带有本实施方式AtbZIPl基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植 物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞 或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
具体实施方式
三本实施方式按以下步骤获得拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 的基因一.拟南芥cDNA文库的构建1.拟南芥总RNA的提取和mRNA的分离选取饱满的野生型拟南芥种子(哥伦比亚生态型)，消毒并春化后播种于1/2MS 培养基上(滤纸桥培养法)，待幼苗生长至22天时，分别对幼苗进行低温(4°C )，盐(200mM NaCl)和干旱(30% (W/V)的 PEG6000)处理。用 plant RNAprep Plant Kit(TIANGEN, cat no :DP402)试剂盒提取上述拟南芥幼苗的总RNA，然后用Nucleo Trap mRNA Kits(Clontech, cat no 740655)从上述拟南芥的总RNA中分离出mRNA。2.拟南芥cDNA文库的构建以步骤1获得的拟南芥幼苗mRNA为模板，用BD Matchmaker LibraryConstruction & Screening Kits (Clontech, cat no 630445)试剂盒并严格按照 试剂盒说明书进行操作构建拟南芥cDNA文库。二 .用酵母单杂交法从拟南芥cDNA文库中筛选AtbZIPl基因1. 4mer ICEr2 诱饵载体及 4mer mutant ICEr2 载体的构建l)4mer ICEr2诱饵载体构建在ICEr2顺式元件ACTCCG两端设计保护碱基，5’端加入AGA，3’端加入CGT。并 将加完保护碱基后的序列设计成串联四联体。最后根据PHIS2载体上多克隆酶切位点，在 串联四联体两端加入酶切位点，5’端为EcoRI，3’端为SacI。人工设计合成ICEr2顺式作 用元件，序列如下所示ICEr2sense :5，-AATTCAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTAGAACTCCGCGTGA GCT-3'ICEr2anti-sense :5，-CACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTACGCGGAGTTCTG -3，将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸用50mM NaCl配制成 0. 1 μ g/ μ L的溶液，分别吸取5 μ L的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液加入 0. 2mL离心管中，吹打混勻，94°C变性5min，然后缓慢冷却至室温。将IyL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入载体DNA和外源DNA 片段，使摩尔比为1 1，70°C水浴处理lOmin。室温下加入1 μ LT4DNA连接酶，轻弹外壁混 勻，短暂快速离心，16°C过夜。加入10 μ L IM NaCl并将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，经鉴定获得诱饵载体pHIS-ICEr2。2)4mer mutant ICEr2 载体构建以ICEr2顺式元件ACTCCG为基础，分别设计两个突变元件，其中一个是单碱基突 变，即将ACTCCG中的第4位C突变为A ；另一个是完全突变，即将ACTCCG中的A突变为C， T突变为G。同样，根据PHIS2载体上多克隆酶切位点，在串联四联体两端加入酶切位点，5’ 端为EcoR 1,3'端为SacI。人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件，序列如下所示mlICEr2(单碱基突变)mlICErl-1 :5，-AATTCAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTAGAACTACGCGTGAG CT-3'mlICErl-2 :5’ -CACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTACGCGTAGTTCTG-3，m2ICEr2(完全突变)m21CEr2-1 5，-AATTCAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTAGACAGAATCGTGAG CT-3'm2ICEr2-2 :5’ -CACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTACGATTCTGTCTG-3，采用上述方法，将突变元件插入到报告质粒载体pHIS2中，分别获得 pHIS-mlICEr2 和 pHIS_m2ICEr2。2.诱饵载体pHIS_ICEr2的3-AT浓度的选择采用LiAc法制备酵母感受态细胞，并用小量LiAc/PEG法将诱饵载体pHIS_ICEr2 转化酵母感受态，将转化子分别接种到含不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp平板培养基上 30°C培养。发现重组酵母在含有 0mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM 3-AT 的 SD/-Trp/_His 固体培养基上可以生长出一些菌落，而在35mM 3-AT的SD/-Trp/-His固体培养基上只能长 出几个菌落，在40mM 3-AT的SD/-Trp/-His固体培养基上则不能生长(试验结果如图1所 示)。由于过高的3-AT会抑制或杀死刚转化的酵母细胞，因此，我们把35mM的3-AT浓度作 为抑制酵母HIS3渗漏表达的最适浓度。3.拟南芥cDNA文库的筛选采用LiAc法制备酵母感受态细胞，并用小量LiAc/PEG法将cDNA文库， pGADT7-Rec2和pHIS2_ICEr2共转化酵母AH109，将转化子接种到含有35mM 3-AT的 SD/-Hi s/-Leu/-Trp 平板培养基上，30°C 培养 3 7 天。用引物 AD-LD sense (5，-CTAT TCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3’)和 AD-LD anti (5，-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTAT CTACGAT-3，)PCR鉴定获得阳性转化子。将阳性克隆重新划线培养，在含50mM 3-AT的 SD/-His/-Leu/-Trp平板上连续分离2 3代(每代30°C倒置培养4 6天)。用BD Yeastmaker Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech, cat no :630441)提取阳性克隆的 质粒并转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒，酶切鉴定获得阳性克隆并送交测序。测序结果表明 通过酵母单杂交获得了与诱饵载体中ICEr2顺式作用元件相结合的文库蛋白的编码基因 如SEQ ID No 2所示，由907个碱基组成，其开放阅读框架为5’端第317 第751位碱基， 编码具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸残基序列的蛋白质。对其所编码的蛋白进行氨基 酸残基序列分析，发现其氨基端第13至93位氨基酸残基序列为bZIP结构域，在该结构域 有一个BR结构域(氨基端第13至38位氨基酸残基序列)和一个LZ结构域(氨基端第39 至93位氨基酸残基序列)，属于Sl亚家族。
具体实施方式
四本实施方式按以下步骤进行拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 与ICEr2元件的结合特异性分析一 .拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl在酵母细胞内与ICEr2元件的结合特异性 分析从上述测序正确地阳性克隆中分离得到pGADT7-Rec2-bZIPl载体。将重组载体 pHIS-mlICEr2 或 pHIS_m2ICEr2 和 pGADT7_Rec2_bZIPl 共转化酵母菌株 AH109,并通过 PCR 鉴定分别得到重组酵母AH109/mlICEr2/bZIPl和AH109/m2ICEr2/bZIPl。分别将重组酵母 AH109/ICEr2, AH109/ICEr2/bZIPl, AH109/mlICEr2/bZIPl 和 AH109/m2ICEr2/bZIPl 在含 50mM 3-AT的SD/-His/-Leu/-Trp平板上划线，30°C培养3 7天，结果如图2所示，只有重 组酵母AH109/ICEr2/bZIPl能够正常生长，而其余重组酵母生长都受到明显抑制。该结果 表明AtbZIPl在酵母体内能够特异性结合ICEr2元件，从而激活报告基因HIS3的表达。
二 .拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl与ICEr2元件的体外结合的功能性分析1.拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl重组蛋白的获得将拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl基因的全长⑶S区克隆到原核表达载体 pET32b (Novagen)中，并将重组表达载体转化Ε. coli BL21，在37°C下经0. ImM IPTG诱导表 达2 3h，将表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明AtbZIPl重组蛋白得到表达。采 M ProBond Purification System(Invitrogen, cat no :K850-01) X^iiW AtbZIPl MM 蛋白进行纯化，并进行SDS-PAGE电泳检测(检测结果如图9所示)，-20°C保存，用于凝胶 阻滞实验(EMSA)。2. ICEr2元件的地高辛标记采用 Roche 公司的 DIG DNA Labeling and Detection Kit (cat no 1093657)对 ICEr2元件进行地高辛标记。将人工合成的ICEr2元件正义链寡核苷酸和反义链寡核苷 酸溶液(0. lyg/yL)各取8yL置于0. 2mL离心管中，95°C变性lOmin，缓慢冷却至室温 使其退火，然后加入4yL检测试剂盒中的随机引物标记试剂，其中含有Hexanucleotide mixture, Klenow enzyme 和 dNTIP lablingmixture，37°C反应过夜，4°C保存备用。3. AtbZIPl蛋白与DNA结合反应及非变性SDS-PAGE检测在15 μ L结合反应体系中含标记的探针1 μ L，AtbZIPl纯化蛋白8 μ L，小牛胸腺 DNA lyL，10X结合缓冲液1.5yL和ddH20 3. 5 μ L，将其混合后25°C反应30min。其中 IOX结合缓冲液的成分如下=TriS-HCl (pH值为7. 6)浓度为20mmol/L，KCl浓度为30mmol/ L, Tween 20 浓度为 0. 2% (ff/V), EDTA 浓度为 lmmol/L，DTT 浓度为 lmmol/L，(NH4)2SO4 浓度 为lOmmol/L。然后加入3 μ L上样缓冲液(含0. 025%溴酚蓝的无菌水)，进行非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测。5%聚丙烯酰胺凝胶的配方为30%丙烯酰胺(1.2mL)，5X电泳缓冲 液 TBE (0. 75mL), 10% APS (52. 5 μ L)，TEMED (5 μ L)，ddH20 (5. 2mL)。待胶凝好后，用 1 X 电 泳缓冲液TBE预电泳15min (42V)，然后上样，继续电泳3h (电压为42V)。电泳结束后，仔细 移去上层玻璃板，将与胶大小相同的带正电荷的干燥尼龙膜(Milipore)直接铺在胶上，用 玻璃棒赶走气泡，然后放置三层滤纸，再次赶走气泡。最后压上200g以上得重物，转膜lh。 转膜后，仔细除去膜上粘着的胶块，将膜夹在两层滤纸之间，120°C烘干30min以固定DNA或 DNA-蛋白复合物。然后将膜在冲洗缓冲液中洗1 5min，于20mL封闭液中温浴30min，加入 抗体4 μ L，在冲洗缓冲液中洗2次，每次15min，然后再20mL检测缓冲液中平衡2 5min，最后在颜色反应液中黑暗温浴，直至出现可见的清晰条带。结果如图10所示，仅有ICEr2 元件时没有条带(如图10中的“2”泳道)，当加入目的蛋白后出现了一条明显的滞后条带 (如图10中的“3”泳道)，说明在体外AtbZIPl蛋白仍能够与ICEr2元件结合。三.拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl突变体与ICEr2元件的体内结合以 pGADT7-Rec2-bZIPl 质粒为模板，PCR扩增 AtbZIPl 突变体 bZl、bZ2、bZ3 和 bZ4。 其中，bZl突变体缺失拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl氨基端第3 12位氨基酸残基， bZ2突变体缺失拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl氨基端第16 26位氨基酸残基，bZ3突 变体将拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl氨基端第15 18位氨基酸残基Glu-Lys-Lys替 换为Gly-Pro-Arg，bZ4突变体在拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl氨基端第15位氨基酸 残基Glu之前添加了 Gly-Pro-Arg三个氨基酸残基。将AtbZIPl突变体bZl、bZ2、bZ3和 bZ4 分别连接入 pGADT7 载体得到 pGADT7_bZl，pGADT7_bZ2，pGADT7_bZ3，和 pGADT7_bZ4。 将上述载体分别与pHIS2-ICEr2共转化酵母菌株AH109，并通过PCR鉴定分别得到重组 酵母 AH109/ICEr2/bZl，AH109/ICEr2/bZ2, AH109/ICEr2/bZ3 和 AH109/ICEr2/bZ4。将以 上重组酵母和重组酵母AH109/ICEr2 (阴性对照)，AH109/ICEr2/bZIPl (阳性对照)分别 在SD/Trp/Leu/His液体培养基中摇菌，将菌液稀释100倍后，并将每0. 5 μ L菌液滴到含 50mM 3-AT的SD/Trp/Leu/His固体培养基上，30°C培养3 7天，结果如图8所示，重组酵 母 AH109/ICEr2/bZIPl (阳性对照)，AH109/ICEr2/bZl，AH109/ICEr2/bZ3 和 AH109/ICEr2/ bZ4都可以正常生长，而重组酵母AH109/ICEr2/bZ2和AH109/ICEr2 (阴性对照)都不能生 长。结果表明氨基端第16 26位氨基酸残基的缺失后，AtbZIPl缺失突变体在酵母体内 不能与ICEr2元件结合。通过对AtbZIPl结构分析表明该区域位于其BR结构域中，该区域 是AtbZIPl与ICEr2元件结合的区域。
具体实施方式
五本实施方式按以下步骤进行拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 在酵母体内的转录激活实验将拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl基因全长⑶S区克隆到酵母表达载体 PGBKT7 (Trp+)中，得到重组酵母表达载体命名为pGBKT7_bZIPl，然后采用小量LiAc/PEG 法将pGBKT7-bZIPl，pGBKT7(阴性对照)，PGBKT7_DREB1C (阳性对照)分别转化酵母菌株 AH109,经PCR鉴定得到阳性转化子。分别将各阳性转化子在SD/-Trp和SD/-Trp/-His培 养基上划线培养，培养结果如图3所示，所有酵母细胞都能够在SD/-Trp培养基上正常生 长；含有pGBKT7-bZIPl的酵母细胞，和阳性对照PGBKT7-DREB1C —样可以在SD/-Trp/_His 选择培养基上生长，而阴性对照则不能正常生长。说明AtbZIPl具有自激活能力，可以激 活下游报告基因HIS的表达，从而让可以在SD/-Trp/-His选择培养基上生长。进一步 蓝白斑实验也证实了这一点。将SD/-Trp培养基上重组酵母细胞采用滤纸影印法影印到 Whatman滤纸上，将滤纸放入液氮中15s，然后恢复到室温使细胞裂解，然后将滤纸浸润在 2. 5mLZ-buffer/X-GAL溶液中，30°C培养观察蓝白斑。其中，Z-buffer (pH值为7. 0)主要 成分为 Na2HPO4 · 7H20 浓度为 16. lg/L，NaH2PO4 · H2O 浓度为 5. 50g/L, KCl 浓度为 0. 75g/ L, MgSO4 · 7H20 浓度为 0. 246g/L。Z-buffer/X-GAL 溶液的主要成分为20mL Z-buffer、 0. 054mL β-巯基乙醇和67 μ L 20mg/mL X-GAL stocksolution。试验结果结果说明含有 pGBKT7-bZIPl的酵母细胞和阳性对照PGBKT7-DREB1C能够产生蓝斑，而阴性对照则不能产 生蓝斑，进一步说明拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl在酵母体内的具有转录激活特性。
具体实施方式
六本实施方式按以下步骤进行拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 在植物细胞内的亚细胞定位分析将拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl基因全长⑶S区克隆到亚细胞定位载体 pCEG(载体图谱如图4所示)，得到AtbZIPl亚细胞定位载体pCEG_bZIPl。采用冻融法将 pCEG-bZIPl，pCEG(阴性对照)和pCEG_bZIP24(阳性对照)分别转化农杆菌EHA105，PCR 鉴定得到阳性转化子。用重组农杆菌浸润烟草叶片，过渡培养3天后，用激光共聚焦显微镜 (SP5 ；Leica,Germany)观察488nm下荧光信号，结果如图5所示，说明拟南芥抗逆转录调控 因子AtbZIPl蛋白定位于细胞核，与阳性对照pCEG-bZIP24定位相同，而阴性对照pCEG则 无定位倾向。
具体实施方式
七本实施方式按以下步骤进行拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 在非生物胁迫条件下的表达特性分析
一、拟南芥幼苗的处理选取饱满的野生型拟南芥种子(哥伦比亚生态型)，用体积浓度为5%的次氯酸钠 消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播种于1/2MS培养基上(滤纸桥培养法)，待幼 苗生长至22天，进行下述不同条件的处理1)盐处理用浓度为2001111的恥(1溶液处理幼苗，分别处理011，111，311，611，1211， 24h，分别取处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用或者 直接提取RNA。2)模拟干旱处理用30% (ff/V)PEG6000溶液处理幼苗，分别处理0h，lh，3h，6h， 12h，24h，分别取处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用 或者直接提取RNA。3)低温处理将幼苗置于4°C冷藏柜中进行低温处理，分别处理0h，lh，3h，6h， 12h，24h，分别取处理后的幼苗的地下和地上部分，在液氮中迅速固定，放在-80°C保存待用 或者直接提取RNA。二、拟南芥幼苗的RNA提取及基因组DNA的去除1.取经上述步骤一不同方法处理后的拟南芥幼苗材料各lOOmg，液氮研磨，用 plant RNAprep Plant Kit (TIANGEN, cat no :DP402)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。2.采用TaKaRa公司的DNase I于37°C反应20 30min，去除RNA中的基因组DNA。 反应体系如下RNA 40 μ L, IOXDNase I Buffer 5 μ L, DNaseI 2 μ L, RNAase Inhibitor 0. 5μ L, RNAase-free ddH20 2· 5 μ L03.加入50 μ L的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，用体积浓 度为70%乙醇洗沉淀2次，将RNA溶于40 μ L无菌RNAase-freeddH20。4.通过电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和完整度。三、RT-PCR法统一模板DNA浓度1. mRNA的反转录以步骤二提取的经不同处理的拟南芥幼苗的RNA为模板，采用 ReverseTranscriptase M-MLV RNase H-(TaKaRa, cat no :D2639A)试剂盒反转录合成 cDNA。取RNA 5yL, Oligo dT 1 μ L，混勻后70°C变性lOmin，迅速置于冰上冷却，然后加 Λ 5XM-MLV Buffer 2 μ L, dNTP (IOmM) 0. 5 μ L, M-MLV ReverseTranscriptase 0. 25 μ L,RNAase Inhibitor 0. 25 μ L, RNAase-free ddH20 1 μ L,混勻后 42 "C 保温 lh，70 "C 保温 15min，4°C储存备用。2.模板cDNA的含量调平根据GenBank上登录的拟南芥肌动蛋白基因(Accession·. AT3G18780)设计如下 引物Actin sense 5’ -CCTCCGTCTTGACCTTGC-3’Actin antisense :5， -AGCGATACCTGAGAACATAGTG-3，以步骤三1中获得的经不同处理的拟南芥幼苗的cDNA为模板，PCR扩增拟南芥内 参基因内参基因(肌动蛋白基因)，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。然后根据PCR产物的电泳 结果对模板cDNA进行稀释，调整模板cDNA的用量，直至内参基因扩增出的DNA条带的量基 本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。四、AtbZIPl基因的扩增根据AtbZIPl基因序列设计引物，序列如下AtbZIPl sense 5， -TCTTGATCCTCGCAAAATCACAG-3，AtbZIPl antisense :5， -GTACGTCTACAATCTCCAACCGCTA-3，以步骤三统一浓度后的经不同处理的拟南芥幼苗的cDNA为模板，PCR扩增拟南芥 AtbZIPl基因，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测检测结果如图6所示，表 明AtbZIPl基因的表达受盐，干旱和低温的诱导。
具体实施方式
八本实施方式按以下步骤进行拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl 基因的拟南芥转化及转基因植株的生理分析实验一 .拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl基因的拟南芥转化及转基因植株的检测1. AtbZIPl基因的植物表达载体的构建及农杆菌的转化通过PCR扩增在AtbZIPl基因的全长⑶S区两侧分别引入Swa I和SmaI酶切位 点，与酶切后的PreC1008载体连接，转化大肠杆菌DH5 α，经PCR检测与酶切鉴定，得到植 物表达载体，命名为PreC1008-bZIPl，并送交测序。将测序正确的阳性克隆转化至农杆菌 LBA4404,并PCR鉴定得到阳性转化子，用于侵染拟南芥植株。2. AtbZIPl基因的拟南芥转化1)拟南芥的培养将拟南芥种子(哥伦比亚生态型)4°C春化3 7天后，播种于营养钵中(营养土、君子兰土和蛭石按1 1 1的体积比混合)，置于温室中培养(22°C，光照16h/天)，待拟 南芥抽出出生苔后，剪去出生苔，待其抽出更多的次生苔且花开较盛时，可用于下述转化。2)农杆菌的培养挑取转化有PreC1008_bZIPl的重组农杆菌单菌落接种于5mL YEB (利福平的浓度 为50mg/L、链霉素的浓度为50mg/L、氯霉素的浓度为80mg/L)液体培养基中，28°C 230r/min 培养30h，按1 100体积比转接入500mL新鲜的YEB(利福平的浓度为50mg/L、链霉素的 浓度为50mg/L、氯霉素的浓度为80mg/L)液体培养基中，28°C 230r/min培养16 24h，测 得0D600 1.5 ；4°C、5000r/min离心IOmin收集菌体，然后重悬于500mL质量浓度为5% 蔗糖溶液(含0.02% silwet-77)中。3)转化拟南芥
将已经结夹的花蕾剪掉，把花序倒置浸入步骤2)所得的含有重组农杆菌的蔗糖 溶液中30s，转化完毕后，将植株套上塑料袋保湿，水平放置于低光强度下生长24h，即可正 常培养。一周后，重复侵染一次，可提高转化效率。4)收集种子进行筛选将侵染后所收集的种子进行消毒春化后，播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体 培养基上。待种子萌发后，将绿色的阳性植株(TO代)移栽至营养钵(营养土、君子兰土和 蛭石按1 1 1的体积比混合)中培养，并收 集种子进行T1代筛选。3.转基因拟南芥的PCR检测采用CTAB法提取转基因拟南芥植株的基因组DNA，并根据PreC1008中HPT II基 因序列设计引物，引物序列如下HPT sense 5， -GTTTGTTTGGTTGCCTTTGC-3，HPT antisense :5， -GCGTGTCAGCGTATCTATTCA-3，以转基因拟南芥的基因组DNA为模板，PCR扩增HPT II基因，并进行琼脂糖凝胶 电泳，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7所示，转基因植株同阳性对照一样，都扩增出了约 1300bp的目的条带。二 . AtbZIPl转基因拟南芥的生理分析实验1.抗盐实验选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)和AtbZIPl超量表达拟南芥种子， 用5%次氯酸钠消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播种于含有IOOmMNaCl的1/2MS 固体培养基上，两周后观察表型(结果如图11所示)。AtbZIPl超量表达拟南芥幼苗的根 长比野生型植株长，叶子也比野生型植株大，说明AtbZIPl超量表达拟南芥植株具有更强 的抗盐能力。2.抗渗透胁迫实验选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)和AtbZIPl超量表达拟南芥种子， 用体积浓度为5%的次氯酸钠消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播种于含有200mM 甘露醇的1/2MS固体培养基上，两周后观察表型(结果如图12所示)。AtbZIPl超量表达 拟南芥幼苗的生长状态要比野生型植株好，具有较长的根和较大的叶子，说明AtbZIPl能 够提高植株的抗渗透胁迫能力。3.抗低温胁迫实验选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)和AtbZIPl超量表达拟南芥种子， 用5%次氯酸钠消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播种于V2MS固体培养基上， 置于4°C培养，两周后观察表型(结果如图13所示)。AtbZIPl超量表达拟南芥幼苗的生 长状态要比野生型植株好，具有绿色的叶子，而野生型拟南芥的叶子已经变成紫色，说明 AtbZIPl能够提高植株的抗低温胁迫能力。4. ABA (脱落酸)敏感性实验选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)和AtbZIPl超量表达拟南芥种子， 用5%次氯酸钠消毒液消毒IOmin后，于4°C春化3 7天，播种于含有0. 5 μ m ABA的1/2MS 固体培养基上，两周后观察表型(结果如图14所示)。AtbZIPl超量表达拟南芥和野生型 拟南芥幼苗的生长都受到了明显的抑制，超量表达拟南芥植株并未表现出更强的抗性。说明AtbZIPl能够提高植株的抗低温胁迫能力。序列表<110>东北农业大学<120>拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl和其碱基序列<160>17<210>1<211>145<212>PRT<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Ala Asn Ala Glu Lys Thr Ser Ser Gly Ser Asp lie Asp Glu Lys151015Lys Arg Lys Arg Lys Leu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg202530Leu Lys Lys Gln Lys Leu Met Glu Asp Thr lie His Glu lie Ser Ser354045Leu Glu Arg Arg lie Lys Glu Asn Ser Glu Arg Cys Arg Ala Val Lys505560Gln Arg Leu Asp Ser Val Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Ser Glu65707580Lys lie Trp Leu Ser Ser Tyr Val Ser Asp Leu Glu Asn Met lie Ala859095Thr Thr Ser Leu Thr Leu Thr Gln Ser Gly Gly Gly Asp Cys Val Asp100105110Asp Gln Asn Ala Asn Ala Gly lie Ala Val Gly Asp Cys Arg Arg Thr115120125Pro Trp Lys Leu Ser Cys Gly Ser Leu Gln Pro Met Ala Ser Phe Lys130135140Thr145<210>2<211>907<212>DNA<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2TTCTCCCACT TTCCTTATTT TCGATCTTAT CCTTATCTTC TTCCTTGTTC TATTTCTCTT 60CTAACTAATC TCTTCTCTTC TCTTAAAATC AAACGTAATC ATAAATAAAG ATCTTCTTGT 120TTAATTTCTC TTGATCCTCG CAAAATCACA GATTCTTGAA ATTCTTTTTT CTTGTCTTGA 180
AATTCTTGAG TTCTTGAGTT ATGAAAAGAC AATGGACAGA GTTATGAAAT GATAAATCTC 240
AACCAATTCC TTGTTTATCA TTCTATATCA GTTGTGATTC TTCATTGGTT TTACGTTATC 300TCTTGAACAA AAAAACATGG CAAACGCAGA GAAGACAAGT TCAGGTTCCG ACATAGATGA 360GAAGAAAAGA AAACGCAAGT TATCAAACCG CGAATCTGCA AGGAGGTCGC GTTTGAAGAA 420ACAGAAGTTA ATGGAAGACA CGATTCATGA GATCTCCAGT CTTGAACGAC GAATCAAAGA 480GAACAGTGAG AGATGTCGAG CTGTAAAACA GAGGCTTGAC TCGGTCGAAA CGGAGAACGC 540GGGTCTTAGA TCGGAGAAGA TTTGGCTCTC GAGTTACGTT AGCGATTTAG AGAATATGAT 600TGCTACGACG AGTTTAACGC TGACGCAGAG TGGTGGTGGC GATTGTGTCG ACGATCAGAA 660CGCAAACGCG GGAATAGCGG TTGGAGATTG TAGACGTACA CCGTGGAAAT TGAGTTGTGG 720TTCTCTACAA CCAATGGCGT CCTTTAAGAC ATGAGATTTG TGTATTAGTG TGTGTTTTAC 780TTTGGTCATT TTATAGTTTT TGTAATCTTT TTATATCGAA TTGTTTCTTC TCATTACTTT 840CTGAATTCTG ATACAATTGC ATATCTTATT GTTTTCAACA TTTTCATTTA ACGTTATATG 900ATTTTCG 907<210>3<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成ICEr2顺式作用元件ICEr2 sense序列。<400>3AATTCAGAAC TCCGCGTAGA ACTCCGCGTA GAACTCCGCG TAGAACTCCG CGTGAGCT 58<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成ICEr2顺式作用元件ICEr2 anti-sense序列。<400>4CACGCGGAGT TCTACGCGGA GTTCTACGCG GAGTTCTACG CGGAGTTCTG 50<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件mlICEr2 (单碱基突变)序列。<400>5AATTCAGAAC TACGCGTAGA ACTACGCGTA GAACTACGCG TAGAACTACG CGTGAGCT 58<210>6<211>58<212>DNA
<213>人工序列<220><223>人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件mlICErl_l序列。<400>6AATTCAGAAC TACGCGTAGA ACTACGCGTA GAACTACGCG TAGAACTACG CGTGAGCT 58<210>7<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件mlICErl_2序列。<400>7CACGCGTAGT TCTACGCGTA GTTCTACGCG TAGTTCTACG CGTAGTTCTG 50<210>8<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件m2ICEr2_l (完全突变)序列。<400>8AATTCAGACA GAATCGTAGA CAGAATCGTA GACAGAATCG TAGACAGAAT CGTGAGCT 58<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工设计合成的突变ICEr2顺式作用元件m2ICEr2_2 (完全突变)序列。<400>9CACGATTCTG TCTACGATTC TGTCTACGAT TCTGTCTACG ATTCTGTCTG 50<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>拟南芥cDNA文库的筛选阳性转化子PCR鉴定引物AD-LD sense序列。<400>10CTATTCGATG ATGAAGATAC CCCACCAAAC CC 32<210>11
<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220><223>拟南芥cDNA文库的筛选阳性转化子PCR鉴定引物AD-LD anti序列。
0238]<400>11GTGAACTTGC GGGGTTTTTC AGTATCTACG AT 32<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据GenBank上登录的拟南芥肌动蛋白基因设计的引物Actin sense的序 列。<400>12CCTCCGTCTT GACCTTGC 18<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据GenBank上登录的拟南芥肌动蛋白基因设计的引物Actin antisense 的序列。<400>13AGCGATACCT GAGAACATAG TG 22<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtbZIPl基因序列扩增引物AtbZIPl sense的序列。<400>14TCTTGATCCT CGCAAAATCA CAG 23<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtbZIPl 基因序列扩增引物 AtbZIPl antisense 的序列。<400>15
GTACGTCTAC AATCTCCAAC CGCTA 25<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据pFGC1008中HPT II基因序列设计引物HPT sense的序列。<400>16GTTTGTTTGG TTGCCTTTGC 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据pFGC1008中HPT II基因序列设计引物HPT antisense的序列。<400>17GCGTGTCAGC GTATCTATTC A 2权利要求
拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1，其特征在于拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ ID NO1所示；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。
2.如权利要求1所述拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的碱基序列，其特征在于拟南 芥抗逆转录调控因子AtbZIPl的碱基序列所编码的拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIPl具有 非生物胁迫抗性。
全文摘要
拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1和其碱基序列，它涉及一种抗逆转录调控因子AtbZIP1和其碱基序列。它解决目前还未获得能够与ICEr2元件相结合的转录因子，因此对ICEr2元件没有科学的验证的缺陷。拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1具有非生物胁迫抗性，并具有下列氨基酸序列之一①如SEQ IDNO1所示；②在①限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸。拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1的碱基序列所编码的拟南芥抗逆转录调控因子AtbZIP1具有非生物胁迫抗性。本发明可用于转基因工程。
文档编号C12N15/11GK101812123SQ20091007319
公开日2010年8月25日 申请日期2009年11月12日 优先权日2009年11月12日
发明者孙晓丽, 季佐军, 才华, 朱延明, 李勇, 柏锡, 纪巍 申请人:东北农业大学