拟南芥MYB家族转录因子AtMYB84基因、编码序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体为一种拟南芥MYB家族转录因子AtMYB84基因、编码序列及其应用。具体包括基因AtMYB84的克隆、含有该基因的表达载体构建、基因AtMYB84基因器官表达模式，不同激素、不同胁迫处理后AtMYB84的表达量的变化。本发明还公开了基因AtMYB84在的突变体对盐干旱等胁迫敏感，而过表达材料对上述胁迫表现出抗性，同时过表达株系的根系发达。该基因AtMYB84可用于植物品种改良。
【专利说明】拟南芥MYB家族转录因子基因、编码序列及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种在拟南芥中表达的MYB家族转录因子AtMYB84基因编码序列及其应用，具体包括:MYB家族转录因子基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，对拟南芥此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于拟南芥Col-O内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。
【背景技术】
[0002]MYB是植物转录因子中最大的家族之一，大多数植物的MY B以在其N端含有一段约51-52个氨基组成的MYB结构域为共同特征，MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域，这个结构域通常是由至多4个氨基酸残基序列的重复(R)组成，每一个都形成3个α -螺旋，每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有3个有规律的间隔色氨酸残基(或疏水的)的螺旋一转角一螺旋(HTH)结构，形成一个3 D (HTH)疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。
[0003]MYB基因家族在不同的物种中存在结构和序列上的差异，甚至同一物种中的MYB家族也发生了多个分支。杨树与陆地棉水稻和拟南芥的部分MYB序列高度同源，但是拟南芥的MYB家族序列却发生很大的变化，产生多个分支，具有了多样的功能。根据相邻的MYB结构域的数目MYB转录因子可简单分成4个亚类，包括只含有一个R结构域的，R2R3结构域的，R1R2R3结构域的，四个类似R1/R2结构域的。[0004]MYB转录因子的生物学功能很广泛，MYB在拟南芥中已经有很多报道，主要集中于次生代谢调节、抗逆性的研究等，具有广泛的转录调节作用。主要包括，植物初生和次生代谢的调控，控制细胞的成长和分化，调控植物体对生物和非生物胁迫反应和参与植物生长过程的信号转导。大多数MYB转录因子是基因表达的正调控因子，但是也有一部分是负调控因子。目前除了拟南芥，大豆、棉花、玉米、栽培稻、矮牵牛、葡萄、白杨和苹果中都有报导MYB家族转录因子的功能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出一种新的拟南芥基因，还提供该拟南芥基因的蛋白编码序列，并提供该拟南芥基因的应用。
[0006]本发明通过克隆拟南芥中MYB家族转录因子基因，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示基因在各个器官中均有表达。在接受ABA、ACC和GA激素处理后的表达量上升；盐胁迫处理I天、干旱处理I夭MMYB84的表达量上升；在NAA激素和DTT处理I天后，AtMYB84的表达量并没有变化。将A mm转入拟南芥Col-O后，观察到转基因株系根系比野生型要发达，而且突变体表现出对盐胁迫敏感，该结果表明AtMYB84基因在种在拟南芥抗性中起作用，同时为研究拟南芥根系发育过程打下基础，从而为通过提高作物抗性和根系发达，实现产量提高提供基因来源与技术支持。[0007]本发明首先从拟南芥中克隆出一种新的MYB家族转录因子基因，命名为Ji#7泌为具有特定序列的DNA分子，其中ORF为1.467kbp，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0008]本发明还提供这种拟南芥AtMYB84的启动子序列，有2467bp，其核酸序列为SEQID N0.2 所示。
[0009]本发明还提供这种拟南芥AtMYB84蛋白编码序列，该序列编码310个氨基酸残基，分子量35.59kDa，等电点为7.32，氨基酸序列为SEQ ID N0.3。
[0010]本发明还提供用于调取获得拟南芥样品中基因财的一对核苷酸引物。该引物根据基因设计，使用此对引物对拟南芥样品cDNA进行PCR扩增可获得长
1.467kbp的基因片段。具体的引物序列为:
Forward Primer:5’ GGATCCTAGTCTCCTTTTTTCTTTTCTG 3’ (β_Η I) (SEQ ID N0.4)
Reverse Primer:5' CTGCAGTATCTAAATGTGATTACTTCGC 3’ (Pst I ) (SEQ ID N0.5)。
[0011]本发明还提供用于调取获取拟南芥样品中基因AtMYB84启动子的一对核苷酸引物。
该引物序列为:
Forward Primer:5' TGATTCGTGAAACTATGAGTTG 3’ (SEQ ID N0.6)
Reverse Primer:5' ACTTGTACTCCTAGTGAAGTCTTG 3’ (SEQ ID N0.7)。
[0012]本发明还提供检测拟南芥基因财在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因的核苷酸序列作为设计引物的保守区段，调取其序列的引物序列:
Forward Primer:5’GCTTTGCCTCAAAAGATT3’ (SEQ ID N0.8)
Reverse Primer:5’CCACCATGTTTGATGTTT3’ (SEQ ID N0.9)。
[0013]对拟南芥cDNA样品进行Real-timePCR，然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品为拟南芥的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下:
(1)提取拟南芥器官的总RNA(Trizol，市售)；
(2)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，根据SEQID N0.8和SEQ IDN0.9设计引物，根据SEQ ID N0.1，跨越ORF区和3'UTR的160bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。
[0014]本发明还提供检测拟南芥基因财在高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将拟南芥进行高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理后，提取拟南芥叶片中的RNA ;利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.8与SEQ IDN0.9，进行定量PCR检测。其步骤如下:
(1)将两周大的拟南芥苗置于300mM氯化钠1/2MS中，28°C培养0h、3h、6h、12h、24h以进行高盐胁迫处理；置于1/2MS中，4°(:培养011、311、611、1211、2411以进行低温处理；置于ΙΟμΜΝΑΑ、50μΜ ΑΒΑ、50μΜ 6Α,50μΜ ACC 中，23° C 分别培养 0h、3h、6h、12h、24h 以进行激素处理；置于30%PEG中，23° C培养0h、3h、6h、12h、24h以进行干旱胁迫处理；置于37° C培养0h、3h、6h、12h、24h进行处理；
(2)提取前述处理的拟南芥苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售);
(3)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，引物SEQID N0.8和SEQ IDN0.9，根据SEQ ID N0.1，跨越ORF区和3'UTR的308bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。[0015]本发明还提供构建pCAMBIA2301 ~AtMYB84表达载体的方法，其步骤如下:
(1)以pCRBlunt沒财载体质粒为模板，利用:SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5设计引物，克隆出含有SEQ ID N0.1的序列；
(2)将上述序列构建到pCAMBIA2301载体中，酶切位点分别为5’ - BamH I，
3’ -Pst I。经转化，进行阳性克隆的PCR验证。
[0016]本发明还提供构建pCAMBIA1300达载体的方法，其步骤如下:
利用引物SEQ ID N0.6，SEQ ID N0.7克隆出含有SEQ ID N0.2的序列，通过 5’- Sal I，3’ -BamH I 连接到 1300-GUS 载体上。
[0017]本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。
[0018]可见，本发明提供的拟南芥基因可用于植物品种改良，如用于改善作物抗低温、干旱胁迫、激素胁迫的等性能，促进根系发育，从而增加固着力，抗倒伏等性状，最后提高作物产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1拟南芥J tMYB84的器官表达模式分析。其中，
图1 (a)为J tMYB84在拟南芥不同器官中的GUS染色表达谱；
图1 (b)为半定量RT-PCR分析为不同器官J的表达谱；
图1 (c)为定量RT-PCR分析不`同器官中AtMYB84的表达谱。
[0020]图2拟南芥AtMYB84在不同胁迫下的表达谱。其中，
图2 (a)在PEG处理条件下AtMYB84表达谱；
图2 (b)在NaCl处理条件下AtMYB84表达谱。
[0021]图3拟南芥AtMYB84在不同激素处理下的表达谱。其中，
图3 (a)为目标基因AtMYB84受ABA处理的表达谱；
图3 (b)为目标基因AtMYB84受ACC处理的表达谱。
[0022]图4 AtMYB84转基因拟南芥株系与野生型拟南芥Col-O转录水平分析。
[0023]图5 AtMYB84转基因拟南芥株系S2-84-1#与野生型拟南芥WT在1/2MS0平板上的根系生长情况分析。其中，
图5 (a)为S2-84-1#与WT在正常条件下根长势比较；
图5 (b)根数目的统计。
[0024]图6 myb84突变体与野生型拟南芥WT幼苗的NaCl胁迫长势分析。其中，
图6 (a)分别为突变体与WT在200mM条件下的存活率；
图6 (b)为存活率统计结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如 Sambrook 等分子克隆:实验手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。[0026]实施例1拟南芥基因A tMYB84的克隆
1.拟南芥品种Col-O在温室中培养:生长条件为光周期16h /8h (L/D)，23°C ；
2.RNA提取。取100毫克左右新鲜的拟南芥植物组织材料，液氮充分研磨。加I mlTrizol试剂，润旋15 s后室温放置5 min。加0.2 ml氯仿,去蛋白，12000rpm离心IOmin后上清转移至新的离心管,加等体积异丙醇,充分混匀，室温放置10 min, 12k rpm离心lOmin，弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇I ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5-10 min，溶于20 μ I DEPC水中，测OD值，电泳检测；
3.基因的克隆。通过对应的拟南芥的基因进行生信分析，设计引物。以逆转录的拟南芥cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID N0.1。
[0027]实施例2拟南芥J ?#7泌^基因器官表达模式分析
分别提取拟南芥花、果实、茎生叶、莲座叶，茎、根等中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，该基因为组成型表达，在根和花中表达量最高(图1( a)、(b))。
[0028]实施例3 拟南芥基因沒财在干旱、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析
对两周大的拟南芥幼苗分 别进行300mM氯化钠1/2MS中，28° C培养0h、3h、6h、12h、24h以进行高盐胁迫处理；置于1/2MS中，4°C培养0h、3h、6h、12h、24h以进行低温处理；置于ΙΟμΜ ΝΑΑ、50μΜ ΑΒΑ、50μΜ 6Α,50μΜ ACC 中，23° C 分别培养 0h、3h、6h、12h、24h 以进行激素处理；置于30%PEG中，23°(:培养011、311、611、1211、2411以进行干旱胁迫处理；置于37° C培养0h、3h、6h、12h、24h进行处理。，分别提取叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，不同胁迫处理中，只有PEG和NaCl处理诱导AtMYB84表达(图2 (a)、图2 (b))；不同激素处理，目标基因财受ABA和ACC的诱导(图3 (a)、图3 (b))。
[0029]实施例4 J?#7泌^转基因拟南芥的分子鉴定
分别提取35S:AtMYB84株系及野生型Col-O对照组中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8，进行实时荧光定量PCR检测(图 4)。
[0030]实施例5拟南芥基因沒财转基因株系和野生型在正常条件下根系分析 AtMYB84过表达植株和野生型生长在MSO上15天后，统计根长和根数目(图5 (a)，图
5(b))。
[0031]实施例6 J?#7沒财对盐胁迫抗性的分析
1.突变体和野生型WT的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加200mM NaCl以及未添加NaCl的MS培养基上，同时置于23° C培养箱培养，4天后拍照；
2.观察统计存活率。
[0032]结果显示，突变体对盐胁迫敏感(图6(a)、图6 (b))。
[0033]参考文献
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【权利要求】
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从拟南芥中克隆出的基因，记为全长1467bp，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
2.—种分尚出的DNA分子，其特征在于，为从拟南芥中克隆出的启动子，记为AtMYB84pro，全长2467，其核苷酸序列为SEQ ID N0.2。
3.一种基因编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码310个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID N0.3。
4.一对用于调取获得拟南芥基因的引物序列，其特征在于，根据核苷酸序列为SEQ ID N0.1的基因沒财设计，序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
5.一对用于构建pCAMBIA23011i#7泌^载体的引物序列，其特征在于，根据核苷酸序列为SEQ ID N0.1的基因J?#7沒财开放阅读框设计，含有及I/Pst I酶切位点，序列如SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 所示。
6.一对用于构建1300-AtMYB84pro-GUS载体引物序列，其特征在于，根据核苷酸序列为SEQ ID N0.2的启动子设计，含有I/BanM I酶切位点，序列如SEQ ID N0.6和SEQID N0.7 所示。
7.一种检测拟南芥基因Ji#7^^mRNA表达模式的方法，其特征在于利用核苷酸序列SEQ ID N0.1作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.9，对拟南芥cDNA样品进行Real-time PCR，然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品为拟南芥的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下: 提取拟南芥不同器官的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，进行定量 PCR 检测。
8.一种检测拟南芥在低温、干旱、高盐`胁迫以及植物激素处理后，基因财表达含量变化的方法，其特征在于具体步骤为:将拟南芥进行低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，提取拟南芥的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ IDN0.8和SEQ ID N0.9，进行定量PCR检测。
9.一种检测拟南芥Col-O在转入基因后，拟南芥中基因表达含量变化的方法，其特征在于具体步骤为:提取转入核苷酸序列为SEQ ID N0.1的基因和野生型对照组拟南芥的总RNA ;利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ IDN0.8和SEQ ID N0.9，进行定量PCR检测。
10.核苷酸序列为SEQID N0.1的拟南芥基因在植物品种改良中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103667316SQ201310695172
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】明凤, 卢松冲, 奚丹丹, 张璇 申请人:复旦大学