具有体内示踪和肿瘤治疗作用的转基因细胞及其制备方法
【专利摘要】一种具有体内示踪和肿瘤治疗作用的转基因细胞及制备方法。所述细胞是一种由人脐带来源的间充质干细胞，该细胞能够进行肿瘤治疗，同时具有分子成像功能，经瘤内注射后能够在活体状态下实时监测其在体内分布和存活情况。具体说是将海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-自杀基因胸苷激酶三融合基因转染入人脐带来源的间充质干细胞，借助活体成像系统收集荧光素信号来监测其对Nude小鼠乳腺癌模型的靶向治疗；对注射了转染三融合基因的间充质干细胞的小鼠给予胸苷激酶的底物更西洛韦，通过旁观者效应诱导间充质干细胞周围肿瘤细胞的死亡。
【专利说明】具有体内示踪和肿瘤治疗作用的转基因细胞及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞治疗领域,涉及一种具有体内示踪和肿瘤治疗作用的细胞。
【背景技术】
[0002]目前，乳腺癌已经成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤之一，严重地威胁着女性的身心健康。在当今技术条件下，其原发肿瘤病灶可以通过手术进行根治，但是手术给患者带来极大的痛苦。目前对乳腺癌多应用化疗进行治疗，大多数化疗药物并不能够特异性地作用于肿瘤细胞，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时也会对正常细胞产生一定杀伤作用，导致严重毒副作用，患者往往并不能获得长期生存，且治疗费用昂贵，给患者带来沉重经济负担。目前对于肿瘤治疗迫切需要找到一种能够靶向肿瘤病灶部位的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响，成功应用这种载体将显著提高肿瘤治疗效果，降低副作用。近年来有研究应用骨髓、胚胎或脐带中分离得到的内皮细胞前体细胞进行试验性地肿瘤靶向治疗，虽然被证实具有一定的有效性，但这类内皮前体细胞来源有限且不易获得，难以应用于临床。人脐带来源的间充质干细胞具有自我更新和分化的能力，其在体外能够进行扩增，如果能够被证实具有肿瘤靶向性，将对应用于临床治疗具有重要意义。此外，为了观测肿瘤的生长情况，并监测载体细胞在体内的分布、增殖和机体排斥的过程，可以应用体内分子成像技术进行追踪，其具有微创、直观、动态观察的特点，并能够对同一只动物在不同时间点进行监测，能够很好地评估靶向治疗的效果。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于解决目前应用于试验性肿瘤靶向治疗的临床局限性，提供一种具有能够进行体内示踪并具有肿瘤治疗作用的转基因细胞以及制备方法。
[0004]本发明提供的具有体内示踪和肿瘤治疗作用的转基因细胞，是由人脐带来源的间充质干细胞、经携带有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表达载体转染后构建而成，该细胞能够进行体内示踪，并在给予胸苷激酶底物更西洛韦后诱导转基因细胞的凋亡。
[0005]本发明所涉及的细胞制备和肿瘤靶向治疗、体内示踪的方法通过以下步骤实现:
[0006]1、本发明所述的具有肿瘤治疗作用并且能够进行体内示踪的转基因细胞的制备方法，
[0007]其具体步骤为:
[0008]第1、构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有
[0009]Bsd抗性的慢病毒表达载体；
[0010]第2、用293T细胞铺六孔板，密度为1.5X IO6细胞/孔，用于转染；
[0011]第3、用lipo-2000将第I步中构建的三融合基因慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染入第2步前铺板的293T细胞；
[0012]第4、第3步293T细胞转染16小时后更换新鲜DMEM培养基(CORNING货号:10-017-CVR)，换液后24小时收集病毒上清，储于_80°C冰箱备用；
[0013]第5、用人脐带来源的间充质干细胞铺六孔板，密度为IX IO5细胞/孔，用于病毒感染；
[0014]第6、待第4步中的病毒上清常温化冻后，取2毫升不含抗生素的DMEM/F12完全培养基(gibco货号:11330-032)和I毫升第4步中的病毒上清混合后加入间充质干细胞孔内，并加入 polybrene (sigma 货号:H9268) 24 μ g/孔，1600rpm, 37°C离心 I 小时；
[0015]第7、离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养；
[0016]第8、48小时后向经病毒感染后的间充质干细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，即转基因间充质干细胞。
[0017]2、体内肿瘤靶向治疗:
[0018]⑴用胰酶消化生长良好的野生型或标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培养基重悬至I X IO7细胞/毫升；
[0019]⑵对6-8周龄雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射100微升上述肿瘤细胞悬液，待2周后，腹部形成肿瘤灶，建成Nude小鼠乳腺癌模型；
[0020]⑶用胰酶消化携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，用PBS洗一遍并用DMEM/F12基本培养基重悬至I X IO7细
胞/毫升；
`[0021]⑷经瘤内向乳腺癌模型Nude小鼠每侧肿瘤注射100微升上述间充质干细胞悬液；
[0022](5)经腹腔注射更西洛韦0.5mg，每日2次，两次给药中间间隔12小时，连续4天；
[0023](6)重复上述步骤⑷-(5) 4次。
[0024]3、体内化学发光成像:
[0025]⑴监测肿瘤病灶生长情况:向乳腺癌模型Nude小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg),待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒；
[0026]⑵监测人脐带来源的间充质干细胞在体内的分布:①监测携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞:向Nude小鼠经尾静脉注射海肾突光素酶底物coeIenterazine (500 μ g/kg),立即利用XenogenIVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟监测携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞:向Nude小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg),待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况为1-3分钟。
[0027]本发明的优点和有益效果:
[0028]人脐带来源的间充质干细胞本身具有自我更新和分化的能力，目前能够实现在体外的稳定培养和无限增殖，可以在未来实际应用中获得充足细胞来源。本发明所制备的携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞经乳腺癌瘤内注射，不仅具有肿瘤靶向性而且在给予胸苷激酶底物更西洛韦后可以诱导其周围肿瘤细胞的凋亡。此过程能够在给予海肾荧光素酶底物coelenterazine和萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin后进行体内示踪。利用分子成像技术收集间充质干细胞和肿瘤细胞的化学发光信号，能够在活体中实时监测两者在体内的分布、增殖和诱导凋亡的情况。应用本发明所制备的间充质干细胞进行肿瘤治疗具有微创、直观、动态观察的特点，并能够对同一只动物在不同时间点进行实时监测，能够更有效地评估靶向治疗的疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合报告基因的质粒示意图；
[0030]图2携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞表达红色荧光蛋白的情况；A是白光下携带三融合蛋白的间充质干细胞的形态，B是对携带三融合蛋白的间充质干细胞表达红色荧光蛋白的检测结果；
[0031]图3携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞生物发光强度与细胞数呈正比关系；A是利用光学影像方法检测密度梯度铺板后携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞生物发光强度，B是对A图荧光发光强度和携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞密度梯度数量的数据进行统计学分析表明细胞数量与Luciferase发光强度呈线性关系；
[0032]图4在不同浓度更西洛韦条件下培养携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞5天的存活率；
[0033]图5在40μ g/ml更西洛韦条件下培养携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞不同天数的存活率；
[0034]图6携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞经瘤内注射后在乳腺癌Nude小鼠I旲型的体内不踪；
[0035]图7携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞经瘤内注射，并给予更昔洛韦后在乳腺癌Nude小鼠的体内示踪；
[0036]图8携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞与人乳腺癌MDA-MB-231细胞以不同比例混合后在40 μ g/ml更西洛韦条件下培养5天后肿瘤细胞的存活率；
[0037]图9携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞与人乳腺癌MDA-MB-231细胞以1:1比例混合后在40 μ g/ml更西洛韦条件下培养5天后肿瘤细胞的存活率。
[0038]图10经原位注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞建立Nude小鼠乳腺癌模型后肿瘤的生长情况；
[0039]图11经原位注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞建立Nude小鼠乳腺癌模型后给予携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞加更西洛韦治疗后肿瘤的生长情况。
[0040]下面结合附图和【具体实施方式】做进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0041]实施例1
[0042]携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞的制备
[0043]⑴构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表达载体:将亚克隆的含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的片断插入到商业化载体pLV-EFl a -MCS-1RES-Bsd的多克隆位点当中，得到pLV-EFl a -TF-Bsd质粒，如图1所示；
[0044]⑵用293Τ细胞铺六孔板，密度为1.5 X IO6细胞/孔，用于转染；
[0045]⑶用Iipo-2000将pLV-EFl a -TF-Bsd慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染入前一天铺板的293Τ细胞；
[0046]⑷转染16小时后更换新鲜DMEM培养基(DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)，换液后24小时收集病毒上清，储于_80°C冰箱备用；
[0047](5)用人脐带来源的间充质干细胞铺六孔板，密度为IX IO5细胞/孔，用于病毒感染；
[0048](6)待步骤(4)中病毒上清常温化冻后，取2毫升不含抗生素的全培养基和I毫升病毒上清混合后加入步骤(5)中间充质干细胞孔内，并加入polybrene24 μ g/孔，1600rpm,37°C离心I小时；
[0049](7)离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养；
[0050](8) 48小时后向经病毒感染后的间充质干细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞。
[0051]在荧光显微镜下观察携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞红色荧光蛋白的表达情况，结果如图2所示，可见镜下全部细胞表达红色荧光蛋白；应用活体成像系统观察该细胞海肾荧光素酶的表达情况，结果如图3所示，加入稀释后的海肾荧光素酶底物coelenterazine后,可见生物发光强度与细胞数呈正比线性关系。
`[0052]在人脐带来源的间充质干细胞培养基中加入不同浓度的HSV-ttk底物更西洛韦(0-40 μ g/ml),培养5天后，用WST-1法检测细胞存活率，结果如图4所示，在40 μ g/ml更西洛韦培养条件下，绝大多数细胞在2天内发生凋亡，如图5所示。
[0053]实施例2
[0054]携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞经瘤内注射后在乳腺癌Nude小鼠模型的体内示踪。
[0055]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.0X IO6个；
[0056](2) 12天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物0-1^1(^作1^11(1501^/1^)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见两侧腹部发出荧光信号，确定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0057]⑶用胰酶消化实施例1中得到的携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，用DMEM/F12基本培养基重悬至I X IO7细胞/毫升，对Nude小鼠乳腺癌模型每侧肿瘤经瘤内注射100微升；
[0058]⑷分别在注射间充质干细胞后立刻及注射后24小时及48小时向Nude小鼠经尾静脉注射海肾突光素酶底物coelenterazine (500 μ g/kg),立即利用Xenogen IVIS LuminaII活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟，监测间充质干细胞在体内的分布。
[0059]在向Nude小鼠模型经瘤内注射三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞后，如图6所示，注射后立即能够在小鼠腹部监测到海肾荧光素信号，注射后24小时大部分细胞信号仍存于腹部，注射后48小时，腹部仍有小部分信号。
[0060]实施例3
[0061]携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞经瘤内注射后并给予更西洛韦腹腔注射后在乳腺癌模型Nude小鼠的体内示踪。
[0062]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射人乳腺癌MDA_MB_231细胞1.0X IO6 个；
[0063](2) 12天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见两侧腹部发生信号，确定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功。
[0064](3)用胰酶消化实施例1中得到的携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，用基本培养基重悬至I X IO7细胞/毫升，对Nude小鼠乳腺癌模型每侧肿瘤经瘤内注射100微升；[0065]⑷注射间充质干细胞半小时后经腹腔注射更昔洛韦0.5mg，之后每12小时I次；
[0066](5)分别在注射间充质干细胞后立刻及注射后24小时及48小时向Nude小鼠经尾静脉注射海肾突光素酶底物coelenterazine (500 μ g/kg),立即利用Xenogen IVIS LuminaII活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟，监测间充质干细胞在体内的分布。
[0067]在向Nude小鼠乳腺癌模型经瘤内注射三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞并给予更昔洛韦注射后，如图7所示，注射后立即能够在小鼠腹部监测到海肾荧光素信号，注射后24小时，小部分信号仍存在腹部，注射后48小时几乎不能监测海肾荧光素信号。
[0068]实施例4
[0069]携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用。
[0070]⑴用商业化的pLV-EFl a -MCS-1RES-GFP-Bsd慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染293Τ细胞；
[0071]⑵转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于_80°C冰禮备用；
[0072]⑶用人乳腺癌细胞MDA-MB-231铺六孔板，密度为I X IO5细胞/孔，用于病毒感染；
[0073]⑷待病毒上清常温化冻后，取2毫升不含抗生素的全培养基和I毫升病毒上清混合后加入步骤(3)中孔内，并加入polybrene24 μ g/孔，1600rpm, 37°C离心I小时；
[0074](5)离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养；
[0075](6) 48小时后向细胞培养基中加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达绿色荧光蛋白的MDA-MB-231-GFP细胞；
[0076](7)将MDA-MB-231-GFP细胞和实施例1中制备得到的携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞混合，并在培养基中加入更西洛韦，培养5天后裂解细胞，应用多功能检测仪测定细胞裂解液的GFP强度，以GFP的相对强度代表MDA-MB-231-GFP的存活情况。
[0077]结果如图8-9所示，在图8中将两种细胞按照不同比例进行混合后在40 μ g/ml更西洛韦条件下培养5天后，在40%-100%混合组中MDA-MB-231细胞死亡率大于50% ;图9中将两种细胞1:1混合后在40 μ g/ml更西洛韦条件下培养5天，在全部的给药组MDA-MB-231的死亡率均大于50%。
[0078]实施例5
[0079]Nude小鼠乳腺癌模型肿瘤的体内示踪。
[0080]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.0X IO6个；
[0081 ] (2) 12天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin (150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见两侧腹部散在信号，确定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0082]⑶分别于第18天、第23天、第28天重复上一步骤，监测腹部肿瘤生长情况。
[0083]结果如图10所示，可见小鼠腹部肿瘤自接种肿瘤细胞后第13天至第28天生长迅速。
[0084]实施例6
[0085]Nude小鼠乳腺癌模型给予携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞加更西洛韦治疗后肿瘤的体内不踪。
[0086]⑴向6-8周雌性Nude小鼠腹部两侧分别经原位注射携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.0X IO6个；
[0087](2) 10天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物0-1^1(^作1^11(1501^/1^)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见腹部两侧散在信号，确定Nude小鼠乳腺癌模型建立成功；
[0088]⑶分别在第12天、第14天、第16天消化携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，用基本培养基重悬至I X IO7细胞/毫升，对Nude小鼠乳腺癌模型两侧肿瘤分别经瘤内注射100微升；
[0089]⑷连续4天经腹腔注射更西洛韦0.5mg,每日2次，两次给药中间间隔12小时；
[0090](5)分别于每轮治疗后，即第13天、第18天、第23天和第28天重复第2步骤，监测腹部肿瘤生长情况。
[0091]结果如图11所示，可见经携带三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞加更西洛韦治疗后小鼠腹部肿瘤生长缓慢，明显慢于图10中未经治疗小鼠。
【权利要求】
1.一种具有体内示踪和肿瘤治疗作用的转基因细胞，其特征在于所述的细胞是由人脐带来源的间充质干细胞、经携带有海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和胸苷激酶的三融合基因的慢病毒表达载体转染后构建而成，该细胞能够进行体内示踪，并在给予胸苷激酶底物更西洛韦后诱导转基因细胞的凋亡。
2.一种具有肿瘤治疗作用并且能够进行体内示踪的转基因细胞的制备方法，其具体步骤为: 第1、构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd抗性的慢病毒表达载体； 第2、用293T细胞铺六孔板，密度为1.5X IO6细胞/孔，用于转染； 第3、用lipo-2000将第I步中构建的三融合基因慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒转染入第2步的293T细胞； 第4、第3步293T细胞转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于-80°C冰箱备用； 第5、用人脐带来源的间充质干细胞铺六孔板，密度为I X IO5细胞/孔，用于病毒感染；第6、待第4步中的病毒上清常温化冻后，取2毫升不含抗生素的全培养基和I毫升第4步中的病毒上清混合后,加入间充质干细胞孔内，并加入polybrene24y g/孔，1600rpm,37°C离心I小时； 第7、离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养； 第8、48小时后向经病毒感染后的间充质干细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人脐带来源的间充质干细胞，即转基因细胞。
【文档编号】C12N15/867GK103695373SQ201310695256
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李宗金, 韩忠朝, 冷良, 韩之波, 徐旸, 赵钱杰, 王悦冰 申请人:南开大学, 北京汉氏联合生物技术有限公司