一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制作方法
【专利摘要】一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，由粒径为30-200nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物组成，包括一种亲水端带有靶向基团修饰的pH响应性的双亲性嵌段共聚物和一种为亲水端为PEG的双亲性嵌段共聚物，该复合胶束在pH7.4下为核-壳结构，核层由双亲性嵌段共聚物的疏水端组成，壳层为PEG和靶向基团修饰的pH响应性的亲水端混合组成。本发明的优点：该药物载体表面结构可通过改变不同嵌段共聚物比例灵活调控，靶向基团针对肿瘤细胞具有特异性靶向作用，药物载体具有响应性释放能力，生物相容性较好，并具有生物可降解性；制备工艺简单、易于操作。
【专利说明】一种长循环和祀向协同的多功能抗肿瘤祀向纳米药物载体
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药和纳米医学【技术领域】，特别是一种长循环和靶向协同的多功 能抗肿瘤祀向纳米药物载体。
【背景技术】
[0002] 癌症是一种影响人类健康的恶性疾病，近三十年来，世界癌症发病率以每年3-5% 的速度增加，严重危害着人们的身心健康。目前肿瘤的治疗策略是以化疗、手术切除、放疗 和生物治疗等手段的综合治疗。其中药物化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，所用的抗肿瘤 化疗药物仍以小分子细胞毒性药物为主，给药后这些药物在体内分布广泛。同时，绝大多数 抗肿瘤药物是疏水的，静脉给药后能够到达的肿瘤组织的很少，很多在肝、脾等健康器官和 组织中分布，导致在治疗肿瘤的同时对机体正常组织也产生严重的毒副作用。如何提高化 疗药物对肿瘤组织的选择性，减少其在正常组织的分布，降低其毒副作用，提高药物生物利 用度是提高抗肿瘤化疗药物疗效的关键。
[0003] 纳米药物载体在输送药物过程中面临诸多的障碍，靶向肿瘤的药物输送是一个体 内5步串联的过程：1)在血液循环系统中保留较长时间（血液屏障），以实现2)肿瘤组织 中的高效富集（EPR效应），3)在肿瘤组织渗透到各个部分以到达所有肿瘤细胞，4)能够快 速进入肿瘤细胞，并5)在胞内将药物快速释放。然而，对于多功能的纳米药物载体，每一新 的功能势必增加了体系的复杂性并带来新的问题，并且不同特定功能之间往往会产生一定 的矛盾。例如，一些药物载体表面修饰亲水性较好的聚合物以避免网状内皮系统的快速清 除，获得较好的长循环性能并提高肿瘤部位的富集量。但是，研究表明，这些载体不易被肿 瘤细胞内吞，降低肿瘤治疗效果。与此同时，一些具有良好应用前景的靶向药物载体具有良 好的肿瘤细胞内吞能力，然而长循环及肿瘤部位的高效富集难以实现，此外，对于一些表面 修饰了靶向基团如c(RGDfK)的纳米粒子，c(RGDfK)直接暴露在纳米粒子表面，易于血液中 的调理素相互作用，使得纳米粒子在调理素作用下，促使其被网状内皮系统快速清除，并可 能会引起免疫反应，大大降低了抗肿瘤疗效。
[0004] 目前解决长循环和细胞内吞的研究主要集中表面聚乙二醇（PEG)可脱离的纳米 载体。这种纳米药物载体在血液循环过程中，在PEG的屏蔽作用下，载体材料可以在一定程 度上避免体内网状内皮系统的快速清除，提高了血液循环时间。同时，在EPR效应发挥作用 后，载体材料进入肿瘤组织，在肿瘤组织微环境如弱酸性、过度表达的酶类等响应性刺激 下，PEG响应性脱除，从而发生电荷转变或暴露出的靶向于肿瘤细胞的靶向基团，提高细胞 内吞能力。尽管如此，目前大部分的PEG脱壳研究仍然处于细胞水平，体内的验证还没有实 现。同时，脱壳过程及脱壳机理较为复杂，适用范围较窄。因此，为解决长循环和细胞内吞 的矛盾，需要发展新型具有协同作用的纳米药物载体系统，提高抗肿瘤治疗效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中存在不足，提供一种长循环和靶向协同的多功能 抗肿瘤靶向纳米药物载体，该药物载体保留了表面PEG修饰及表面结构所带来的长循环性 能，同时可有效提1?肿瘤细胞摄取能力，有效提1?抗肿瘤治疗效果。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] -种长循环和祀向协同的多功能抗肿瘤祀向纳米药物载体，由粒径为30_200nm 且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物通过在水溶液中自 组装形成，其中一种双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇-b_聚环己内酯（PEG-b-PCL)，其亲水 端为聚乙二醇（PEG)、疏水端为聚环己内酯（PCL)，另一种双亲性嵌段共聚物为聚环己内 酯-b-聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ (PCL-b-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)为短链环肽[其氨基 酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其亲水端为带有祀向基团修饰且具有pH响应 的端基为c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦为聚环己内酯（PCL)，上述两 种双亲性嵌段共聚物的疏水端的分子量为2-10kDa(千道尔顿）且相差< 5kDa ;所述复合 胶束在PH7. 4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端聚环己内酯（PCL)，壳层为聚乙二醇 (PEG)和PAE-c(RGDfK)的复合壳层。
[0008] -种所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备方法，包括 如下步骤：
[0009] 1)聚乙二醇-b-聚环己内酯（PEG2k-b-PCL)的合成
[0010] 以端羟基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(0ct) 2]为催化剂， 以ε -己内酯（ε -CL)为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二 醇和减蒸处理过的ε -CL溶于重蒸过的无水甲苯中，加入Sn (Oct)2，依次进行液氮冷冻、抽 真空、通氮气、解冻，重复三次，ll〇°C油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷 溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得到 白色固体聚乙二醇-b_聚环己内酯（PEG 2k-b-PCL);
[0011] 2)聚环己内酯-b-聚 β 氨酯-C (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)]的合成
[0012] 利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰 基氨基乙醇（B0C-NH-C 2H40H)和减蒸过的ε -己内酯（ε -CL)混合，加入重蒸过的甲苯溶 解，加入辛酸亚锡[Sn (Oct) 2]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在 110°C油浴中反应12h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉 淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ;
[0013] 将上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，然后 将丙烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，将混合液b在氩气氛围 下逐滴缓慢滴入到混合液a中，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反 应12h后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、0. lmol/L的盐酸溶液和纯水分别洗涤至少三 次，取有机相，用无水硫酸镁干燥8-10h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10h后 抽滤，用无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的 PCL-A ；
[0014] 将上述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4, f -三亚甲基-二哌啶 (TDP)混合后，加入氯仿溶解，55°C油浴中反应，72h后，在反应液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰 亚胺（NAS)，继续反应12h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL-b-PAE-NAS ;
[0015] 将上述PCL-b-PAE-NAS和短链环肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合 溶剂，然后加入三乙胺（TEA)，30°C下搅拌反应8-10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透 析，透析袋截留分子量为12_14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环 己内酯-b_ 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)];
[0016] 3)室温下分别将步骤1)和2)中所得到的两种嵌段共聚物PCL-b-PAE-c (RGDfK) 和PEG-b-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为 2mg/mL ;另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制 得浓度为2mg/mL的阿霉素溶液；
[0017] 4)将步骤3)中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1 :1 :1均 匀混合，得到混合溶液；
[0018] 5)将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH为4. 0、浓度为l(T4m〇l/L的盐酸 中，滴加完全后，在35°C下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然后在室温下旋蒸至完 全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7. 4,在超 纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12-14kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得 所需浓度的负载阿霉素的纳米药物载体（载药胶束RMSM-D0X)。
[0019] 所述步骤1)中端羟基聚乙二醇、ε -己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚 的用量比为 2. 0g :5. 0g :20mL :50 μ L :20mL :200mL。
[0020] 所述步骤2)中B0C-NH-C2H40H、ε -己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和冰乙醚的 用量比为0. lg :3. 5g :10mL :50μ L :5mL :50mL ;所述混合液a中PCL-0H、三乙胺与二氯甲烷 的用量比为2. 5g :0. 25g :5mL ;混合液b中丙烯酰氯与二氯甲烷的用量比为0. 18g :10mL ; 混合液a与混合液b的质量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)、 4，f -三亚甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4，f -三亚甲基-二哌啶（TDP)的用量比为 0. 5g :0. 68g :0. 69g :10mL :0. 305g ;所述DMF与氯仿混合溶剂中DMF-氯仿的体积比3:2 ; PCL-b-PAE-NAS、c (RGDfK)、DMF-氯仿混和溶剂和 TEA 的用量比为 80mg :16mg :5mL :200 μ L。
[0021] 本发明的合成路线如下所示：
[0022]
【权利要求】
1. 一种长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体，其特征在于：由粒径为 30-200 nm且均匀分布的复合胶束组成，所述复合胶束由两种双亲性嵌段共聚物通过在水 溶液中自组装形成，其中一种双亲性嵌段共聚物为聚乙二醇聚环己内酯（PEG4-PCL)， 其亲水端为聚乙二醇（PEG)、疏水端为聚环己内酯（PCL)，另一种双亲性嵌段共聚物为聚环 己内酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [(PCL-6-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)为短链环肽[其 氨基酸序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其亲水端为带有祀向基团修饰且具有pH 响应的端基为c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦为聚环己内酯（PCL)，上述 两种双亲性嵌段共聚物的疏水端的分子量为2-10 kDa (千道尔顿)且相差< 5 kDa ;所述复 合胶束在pH 7. 4水溶液中为核-壳结构，其中核为疏水端聚环己内酯（PCL)，壳层为聚乙二 醇（PEG)和PAE-c (RGDfK)的复合壳层。
2. -种如权利要求1所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制 备方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 聚乙二醇聚环己内酯（PEG2k4-PCL)的合成 以端羟基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)为引发剂，以辛酸亚锡[Sn(0ct) 2]为催化剂，以 f -己内酯U -CL)为单体，开环聚合制备，具体方法是：将干燥处理过的端羟基聚乙二醇 和减蒸处理过的f -CL溶于重蒸过的无水甲苯中，加入Sn (Oct) 2，依次进行液氮冷冻、抽真 空、通氮气、解冻，重复三次，110 ° C油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲 烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，即可得 到白色固体聚乙二醇聚环己内酯（PEG 2k4-PCL); 2) 聚环己内酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]的合成 利用开环聚合和迈克尔加成反应通过连续反应制备，具体方法是：将叔丁氧羰基氨基 乙醇（B0C-NH-C2H40H)和减蒸过的f -己内酯U -CL)混合，加入重蒸过的甲苯溶解，加入 辛酸亚锡[Sn(0ct)2]，依次进行液氮冷冻、抽真空、通氮气、解冻，重复三次，然后在110 ° C 油浴中反应12 h，反应后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽 滤洗涤后，将固体产物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ; 将上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均匀得到混合液a，然后将丙 烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均匀得到混合液b，将混合液b在氩气氛围下逐滴 缓慢滴入到混合液a中，滴加完毕后封闭反应体系，缓慢升至室温，在氩气氛围下反应12 h 后，萃取反应液，用饱和碳酸钠溶液、〇. 1 mol/L的盐酸溶液和纯水分别洗漆至少三次，取有 机相，用无水硫酸镁干燥8-10 h，抽滤，旋蒸浓缩后在冰乙醚中沉淀，静置8-10 h后抽滤，用 无水乙醚洗涤后，将固体置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳双键功能化的PCL-A ; 将上述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4，f -三亚甲基-二哌啶（TDP) 混合后，加入氯仿溶解，55 ° C油浴中反应，72 h后，在反应液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰亚 胺（NAS)，继续反应12 h，封端并终止反应，即可得到黄色固体PCL4-PAE-NAS ; 将上述PCL4-PAE-NAS和短链环肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合溶剂， 然后加入三乙胺（TEA)，30 ° C下搅拌反应8-10h，反应液旋蒸除去氯仿，在超纯水中透析， 透析袋截留分子量为12_14k Da，每天换水四次，透析三天后，冷冻干燥，即可制得聚环己内 酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]; 3) 室温下分别将步骤1)和2)中所得到的两种嵌段共聚物PCLi-PAE-c (RGDfK)和 PEG4-PCL分别溶解在有机溶剂氯仿中，得到两种聚合物溶液，这两种溶液的浓度均为2 mg/mL ;另外将阿霉素盐酸盐加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素盐酸盐中的盐酸，制 得浓度为2 mg/mL的阿霉素溶液； 4) 将步骤3)中制备得到的两种聚合物溶液和阿霉素溶液按照体积比为1 :1 :1均匀混 合，得到混合溶液； 5) 将上述混合溶液在超声搅拌下逐滴加入到pH为4. 0、浓度为ΚΓ4 mol/L的盐酸中， 滴加完全后，在35 ° C下剧烈搅拌挥发至有机溶剂基本挥发完全，然后在室温下旋蒸至完 全除去未挥发干净的有机溶剂，加入浓度为0. 1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7. 4,在超 纯水中透析，所用透析袋截留分子量为12-14 kDa，透析两天后，经超滤离心浓缩，即可制得 所需浓度的负载阿霉素的纳米药物载体(载药胶束RMSM-D0X)。
3. 根据权利要求2所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备 方法，其特征在于：所述步骤1)中端羟基聚乙二醇、f -己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷 和冰乙醚的用量比为 2.0 g:5.0 g :20 mL:50 yL:20 mL:200 mL。
4. 根据权利要求2所述长循环和靶向协同的多功能抗肿瘤靶向纳米药物载体的制备 方法，其特征在于：所述步骤2)中B0C-NH-C 2H40H、f -己内酯、甲苯、辛酸亚锡、二氯甲烷和 冰乙醚的用量比为0. 1 g :3. 5 g :10 mL :50 μ L :5 mL :50 mL ;所述混合液a中PCL-0H、三 乙胺与二氯甲烷的用量比为2.5 g :0.25 g:5 mL;混合液b中丙烯酰氯与二氯甲烷的用量 比为0. 18 g : 10 mL ;混合液a与混合液b的质量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二 丙烯酸酯（HDD)、4,4，-三亚甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4,4'-三亚甲基-二哌啶（TDP) 的用量比为0.5 g :0.68 g :0.69 g:10 mL :0.305 g;所述DMF与氯仿混合溶剂中DMF-氯仿 的体积比3:2 ; PCL4-PAE-NAS、c(RGDfK)、DMF-氯仿混和溶剂和TEA的用量比为80 mg : 16 mg :5 mL :200 μ L〇
【文档编号】C08G63/664GK104055751SQ201410241636
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】史林启, 高红军, 程堂剑, 马如江, 安英丽 申请人:南开大学