血栓靶向释放rgds的抗栓剂聚天冬酰-rgds的合成和应用
【专利说明】血栓靶向释放RGDS的抗栓剂聚天冬酿-RGDS的合成和应用 发明领域
[0001] 本发明涉及血栓靶向释放RGDS的聚天冬酰-RGDS，涉及它的制备方法，涉及它在 大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬酰-RGDS作为靶向抗血栓剂 的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 血小板血栓是血栓形成的起始阶段，可以分为血小板粘附、活化和聚集三个过程。 在血小板血栓形成过程中，血小板膜上GPIIb/IIla活化，构象发生改变，然后在Ca2+的参与 下，与纤维蛋白原或vWF上的R⑶四肽序列特异性结合将血小板和红血球偶联起来，形成血 栓。在血小板聚集过程中，纤维蛋白原或vWF上的RGDS与活化的血小板表面受体GPlib/ Ilia结合起至关重要的作用。外源性RGDS与被GPIlb/IIIa识别并竞争性抑制纤维蛋白 原或vWF与血小板结合，抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板，这些血小板 是血栓形成的重要构件。如果能把RGDS定向释放到血栓形成部位，就可以使这些活化的血 小板不能参与血栓形成，从而有效地抑制血栓形成。可是，这个目标在本发明申请之前没有 达到。根据这些认识，发明人提出了本发明。本发明的突出创造性在于用聚天冬酰-RGDS 将RGDS输送到血栓形成部位，然后在血栓中有效地释放RGDS，发挥靶向抗血栓作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个内容是采用常规的液相合成，逐步接肽制备HC1 ·Αα(Τ〇8)-617_Α sp(OBzl)_Se(Bzl)-〇Bzl。
[0004] 本发明的第二个内容是采用标准方法，制备平均分子量为20964,链长为173个天 冬氨酸残基的聚天冬氨酸。
[0005]本发明的第三个内容是采用EDC法将HC1*Arg(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl) -0B zl偶联到聚天冬氨酸的羧基上然后脱去RGDS的侧链和羧端保护基，制备聚天冬酰-RGDS。
[0006] 本发明的第四个内容是测定聚天冬酰-RGDS的抗血小板聚集活性。
[0007] 本发明的第五个内容是测定聚天冬酰-RGDS的抗血栓活性。
[0008] 本发明的第六个内容是测定聚天冬酰-RGDS对GPIIb/IIIa的影响。
[0009] 本发明的第七个内容是测定聚天冬酰-RGDS在血栓中释放RGDS。
[0010] 本发明中所出现的缩略语的说明：
[0011]RGDSArg-Gly-Asp-Ser
[0012]PD 聚天冬氨酸
[0013]聚天冬酰-RGDS聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Ser
[0014]THF 四氢呋喃
[0015]DCC 二环己基酰亚胺
[0016]DCU 二环己基脲
[0017]OBzl苄氧基
[0018]Boc 叔丁氧羰基
[0019]Tos 对甲苯横酸基
[0020] OMe 甲氧基
[0021] HOBtN-羟基苯并三唑
[0022] NMMN-甲基吗啉
[0023]EDC 1_ (3_二甲氛基丙基）_3_乙基碳二亚胺
[0024]PAF 血小板活性因子
[0025] ADP 腺苷二磷酸
[0026] AA 花生四烯酸
[0027]TE 凝血酶
【附图说明】
[0028]图 1.聚天冬酰-RGDS的合成路线·i)85%H3P04,180°C，减压；ii)NaOH，H20,0°C; iii)EDC/H0Bt;iv)DCC，HoBt，0°C;v)Na0H(2N)，H20,0°C;vi)氯化氢的乙酸乙酯溶液（4N); vii)CF3C02H,CF3S03H〇
[0029] 图2.聚天冬酰-RGDS治疗的大鼠血液提取物的FT-MS谱（上）和血栓提取物的 FT-MS谱（下）。
【具体实施方式】
[0030] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0031]实施例 1 制备HC1 ·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
[0032]1)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl
[0033]将 4. 986g(ll. 64mmol)Boc-Arg(Tos)，1. 310g(9. 7mmol)H0Bt溶于 30mL无水THF， 往得到的溶液中加2. 398g(11. 64mmol)DCC的无水THF溶液，冰浴搅拌20min，得到反应液 I。 将3. 273g(9. 7mmol)Tos·Gly-〇Bzl与30mL无水THF的溶液用NMM调pH9,得到反应液 II。 将反应液II加到反应液I中，室温反应12小时。TLC(丙酮：石油醚=2 : 1)显示反 应完成。过滤除去DCU沉淀，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，过滤除去DCU 沉淀。滤液分别用饱和NaHC03 (50mLX1)，5 %NaHC03 (50mLX2)，饱和NaCl(50mLX3)，5 % KHS04 (50mLX 3)，饱和NaCl(50mLX 3)，5 %NaHC03 (50mLX 3)，饱和NaCl(50mLX 3)洗，加无 水NaS04干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到的5.339g淡黄色固体粗品用硅 胶柱纯化（丙酮：石油醚=1:4)，得到4. 93g(88%)纯品，为无色固体。
[0034] 2)制备Boc-Arg(Tos)-Gly
[0035]在冰浴下将 5. 291g(9. 19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl溶于 20mL甲醇，往得到 的溶液中加14mLNaOH水溶液（2N)，搅拌1小时，TLC(丙酮：石油醚=1 : 1)显示反应完 成。反应液用饱和KHS〇3fpH7,减压浓缩。残留液先用NaOH水溶液（2N)调pH9,再用乙醚 萃取。水层用饱和KHS04调pH2,用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯萃取液加无水 NaS04干燥。滤出干燥后的乙酸乙酯溶液，减压浓缩得到3. 782g(84% )B〇C-Arg(T〇s)-Gly， 为无色固体。ESI-MS(m/e) :377[M+H]+。
[0036] 3)制备Boc-Asp(OBzl)_Se(Bzl)-OBzl
[0037]按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl的方法，从 2. 716g(8. 4mmol)Boc-Asp(OBzl)和 3. 273g(7mmol)HCl.Ser(Bzl)-〇Bzl，得到 3. 339g(81% )Boc-Asp(0Bzl)_Val-0Bzl，为浅黄 色固体。
[0038] 4)制备HC1 ·Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0039]在冰浴下将 2. 379g(4mmo1)Boc-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl溶于 6mL乙酸乙酯 中，往得到的溶液中加入20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液，搅拌4小时，TLC(丙酮：石油醚 =1 : 5)显示反应完成，减压抽去乙酸乙酯。残留物加20mL无水乙醚溶解，溶液减压浓 缩。该操作反复5次，以除去产品中的氯化氢。残留物最后加5mL无水乙醚研磨，得到 1.862g(92%)产品，为无色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e) :413[M+H]+。
[0040] 5)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0041]按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-〇Bzl的方法，从 1398mg(2. 88mmol) 8〇。-八找(1'〇8)-617和 126411^(2.4臟〇1)!1(：1.八8口（(》21)-56(821)-(?21得到 202311^(88%) Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Se(Bzl)-0Bzl。ESI-MS(m/e) :958[M+H]+. 4NMR(500MHz， CDC13)d/ppm= 7. 725 (d，2H)，7. 583 (m，2H)，7. 235 (m，18H)，6. 436 (s，2H)，6. 200 (s， 1H) ,5. 653 (d,J= 7. 0Hz, 1H), 5. 240(m,4H) ,4. 907 (m, 1H) ,4. 677 (m, 1H) ,4. 213 (s, 1H), 3. 942 (m, 1H) , 3. 289 (s, 1H) , 3. 144 (s, 1H) , 2. 904 (m, 1H) , 2. 795 (s, 1H) , 2. 336 (m, 3H), 2. 251(s,2H),l. 775 (d,J= 5. 5Hz,lH),l. 594 (d,J= 6. 5Hz,lH),l. 509(s,2H),l. 385 (s, 11H)，1. 257(s，1H)。
[0042] 6)制备HC1 ·Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl)-OBzl
[0043]按照制备HC1 ·Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法，从 2.lg(2. 19mmol)Boc-Arg(Tos)_G ly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl得 1. 782g(91 % )HC1.Arg(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Se(Bzl) -0 Bzl固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)817[M+H] +。
[0044] 实施例2制备聚天冬氨酸
[0045]1)制备聚丁二酰亚胺
[0046] 将20.(^0，1^-厶8口和10.48氏?04(85%)混匀并在18〇1：减压（0.1]\0^)反应3.5小 时。反应物趁热产物用80mLDMF溶解，得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗 抽滤，滤饼磨碎成粉末，用水洗至中性，35°C减压干燥至恒重，得到14. 4g(98. 8% )聚丁二 酰亚胺，为淡灰色粉末。1HNMR(500MHz，CDC13)d/ppm:5· 294 ( 丁二酰亚胺的H-3)，3. 233 ( 丁 二酰亚胺的H-4) ·13CNMR(125MHz，CDC13)d/ppm: 173. 96 ( 丁二酰亚胺的C-3)，172. 69 ( 丁二 酰亚胺的C-1)，47. 82 ( 丁二酰亚胺的C-4)，33. 10 ( 丁二酰亚胺的C-5).IRδ/cm1 :1711 和 1801 ( 丁二酰亚胺的C= 0)，1160 和 1213 ( 丁二酰亚胺的C-N)。
[0047] 2)制备聚天冬氨酸
[0048] 冰浴下将3g聚丁二酰亚胺和1. 4gNaOH用20mL水溶解，搅拌1小时，用浓度为 35%的盐酸调pHl，得到的溶液倒入300mL甲醇中。滤出生成的沉淀在40°C真空干燥，得 3. 2g聚天冬氨酸，为淡黄色固体。采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射法测得聚天冬氨 酸的数均分子量（Μη)为20964g/mol，重均分子量（Mw)为30476g/mol，分子量分布（d)为 1. 4537,数均聚合度为 173。[a]D25= 1.21(C= 0.01，H20)。13CNMR(125MHz，CDC13)d/ppm =177. 87,173. 41，172. 75,172. 05,171. 89,51. 76,51. 60,39. 12,37. 61。
[0049]实施例 3 制备聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl
[0050] 先将87mg(0. 75mmol)聚天冬氨酸溶于lmL无水DMF，冰浴下加入101mg(0. 75mmol) HOBt和 288mg(l. 50mmol)EDC，0. 5 小时后加入 624mg(0. 75mmol)HCl·Αα(Τ〇8)-61γ-Α8ρ(0 Bzl)-Val-〇Bzl，NMM调pH9。室温搅拌24小时，TLC(二氯甲烷：甲醇，5 : 1)显示HCl，Ar g(Tos) -Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl) -OBzl消失。反应混合物减压