血栓靶向释放rgdv的抗栓剂聚天冬酰-rgdv的合成和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血栓祀向的聚天冬醜-RGDV，涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构， 涉及它在大鼠血栓模型上的祀向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬醜-RGDV作为革己向 抗血栓剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 血小板血栓是血栓形成的起始阶段，可W分为血小板粘附、活化和聚集H个过程。 在血小板血栓形成过程中，血小板膜上GPHb/IIIa活化，构象发生改变，然后在Ca2+的参与 下，与纤维蛋白原或VWF上的RGD四肤序列特异性结合将血小板和红血球偶联起来，形成血 栓。在血小板聚集过程中，纤维蛋白原或VWF上的RGDV与活化的血小板表面受体GPIIb/ IIIa结合起至关重要的作用。外源性RGDV与被GPIlb/IIIa识别并竞争性抑制纤维蛋白 原或VWF与血小板结合，抑制血小板聚集。血栓形成部位富集了活化的血小板，送些血小板 是血栓形成的重要构件。如果能把RGDV定向释放到血栓形成部位，就可W使送些活化的血 小板不能参与血栓形成，从而有效地抑制血栓形成。可是，送个目标在本发明申请之前没有 达到。根据送些认识，发明人提出了本发明。本发明的突出创造性在于用聚天冬醜-RGDV 将RGDV输送到血栓形成部位，然后在血栓中有效地释放RGDV，发挥祀向抗血栓作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个内容是采用常规的液相合成，逐步接肤制备肥1 'ArgUos)-Gly-A SP(OBzl)-Val-OBzl。
[0004] 本发明的第二个内容是采用标准方法，制备平均分子量为20964,链长为173个天 冬氨酸残基的聚天冬氨酸。
[0005] 本发明的第H个内容是采用邸C法将肥1 .Arg灯OS)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl 偶联到聚天冬氨酸的駿基上然后脱去RGDV的侧链和駿端保护基，制备聚天冬醜-RGDV。
[0006] 本发明的第四个内容是测定聚天冬醜-RGDV的抗血小板聚集活性。
[0007] 本发明的第五个内容是测定聚天冬醜-RGDV的抗血栓活性。
[0008] 本发明的第六个内容是测定聚天冬醜-RGDV对GPIIb/IIIa的影响。
[0009] 本发明的第走个内容是测定聚天冬醜-RGDV在血栓中释放RGDV。
[0010] 本发明中所出现的缩略语的说明：
[0011] RGDVArg-Gly-Asp-Val
[001引 PD 聚天冬氨酸
[0013] 聚天冬醜-RGDV 聚天冬醜-Arg-Gly-Asp-Val
[0014] THF 四氨巧喃
[001引 DCC 二环己基醜亚胺
[001引 DCU 二环己基脈
[0017] OBzl 予氧基
[0018] Boc 叔了氧撰基
[001引 Tos 对甲苯礙酸基
[0020]OMe 甲氧基
[0021]HOBtN-居基苯并H哇
[0022]NMMN-甲基吗晰
[0023] 邸C 1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺
[0024]PAF 血小板活性因子
[00巧]ADP 腺巧二磯酸
[002引 AA 花生四帰酸
[0027] TE 凝血酶
【附图说明】
[002引 图 1.聚天冬醜-RGDV的合成路线.U85% &?04,180。减压；iUrfeOH,H20,0°C; iii化DC/HOBt;iv)DCC，Ho化，(TC;v)化0H(2N)，H20,0°C;vi)氯化氨的己酸己醋溶液（4脚；vi^CFsCOzH，CF3SO3H。
[0029] 图2.聚天冬醜-RGDV治疗的大鼠血液提取物的FT-MS谱。
[0030] 图3.聚天冬醜-RGDV治疗的大鼠血栓提取物的FT-MS谱。
【具体实施方式】
[0031] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。送些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0032]实施例 1 制备肥1? ArgUos)-Gly-Asp((Bzl)-Val-Cffizl
[0033] 1)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl
[0034]将 4. 986g(ll. 64mmol)Boc-Arg灯OS)，1. 310g(9.Tmmol)册化溶于 30血无水THF, 往得到的溶液中加2. 398g(11. 64mmol)DCC的无水THF溶液，冰浴揽拌20min，得到反应液 I。 将3. 273g巧.7mmol)Tos?Gl厂OBzl与30血无水THF的溶液用NMM调抑9,得到反应液 II。 将反应液II加到反应液I中，室温反应12小时。化C(丙丽：石油離=2 : 1)显示反 应完成。过滤除去DCU沉淀，滤液减压浓缩，残留物用150mL己酸己醋溶解，过滤除去DCU 沉淀。滤液分别用饱和Na肥〇3巧0血X1)，5 %Na肥〇3巧0血X2)，饱和化CU50血X3)，5 % KHS04巧OmLX3)，饱和NaCUSOmLX3)，5 %NaHC〇3巧OmLX3)，饱和NaCUSOmLX3)洗，加无 水化S〇4干燥。滤出干燥后的己酸己醋溶液，减压浓缩得到的5. 339g淡黄色固体粗品用娃 胶柱纯化（丙丽：石油離=1 : 4)，得到4.93g(88%)纯品，为无色固体。
[0035] 2)制备Boc-Arg(Tos)-Gly
[0036]在冰浴下将 5. 291g化 19mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl溶于 20血甲醇，往得到 的溶液中加14血化OH水溶液（2脚，揽拌1小时，TLC(丙丽：石油離=1 : 1)显示反应完 成。反应液用饱和K服〇4调抑7,减压浓缩。残留液先用化OH水溶液（2脚调抑9,再用己離 萃取。水层用饱和K服〇4调抑2,用50血己酸己醋萃取3次，合并的己酸己醋萃取液加无水 化S〇4干燥。滤出干燥后的己酸己醋溶液，减压浓缩得到3. 782g(84% )Boc-Arg灯os)-Gly， 为无色固体。ESI-MS(m/e) :377[M+田+。
[0037] 3)制备Boc-Asp((Bzl) -Val-Cffizl
[0038]按照制备Boc-Arg灯os)-Gly-OBzl的方法，从 2. 716g(8. 4mmol)Boc-Asp(OBzl)和 2. 657g(7mmol)Tos?Va^OBzl，得到 2. 8225g(79 % )Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl,为无色固 体。
[0039] 4)制备肥1 ?Asp(OBzl) -Val-OBzl
[0040]在冰浴下将 7. 8345g(15. 2mmol)Boc-Asp(OBzI)-Val-OBzl溶于6血己酸己醋 中，往得到的溶液中加入20mL氯化氨的己酸己醋溶液，揽拌4小时，化C(丙丽：石油離 =1 : 5)显示反应完成，减压抽去己酸己醋。残留物加20mL无水己離溶解，溶液减压浓 缩。该操作反复5次，W除去产品中的氯化氨。残留物最后加5mL无水己離研磨，得到 0. 864g(90%)产品，为无色粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/e) ;413[M+田+。
[0041]巧制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
[0042]按照制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl的方法，从 4005mg(8. 247mmol) Boc-Arg灯os)-Gly和 3. 106g化.873mmol)肥I.Asp(OBzl)-Val-OBzl得到 5. 9g(97% )Boc-Arg灯os) -Gly-Asp(OBzl) -Val-OBzldESI-MS(m/e) ;880 [M+田VhNMR巧OOMHz，CDCI3)d/卵m =7. 72 (s, 3H), 7. 49 (s, 2H), 7. 29 (d, 10H), 7. 24 (s, 2H),6. 44 (m, 2H), 5. 64 (m, 1H), 5. 07 (m, 4H)，4.86(S，1H)，4. 37 (d，J= 5. 5Hz，1H)，4. 23 (m，1H)，3. 97 (d，J= 15Hz，1H)，3. 82(S，1H)， 3. 17 (s，IH)，2. 92 (d，J= 16. 5Hz，IH)，2. 82 (s，IH)，2. 33 (d，3H)，2. 08 (m，3H)，I. 79 (s，IH)， 1. 63 (s，IH)，I. 55 (s，2H)，I. 38 (d，細），I. 25 (m，IH)，0. 82 (m，細）."cNMR(125MHz，CDCI3)d/ 卵m= 171. 55,171. 35,170. 50,，169. 55,157. 06,142. 05,140. 70,135. 42,135. 38,129. 22， 128. 54,128. 37,128. 26,128. 17,125. 99,80. 15,77. 24, 76. 98, 76. 73,66. 95,66. 91,58. 01, 53. 92,49. 50,43. 30, 36. 00, 30.66, 28. 35, 25. 32, 21. ：M，18. 94,17. 80,14. 17。
[0043]6)制备肥I?Arg灯〇3)-Gly-Asp((BzI)-Val-CffizI
[0044]按照制备肥I.Asp(OBzl)-Val-OBzl的方法，从I. 90g(2. 16mmol)Boc-Arg(Tos)-G Iy-Asp(OBzl)-Val-OBzl得I. 621g(92% )肥I?Arg〇'os)-Gly-Asp(OBzl)-Val-〇Bzl固体， 直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)817[M+田+。
[004引实施例2巧[J备聚天冬氨酸
[0046] 1)制备聚了二醜亚胺
[0047] 将 20.OgDikAsp和 10. 4邑&?〇4(85%)混匀并在 180°C减压（0.IMPa)反应 3. 5 小 时。反应物趁热产物用SOmLDMF溶解，得到的溶液滴入400mL水中。生成的沉淀用砂芯漏斗 抽滤，滤饼磨碎成粉末，用水洗至中性，35C减压干燥至恒重，得到14. 4g(98.8% )聚了二 醜亚胺，为淡灰色粉末。电NMR巧OOMHz，CDCls)d/卵m; 5. 294 ( 了二醜亚胺的H-：3)，3. 233 ( 了 二醜亚胺的H-4)."CNMR(125MHz，CDCI3)d/卵m; 173. 96 ( 了二醜亚胺的C-3)，172. 69 ( 了二 醜亚胺的C-1)，47. 82 ( 了二醜亚胺的C-4)，33. 10 ( 了二醜亚胺的C-5).IR6/cm1 ; 1711 和 1801 ( 了二醜亚胺的C= 0)，1160 和 1213( 了二醜亚胺的C-N)。
[0048] 2)制备聚天冬氨酸
[0049] 冰浴下将3g聚了二醜亚胺和1. 4g化OH用20mL水溶解，揽拌1小时，用浓度为 35 %的盐酸调抑1，得到的溶液倒入300血甲醇中。滤出生成的沉淀在4(TC真空干燥， 得3.2g聚天冬氨酸，为淡黄色固体。采用凝胶渗透色谱-多角激光光散射法测得聚天冬 氨酸的数均分子量（Mn)20964g/mol，重均分子量（Mw)为30476g/mol，分子量分布（d)为 I. 4537,数均聚合度为 173。[a]〇25 =I. 21(C= 0. 01，&0)。"CNMR(125MHz，CDCl3)dA)pm=177. 87,173. 41，172. 75,172. 05,171. 89,51. 76,51. 60,39. 12,37. 61。
[0050]实施例 3 制备聚天冬醜-Arg(Tos)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl
[0051] 先将89mg化77mmol)聚天冬氨酸溶于1血无水DMF,冰浴下加入104mg(0. 77mmol) 册Bt和 296mg(l. 54mmol化DC，0. 5 小时后加入 628mg(0. 77mmol)肥I?八'邑灯〇3)-617-八3口（ OBzD-Val-OBzl,NMM调抑9。室温揽拌24小时，TLC(二氯甲焼：甲醇，5 : 1)显示