专利名称：一种心脏血管靶向型短肽mi-1与应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及一种心脏血管靶向型短肽MI-I与应用，属于医药领域。
背景技术：
实现对组织与器官靶向治疗和靶向诊断，必须要解决的问题是找到合适的组织与器官血管的特异性靶向子。对受损、病损和衰老心脏实施靶向治疗和靶向诊断，关键在于找到经静脉使用能特异性靶向心脏血管的靶向子。使用抗原-抗体作为特异性介导靶向策略是目前常用的思路，但该策略很大程度受制于(1)能否找到特异于不同组织、器官血管内皮细胞的抗原，由于目前尚未能鉴定及纯化特异于心脏血管的抗原，故尚无利用该原理成功实现对心脏血管特异性靶向的报道；(2)实施靶向的单克隆抗体的免疫源性是抗体作为特异性靶向的一大障碍；C3)由于抗体分子较大，当其与别的生物大分子(如生长因子、基因治疗表达载体)连接之后，能否顺利穿越血管内皮细胞，从而发挥其疗效也是该策略的另一大障碍，故目前临床尚无利用抗体介导特异性靶向对缺血坏死心肌实施靶向治疗的药物，也没有能为临床使用，能特异性靶向心脏血管的靶向子。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种心脏血管靶向型短肽MI-1。该短肽经静脉使用(注射及介入输入等)，能在活体内能特异性靶向心脏血管，并能高亲和靶向粘附在心脏血管内皮细胞表面分子，从而实现对心脏血管的特异性靶向。本发明的另一目的在于提供所述心脏血管靶向型短肽MI-I的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种心脏血管靶向型短肽MI-1，其氨基酸序列如下所示CPRRPGRVC ；更优选为，该心脏血管靶向型短肽MI-I通过两端的半胱氨酸之间形成强力二硫键，从而形成环肽结构。所述的心脏血管靶向型短肽MI-I由L型氨基酸或D型氨基酸组成，优选通过D型氨基酸组成，在通过载体表达该MI-I或合成该MI-I时，可通过两端的半胱氨酸形成二硫键，使其呈环状。所述心脏血管靶向型短肽MI-I的核苷酸序列如下所示5，-TGCCCGAGGAGGCCGGGG AGGGTTTGC-3，。所述的心脏血管靶向型短肽MI-I应用于制备特异性靶向心脏血管的制剂。该特异性靶向心脏血管的制剂可通过心脏血管靶向型短肽MI-I (链状或环状)与生物大分子连接得到，或通过把编码该MI-I短肽的基因序列克隆到其它表达载体，使MI-I与其它功能蛋白表达为融合蛋白，从而能得到利用MI-I实现对心脏血管特异性靶向的载体及其蛋白表达产物；所述的生物大分子为生长因子、基因治疗表达载体、视踪剂、显影剂、生物微囊或其它化学结构成分、其它能与MI-I进行连接的大分子结构，或通过把编码该MI-I短肽的基因序列克隆到其它表达载体所形成的含MI-I编码序列的载体及其蛋白表达产物。所述心脏血管靶向型短肽MI-I经静脉使用(注射及介入输入等)，能在活体内能特异性靶向心脏血管，并能高亲和靶向粘附在心脏血管内皮细胞表面分子，从而实现对心脏血管的特异性靶向，利用该心脏血管靶向型短肽MI-I的上述特性，使用D型氨基酸合成的短肽MI-I能有效对抗各种蛋白酶的降解并能高亲和性靶向心脏血管，而成为能特异性靶向心脏血管的靶向子，把该心脏血管靶向型短肽MI-I与其它生物大分子(如生长因子、 基因治疗表达载体、视踪剂、显影剂、生物微囊等)进行连接(注由于上述大分子只是连接在MI-I的氨基端或羧基端，并没有破坏两端半胱氨酸之间所形成强力二硫键，因此，MI-I 还呈环状)，就能介导相应的连接物特异性靶向锚定在心脏血管内皮细胞，并介导血管内皮细胞对其的内吞作用，从而介导与之连接的生物大分子跨越血管进入心肌层，从而发挥靶向治疗、靶向视踪剂及靶向显影剂的作用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果如下①由于血管内皮细胞位于血管的内表面，本发明是在活体状态下直接对心脏血管内皮细胞表面分子进行筛选而得到的，因此该MI-I能高亲和性靶向心脏血管的内皮细胞表面分子，从而能实现对心脏血管的特异性靶向。②通过实验证明，本发明所述的心脏血管靶向型短肽MI-I经静脉注射使用(注射及介入输入等)，能在活体内特异性靶向心脏血管，并能高亲和靶向粘附在心脏血管内皮细胞表面，从而实现对心脏血管的特异性靶向。③本发明所述的心脏血管靶向型短肽MI-I共由9个氨基酸构成，两端各有一个半胱氨酸，该两端的半胱氨酸之间形成强力二流键使MI-I形成环肽，从而能高亲和性与其结构相配的心脏血管内皮细胞的表面分子相结合；而且其具有分子量小，没有细胞毒性和免疫源性的优点。④本发明所述的心脏血管靶向型短肽MI-I能与其它生物分子连接(如生长因子、基因治疗表达载体、视踪剂、显影剂、生物微囊等)，从而介导所连接的生物分子特异性靶向心脏血管。本发明所述的心脏血管靶向型短肽MI-I由于分子较小，当其与别的生物大分子(如生长因子、基因治疗表达载体、视踪剂、显影剂、生物微囊等)连接之后，能靶向锚定在心脏血管内皮细胞，并介导血管内皮细胞对其的内吞作用，从而介导与之连接的生物大分子跨越血管进入心肌层，从而发挥其靶向治疗的疗效。
图1是由D型氨基酸构成的心脏血管靶向型短肽MI-I的质谱图。图2是静脉注射用FITC荧光标记MI-I的SD大鼠心脏荧光图，其中A为MI-I用量100 μ g组；B为MI-I用量50 μ g组；C为MI-I用量20 μ g组；D为MI-I用量5 μ g组；E 和F为对照组。图3是静脉注射用FITC荧光标记MI-I的SD大鼠不同器官的切片图。图4是静脉注射不同剂量用FITC荧光标记MI-I后的心脏的阳性血管数柱形图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1利用随机短肽文库噬菌体显示体内筛选技术对能高亲和性粘附在心脏血管内皮细胞的短肽进行筛选。具体步骤如下(1)本发明使用随机短肽文库噬菌体显示体内筛选技术对能高亲和性粘附在心脏血管内皮细胞的短肽进行筛选，使用Mo Bi Tec公司的噬菌体显示7肽文库系统，所使用的文库的机理使插入的短肽和噬菌体包膜蛋白III 一起被表达成为融合蛋白，并在插入的短肽基因的两端各加了一个半光氨酸编码序列(TGC)，两个半光氨酸之间的二硫键能使插入短肽向外凸起形成一个环状的结构，易于与其机构相配的蛋白形成高亲和性结合。所使用文库系统含IO9短肽编码序列，每扩增一次，每个序列能产生约200个拷贝，且广泛的扩增未能使文库产生明显的构成短肽序列氨基酸的非随机性偏离。本发明的操作过程如下使用浓度为1012cfU//200y 1，含7肽文库噬菌体进行本研究的体内筛选。使用SD大鼠模型(广东省实验动物中心，本研究所使用的鼠均为达到III 级)进行体内筛选，于大鼠尾静脉注射按照Mo Bi Tec噬菌体显示7肽文库系统说明书中操作步骤制备的200 μ 1的含短肽文库噬菌体(IO12Cfu)，5分钟后，使用PBS (0. OlM ；pH = 7. 4)进行主动脉插管灌注直至灌注流出的液体颜色由红变清，然后分离出经注射的心脏， 置于处于感受态的Ε. coliWK6 XmutS(Mo Bi Tec噬菌体显示7肽文库系统提供)中，回收高亲和性粘附在心脏血管的噬菌体，然后在4°C、8000rpm下离心10分钟，收集上清液，然后再按0. 15体积比加入PEG8000/NaCl (质量体积比16. 7% /3. 3M)溶液，并在4°C、100，OOOrpm 下离心30分钟以收集高亲和性粘附在心脏血管的噬菌体，然后将收集噬菌体使用另一 SD 大鼠使用如上述步骤进行下一轮的筛选，整个筛选共需3个循环，于第三个循环结束后，将单个经筛选的独立克隆进行DNA测序以确定不同克隆噬菌体所编码短肽的DNA序列，然后使用DNA-蛋白序列的互换软件，即可得到相应的氨基酸序列，从而甄别出能高亲和性粘附在心脏血管内皮细胞表面分子的短肽序列。通过上述筛选，筛选到心脏血管靶向型短肽MI-1，其氨基酸序列为 CPRRPGRVC (两端的半胱氨酸之间形成强力二硫键使MI-I形成环肽)，该短肽序列的编码基因序列为:5，-TGC CCG AGG AGG CCG GGG AGG GTT TGC-3，。实施例2合成由D型氨基酸构成的心脏血管靶向型短肽MI-ID型氨基酸构成的短肽能有效地抵抗蛋白酶的降解，因此按照实施例1得到的心脏血管靶向型短肽MI-I的氨基酸序列(CPRRPGRVC)，使用D型氨基酸合成，得到心脏血管靶向型短肽MI-I (简称MI-1)，在合成MI-I时，在氨基端和羧基端的半胱氨酸之间通过二硫键连接，使得到的MI-I呈环状。为了对MI-I的体内靶向能力进行示踪，在合成时，可使用 FITC标记MI-I的氨基端，以便对其进行体内示踪，以确认短肽MI-I的体内靶向心脏能力。 使用质谱确认合成的心脏血管靶向型短肽MI-I的分子量为1041. 3 (如图1所示)，使用高效液相色谱(使用s印axGP-C18柱，溶液A为体积百分比为0. 的三氟乙酸水溶液；溶液 B为体积百分比为80%的丙烯腈水溶液中加入三氟乙酸得到，其中三氟乙酸的终浓度为体积百分比的0. 09% ；测定流速为lml/min，检测波长为220nm)确定纯度大于95%。实施例3
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应用在体实时和离体组织切片观察已证明经静脉使用，环状短肽MI-I能特异性靶向心脏血管并存在最适剂量。(1)在体内实时观察于经麻醉的SD大鼠模型Q50 300g)的尾静脉注射经FITC标记的不同剂量的合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和100 μ g)，并打开经注射动物的胸腔，使用荧光体视显微镜(Olympus-MVXlO)对经注射心脏的血管进行在体实时观察，实施尾静脉注射FITC-环状短肽MI-I (50 μ g组)3分钟后，即在心脏表面的血管壁的发现荧光阳性(如图2的A C中箭头所示)，而作为对照组的注射FITC(0. 005mg/mL)荧光染料的心脏，血管壁的内层不呈荧光阳性(如图3的E和F箭头所示)，在靠近血管部位的心肌组织却呈荧光阳性(如图2的E和F的星号所示)。而在IOOyg组，呈荧光阳性的血管壁的荧光强度与50 μ g组接近，且与50 μ g组相比，有大量的尚未靶向血管壁荧光物存在于管腔的血流中(如图3的A C中箭头所示)。5 μ g和20 μ g组，呈荧光阳性的血管壁的荧光强度明显弱于50 μ g组(如图2的A D)。(2)离体组织切片观察把经FITC荧光标记的合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和 100 μ g)，静脉注射入SD大鼠模型Q50 300g)中，5分钟后分别取出心脏、大脑、骨骼肌、 肝和肾进行冰冻切片，在荧光/白光显微镜下观察经标记的合成环状短肽MI-I体内靶向的情况。本部分的研究结果表明50 μ g合成环状短肽MI-I注射组的心脏有许多血管呈荧光阳性(发绿色荧光)(如图3的A D所示)，而在大脑(如图3的E)、骨骼肌(如图3 的F)、肝(如图3的G)和肾(如图3的H]没有发现有阳性血管。经注射对照短肽-FITC 的心脏未见呈荧光阳性的血管(如图3的I和J所示)。IOOyg合成环状短肽MI-I经注射组的心脏，横切面呈荧光阳性的血管数目与50 μ g组比较，没有显著性差异(P > 0. 05)。 5 μ g和20 μ g合成环状短肽MI-I经注射组的心脏，横切面呈荧光阳性的血管数目显著低于 50 μ g 组(P < 0. 05)(如图 4 所示)。上述研究结果表明(1)合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I-FITC经静脉应用能靶向心脏血管，而在经合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I-FITC注射的大脑，骨骼肌，肝脏和肾脏却未能发现有呈绿色荧光阳性的血管。证明①合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I能特异性地靶向心脏血管；②合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I能作为心脏血管特异性的靶向子。(2)合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I经静脉应用，其特异性靶向心脏血管的能力存在剂量效应，在本模型中，其最适剂量为50 μ g。实施例4应用在体实时观察已证明经静脉使用，环状短肽MI-I特异性靶向心脏血管后， 能跨越血管进入心肌层。于经麻醉SD大鼠模型Q50-300g)的尾静脉注射经FITC标记的不同剂量的合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和100 μ g)，并打开经注射模型鼠的胸腔，使用荧光体视显微镜(Olympus-MVXlO)对经注射的心脏的血管进行在体实时观察，实施尾静脉注射FITC-环状短肽MI-I (50 μ g组)3分钟后，即在心脏表面的血管壁发现荧光阳性，随着时间的推移，在靠近血管部位的心肌组织也逐渐呈荧光阳性。连续观察1小时，经静脉注射FITC-环状短肽MI-I心脏的许多血管仍然呈阳性(如图2B中的箭头所示)。上述结果提示合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I能特异性地靶向心肌的血管内皮细胞，且在靶向血管内皮细胞之后，相当一部分的合成环状心脏血管靶向型短肽MI-I 能停留起码1小时以上，且部分靶向心肌血管内皮细胞的环状短肽MI-I能穿越血管进入心肌层。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种心脏血管靶向型短肽MI-1，其特征在于该心脏血管靶向型短肽MI-I的氨基酸序列如下所示CPRRPGRVC。
2.根据权利要求1所述的心脏血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心脏血管靶向型短肽MI-I为线性肽链或是通过两端的半胱氨酸连接形成的环状肽。
3.根据权利要求1所述的心脏血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心脏血管靶向型短肽MI-I中的氨基酸为L或D型氨基酸。
4.根据权利要求1所述的心脏血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心脏血管靶向型短肽MI-I的核苷酸序列如下所示5，-TGCCCGAGGAGGCCGGGGAGGGTTTGC-3，。
5.权利要求1 4任一项所述的心脏血管靶向型短肽MI-I的应用，其特征在于所述的心脏血管靶向型短肽MI-I用于制备特异性靶向心脏血管的制剂。
6.根据权利要求5所述的心脏血管靶向型短肽MI-I的应用，其特征在于所述的特异性靶向心脏血管的制剂为心脏血管靶向型短肽MI-I与生物大分子连接得到，或通过把编码该MI-I短肽的基因序列克隆到其它表达载体，使MI-I与其它功能蛋白表达为融合蛋白得到。
7.根据权利要求6所述的心脏血管靶向型短肽MI-I的应用，其特征在于所述的生物大分子为生长因子、基因治疗表达载体、视踪剂、显影剂或生物微囊。
全文摘要
本发明公开了一种心脏血管靶向型短肽MI-1与应用。该心脏血管靶向型短肽MI-1的氨基酸序列为CPRRPGRVC，编码该MI-1的核苷酸序列为5’-TGCCCGAGGAGGCCGGGGAGGGTTTGC-3’。该心脏血管靶向型短肽MI-1能高亲和性靶向心脏血管的内皮细胞表面分子，从而能实现对心脏血管的特异性靶向。将其与生物大分子，如生长因子、基因治疗表达载体、示踪剂、显影剂、生物微囊和其它化学结构成分等连接之后，能靶向锚定在心脏血管内皮细胞，并介导血管内皮细胞对其的内吞作用，从而介导与之连接的生物大分子跨越血管进入心肌层，从而发挥其靶向治疗及靶向示踪等功能。
文档编号C07K7/06GK102504015SQ201110388369
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者姚瑶, 曹亮, 李丹, 李震, 沈晓涛, 王键, 蔡冬青, 赵宝寅, 郑馨 申请人:暨南大学