一类抗her2双靶向抗体、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗HER2双靶向抗体、其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。本发明公开的抗HER2双靶向抗体，具有类似全抗体结构与功能的HER2双靶向抗体，既保留了全抗体类似的功能，又可以双靶向HER2靶蛋白，具有比单祀向的HER2抗体Trastuzumab、Pertuzumab更好的抗肿瘤活性。
【背景技术】
[0002]肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病中所致死亡中居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提闻。
[0003]抗体靶向性药物具有特异性好、副作用小、半衰周期长等优点，现今已经成功应用于肿瘤的临床治疗。抗体药物在临床治疗中已经取得了令人鼓舞的治疗效果。1998年美国FDA批准了抗HER2人源化抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab,赫赛汀，herceptin)用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌，成为第一个被FDA批准上市的治疗乳腺癌的人源化单克隆抗体。它是通过基因工程方法，将非特异的人IgG稳定区与特异的鼠抗HER2抗原决定簇组合在一起设计人源化单抗，能与HER2胞外结构域IV特异性结合。赫赛汀自1998年获美国FDA批准上市以来，目前已获准用于新辅助、辅助及晚期HER2阳性乳腺癌的治疗。赫赛汀与化疗药物联合应用可进一步提高HER2阳性乳腺癌患者的治疗效果；赫赛汀与靶向治疗药物，如:拉帕替尼、贝伐单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、来那替尼等联合应用也显示了较好的效果。进一步研究和探讨赫赛汀与其它靶向药物联合，为HER2阳性乳腺癌患者提供更多选择也是临床所需要的。但是在临床治疗过程中Trastuzumab单药的反应率不高，大约12%_34%，其中位生存时间为平均9个月。因此，大多数HER2过表达肿瘤对Trastuzumab单药治疗耐受。事实上，在过表达HER2蛋白的转移性乳腺癌患者中，对Trastuzumab单药治疗的原发性耐药高达66%到88%。进一步的临床III期实验证实,Trastuzumab与紫杉醇或者多西他赛联合用药能够增加反应率，延缓病情进展和延长生存时间。但是即使与化疗药物联合应用，患者在一年之内也会产生对该治疗方法的抵制和耐受。因此，设计具有更强抗肿瘤活性的新型HER2抗体，是现在乳腺癌治疗研究的一个热点。
[0004]Pertuzumab是最近被FDA批准用于临床治疗的另一个HER2人源化单克隆抗体，其能够结合在HER2胞外结构域II区域，通过抑制HER2/HER3异源二聚体的形成，下调PI3K/Akt信号通路的活化水平。而Trastuzumab结合HER2胞外结构域IV,在存在配体的情况下，仅表现出较弱的抑制HER2/HER3 二聚化的作用，目前认为Pertuzumab作用机制与Trastuzumab的作用机制互补。Pertuzumab在临床试验中对转移性乳腺癌表现出良好的抗肿瘤活性，现作为辅助治疗正在进行临床试验。此外，体内和体外的临床前试验数据表明，Trastuzumab与Pertuzumab的联合用药对HER2过表达的乳腺癌细胞系表现出协同互补的抗肿瘤效果。值得注意的是，在人乳腺癌的小鼠模型中，对Trastuzumab治疗后肿瘤仍然进展的小鼠接受Trastuzumab与Pertuzumab治疗能够协同增加对肿瘤的抑制活性。近期报道的，一个针对HER2过表达转移性乳腺癌采用Trastuzumab与Pertuzumab联合用药的II期临床试验的数据与上述临床前试验结果相一致。他们的结果表明，两个抗体的联合应用在临床治疗中耐受性好，其临床获益率为50%。在此基础上，设计了另一个临床试验用于进一步评价Trastuzumab与Pertuzumab联合用药获得如此令人鼓舞的临床疗效中所起的作用。他们的结果表明，在早期Trastuzumab治疗后进展的HER2阳性转移性乳腺癌患者中，采用Pertuzumab单药治疗疗效欠佳,其临床获益率仅为10.3%。而采用Trastuzumab与Pertuzumab联合用药表现出比Pertuzumab单药治疗更加强烈的抗肿瘤活性,其临床获益率为41.2%。近期,采用Trastuzumab、Pertuzumab和多西他赛联合用药作为一线用药用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的临床数据表明，与安慰剂、Trastuzumab和多西他赛联合用药相比，三者联合用药没有增加心脏毒性，而且能够显著延长患者的无进展生存期。这些临床前和临床试验数据提示Trastuzumab治疗耐药后HER2蛋白仍然能够作为一个有治疗价值的祀点，同时祀向Trastuzumab与Pertuzumab作用的HER2胞外结构域IV和II能够克服Trastuzumab治疗耐受。
[0005]然而，几个单克隆抗体的联合用药大大增加了家庭与社会的卫生保健成本和经济负担。更加重要的是，由于目前已经上市的治疗性抗体数量不多，联合用药的选择受到限制。更重要的是，由于肿瘤发生的复杂性，仅仅依靠靶向单个位点的单克隆抗体很难更加有效的杀伤肿瘤，克服肿瘤治疗复发。因此，为更好的解决单克隆抗体靶向单一，增强抗体的抗肿瘤活性等问题，设计一个新型既具有双靶向抗体优点，又具有类似全抗体结构与功能优势的，具有强烈抗肿瘤活性的双靶点抗HER2抗体，是目前亟待解决的问题。
[0006]
【发明内容】
:
为了解决上述问题，本发明的发明人进行了长期研究，经大量试验，利用基因工程技术构建了一类既具有类似全抗体结构与功能，又能够双靶向靶蛋白的新型HER2抗体，该抗体既保留了类似全抗体杀伤肿瘤的优势，又能够双靶向HER2蛋白，表现出比单药亲本抗体，甚至比Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更好的抗肿瘤活性。
[0007]本发明公开了:
1.一种具有类似全抗体结构与功能的新型HER2双祀向抗体Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab,其特征是既具有与HER2全抗体类似的结构与功能,又能够双革巴向HER2蛋白。
[0008]2.上述的双革巴向抗体Tras-Per CrossMab,由四条肽链构成,分别为Trastuzumab重链knob突变体,Trastuzumab轻链,Pertuzumab重链hole突变体,Pertuzumab轻链突变体 PerLV-CHl。
[0009]3.上述的双祀向抗体Tras-Permut CrossMab,由四条肽链构成，分别为Trastuzumab 重链 knob 突变体，Trastuzumab 轻链，Pertuzumab 重链 hole 突变体，Pertuzumab 轻链突变体 PerLV (L56TY) -CHl。
[0010]4.一种分离的核苷酸分子,编码组成上述Tras-Per CrossMab的四条肽链,分别为Trastuzumab重链knob突变体,Pertuzumab重链hole突变体以及Trastuzumab轻链及Pertuzumab轻链突变体PerLV-CHl所述核苷酸序列。
[0011]5.一种分离的核苷酸分子,编码组成上述Tras-Permut CrossMab的四条肽链,分别为Trastuzumab重链knob突变体,Pertuzumab重链hole突变体以及Trastuzumab轻链及 Pertuzumab 轻链突变体 PerLV (L56TY) -CHl。
[0012]6.一种载体，含有上所述的 Tras-Per CrossMab 或者 Tras-Permut CrossMab 核苷酸分子和所述核苷酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为PDR1，pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZEO ( + )，pDHFR 之一。
[0013]7.上述载体，为 pDRl，pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZEO ( + )，pDHFR 之一。
[0014]8.一种宿主细胞，含有上述的载体，为真核细胞。
[0015]9.上述宿主细胞，为哺乳动物细胞。
[0016]10.上述宿主细胞，为CHO细胞。
[0017]11.一种制备上述Tras-Per双祀向抗体,该方法包括:
a)分别克隆Her2抗体Trastuzumab重链可变区及Pertuzumab重、轻链可变区；
b)在抗体Fe区域分别构建knob突变体:T366W,S354C; hole突变体:T366S，L368A,Y407V 和 Y394C ；
c )将Pertuzumab轻链可变区与抗体重链恒定区I (CHl)融合构建PerLV-CHl融合片断，将Pertuzumab轻链可变区突变体L56TY与抗体重链恒定区CHl融合构建PerLV (L56TY) -CHl 融合片断；
d)分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，Pertuzumab重链可变区与抗体轻链恒定区(CL)及hole突变体融合PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3，装入表达载体；
e)将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQID NO: 17), Pertuzumab重链 hole 突变体(SEQ ID NO:19)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:25)及 Pertuzumab轻链突变体(SEQ ID NO:21)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
[0018]f)将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO:17),Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ ID NO: 19)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:25)及Pertuzumab轻链突变体PerLV (L56TY)-CHl (SEQ ID NO:23)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
[0019]12.一种组合物，含有上述Tras-Per双靶向抗体，和药学上可接受的载体。
[0020]13.上述Tras-Per双靶向抗体在制备抗体肿瘤药物中的用途。
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