的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0:25。
[0049]实施例2.抗体轻链恒定区、重链恒定区1、Fe区的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen 公司产品)提取总 RNA,根据文献(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J reg1n genes conserve homology in funct1nalsegments.Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P.Cel1.1980 Nov; 22 (I Pt I): 197-207.)和文献(The nucleotide sequence of a humanimmunoglobulin C gammaI gene.Ellison Jff, Berson BJ, Hood LE.Nucleic AcidsRes.1982 Jul 10; 10 (13): 4071-9.)采用RT-PCR反应扩增抗体轻链恒定区，重链恒定区CHl以及Fe区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:8显示CL氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ IDNO:7 ；SEQ ID NO:10显示Fe氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:9 ； SEQ ID NO:12显示CHl氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 11。
[0050]实施例3.抗体Fe区knob突变体的构建
将实施例2中获得的抗体Fe区，采用overlap PCR的方法引入突变点:T366W，S354C(Schaefer Wff, Regula JTJ, Bahner MM, et al.1mmunoglobulin domaincrossover as a generic approach for the product1n of bispecific IgGantibodies.Proc Natl Acad Sci USA.2011; 108 (27): 11187 - 11192.)。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到PGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQID NO:14显示Fc-knob氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:13。
[0051]实施例4.抗体Fe区hole突变体的构建
将实施例3中获得的抗体Fe区，采用overlap PCR的方法引入突变点:T366S，L368A，Y407V 和 Y394C (Schaefer ffff, Regula JTJ, Bahner MM, et al.1mmunoglobulindomain crossover as a generic approach for the product1n of bispecific IgGantibodies.Proc Natl Acad Sci USA.2011; 108 (27): 11187 - 11192.)。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到PGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQID NO:16显示Fc-hole氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:15。
[0052]实施例5.Trastuzumab重链突变体的构建
以实施例1获得的Trastuzumab重链可变区和实施例3获得的Fe区knob突变体为模板，采用overlap PCR的方法将Trastuzumab重链可变区与Fe区knob突变体进行融合，然后装入表达载体，在Trastuzumab重链的Fe恒定区引入双突变S354C和T366W，构建Trastuzumab 重链 knob 突变体(图 2)。SEQ ID NO: 18 显不 Trastuzumab 重链 knob 突变体氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0:17。
[0053]实施例6.Pertuzumab重链突变体的构建
以实施例1获得的Pertuzumab重链可变区，实施例2获得的CL以及实施例4获得的Fe区hole突变体为模板,采用overlap PCR的方法将Pertuzumab重链可变区与CL及Fe区hole进行片段融合，然后装入表达载体，构建PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3(图3)。SEQ IDNO:20显示Flex-CL-Hinge-CH2-CH3氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:19。
[0054]实施例7.Pertuzumab轻链突变体的构建
以实施例1获得的Pertuzumab轻链可变区，实施例2获得的CHl为模板,采用overlapPCR的方法将Pertuzumab轻链可变区与CHl进行片段融合，然后装入表达载体，构建PerLV-CHl ?采用overlap PCR的方法,在Pertuzumab轻链可变区氨基酸第56位引入突变Tyr (L56TY)。SEQ ID NO: 22显示PerLV-CHl的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:24显示PerLV (L56TY)-CHl的氨基酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:23。
[0055]实施例8.Tras-Per CrossMab的表达与纯化
于3.5cm组织培养皿中接种3 X 15 CH0-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10 μ g Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO:18), Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ ID NO:20)以及 4yg Trastuzumab 轻链(SEQID NO:26)及 Pertuzumab 轻链突变体(SEQ ID NO:22) (Li B, Zhao L, Guo H, et al.Characterizat1n of a rituximab variant with potent antitumor activity againstrituximab-resistant B-cell lymphoma.Blood.2009;114(24):5007 - 5015.)和 20 μ ILipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司产品)分别溶于 500 μ I 无血清 DMEM 培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，COJ?箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600 μ g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:羊抗人IgG (Fe)包被于ELISA板，4° C过夜，用2% BSA-PBS于37° C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Humanmyeloma IgGl, κ)，37° C温育2h，加入HRP —羊抗人IgG ( O进行结合反应，37° C温育lh，加入TMB于37° C作用5min，最后用H2SOjS止反应，测A 45(|值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
[0056]实施例9.Tras-Permut CrossMab的表达与纯化
于3.5cm组织培养皿中接种3 X 15 CHO-Kl细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10 μ g Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO:18)，Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ ID NO:20)以及 4yg Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:26)及 Pertuzumab 轻链突变体PerLV (L56TY)-CHl (SEQ ID NO:24) (Li B, Zhao L, Guo H,et al.Characterizat1n of a rituximab variant with potent antitumor activityagainst rituximab-resistant B-cell lymphoma.Blood.2009;114(24):5007 - 5015.)和 20 μ I Lipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司产品)分别溶于 500 μ I 无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，0)2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600 μ g/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:羊抗人IgG (Fe)包被于ELISA板，4° C过夜，用2% BSA-PBS于37° C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgGl, κ )，37° C温育2h,加入HRP 一羊抗人IgGO )进行结合反应，37° C温育lh，加入TMB于37° C作用5min，最后用H2SOj*止反应，测A 45(|值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化双靶向抗体。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。
[0057]实验例1.双靶向抗体亲和力检测
所有融合蛋白的亲和力通过ELISA方法进行测定【Li B, Zhao L, Wang C，Guo H, WuL, Zhang X, Qian ff, Wang H, Guo Y.The protein-protein interface evolut1