n actsin a similar way to antibody affinity maturat1n.J B1l Chem 2010; 285:3865 -71.】。简要的说，纯化后的抗体与包被在ELISA板上且浓度逐渐增加的HER2-E⑶蛋白孵育I小时。然后采用ELISA法检测游离HER2抗体的浓度进而计算出抗体的亲和力。其中，Tras-Per CrossMab 对 HER2 蛋白的亲和力数值为 2.57 土 0.68 nM, Tras-PermutCrossMab对HER2蛋白的亲和力数值为0.53 土 0.08 nM。
[0058]实验例2.Tras-Per CrossMab及 Tras-Permut CrossMab双祀向抗体的抗增殖活性
BT-474细胞(ATCC HTB-20)细胞在无酚红培养基与抗体37度培养2小时，然后在培养基中加入终浓度分别为5和lnmol / L的人重组EGF和HRG，继续培养4天，然后采用CellTiter 96 AQueous One Solut1n Cell Proliferat1n Assay (Promega)进行检测抗体的抗增殖活性。如图4所不,双祀向抗体Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab表现出比Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更好的肿瘤抗增殖活性。进一步的研究表明，在存在HER2配体的情况下,Tras-Permut CrossMab表现出比Tras-Per CrossMab更强的抗增殖活性。
[0059]实验例3.Tras-Per CrossMab及 Tras-Permut CrossMab双祀向抗体的 ADCC杀伤活性
BT-474细胞(ATCC HTB-20)在不同融合蛋白浓度下，按照E:T比25:1的比例进行培养(37度，4小时)，然后釆用标准的LDH试剂盒(P1mega)进行检测ADCC活性。如图5所不，双祀向抗体Tras-Per CrossMab表现出具有与亲本抗体Trastuzumab及Pertuzumab相似的ADCC杀伤活性。然而，Tras-Permut CrossMab表现出比Tras-Per CrossMab更强的ADCC杀伤活性。
[0060]实验例4.Tras-Per CrossMab及 Tras-Permut CrossMab双祀向抗体诱导细胞死亡活性
将HER2阳性乳腺癌细胞与Tras-Per CrossMab双祀向抗体及Trastuzumab与Pertuzumab按照1:1联合用药共同培养5天。将洗过的细胞釆用SYTOX? Red (Lifetechnologies)染色15分钟以后，进行流式分析。如图6所示，Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双祀向抗体表现出比单药亲本抗体Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更强的诱导肿瘤细胞死亡的能力。
[0061]实验例5.Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双革巴向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性
选取雌性BALB / c裸鼠植入0.72mg 60天缓释的17b_estrad1l pellets(Innovative Research of America)，6 天后在小鼠乳房垫接种米用 PBS:Matrigel 按照1:1比例重悬的BT-474细胞(IXlO7个)。当肿瘤体积达到10mm 3后将荷瘤小鼠釆用随机分组法进行分组后，按照每周两次接种HER2抗体，连续接种四周。通过测量肿瘤体积大小变化评价双祀向抗体的小鼠体内抗肿瘤活性。如图7所示，Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双祀向抗体表现出比单药亲本抗体Trastuzumab、Pertuzumab以及Trastuzumab与Pertuzumab联合用药更强的小鼠体内杀伤肿瘤的能力。进一步的研究表明，Tras-Permut CrossMab表现出比Tras-Per CrossMab更强的小鼠体内肿瘤杀伤能力。
【主权项】
1.一种具有类似全抗体结构与功能的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双革G向抗体，其特征是，既可以与Trastuzumab结合位点相结合,又能够与Pertuzumab结合位点相结合。
2.不仅具备Trastuzumab与Pertuzumab抗体抗肿瘤杀伤的优点，而且表现出比Trastuzumab与Pertuzumab联合使用更强的肿瘤杀伤效果。
3.权利要求1所述的双祀向抗体Tras-PerCrossMab,由四条肽链构成，分别为Trastuzumab 重链 knob 突变体(SEQ ID NO: 18), Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ IDNO:20)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:26)及 Pertuzumab 轻链突变体(SEQ ID NO:22)。
4.一种分离的核苷酸分子，编码权利要求2所述的四条肽链，具有SEQ ID NO:17, SEQID NO:19, SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:21 所述核苷酸序列。
5.权利要求1所述的双祀向抗体Tras-PermutCrossMab,由四条肽链构成，分别为 Trastuzumab 重链 knob 突变体(SEQ ID NO: 18), Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ ID NO:20)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:26)及 Pertuzumab 轻链突变体PerLV (L56TY)-CHl(SEQ ID NO:24)。
6.—种分离的核苷酸分子，编码权利要求4所述的四条肽链，具有SEQID NO:17, SEQID NO:19, SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:23 所述核苷酸序列。
7.一种载体，含有权利要求3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl，pcDNA3.1 (+)或pcDNA3.1/ZE0(+)，pDHFR之一。
8.一种载体，含有权利要求5所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl，pcDNA3.1 (+)或pcDNA3.1/ZE0(+)，pDHFR之一。
9.权利要求6所述的载体，为pcDNA3.1 (+)或pcDNA3.1/ZE0(+)。
10.权利要求7所述的载体，为pcDNA3.1 (+)或pcDNA3.1/ZE0(+)。
11.一种宿主细胞，含有权利要求6或7所述的载体，为真核细胞。
12.权利要求10所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。
13.权利要求11所述的宿主细胞，为CHO细胞。
14.一种制备权利要求1所述的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双革巴向抗体，该方法包括: a)分别克隆Her2抗体Trastuzumab重链可变区及Pertuzumab重、轻链可变区； b)在抗体Fe区域分别构建knob突变体:T366W,S354C; hole突变体:T366S，L368A,Y407V 和 Y394C ； c )将Pertuzumab轻链可变区与抗体重链恒定区I (CHl)融合构建PerLV-CHl融合片断，将Pertuzumab轻链可变区突变体L56TY与抗体重链恒定区CHl融合构建PerLV (L56TY) -CHl 融合片断； d)分别将Trastuzumab重链可变区与knob突变体融合，Pertuzumab重链可变区与抗体轻链恒定区(CL)及hole突变体融合PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3，装入表达载体； e)将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQID NO: 17), Pertuzumab重链 hole 突变体(SEQ ID NO:19)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:25)及 Pertuzumab轻链突变体(SEQ ID NO:21)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
15.f)将构建好的分别装入Trastuzumab重链knob突变体(SEQ ID NO:17),Pertuzumab 重链 hole 突变体(SEQ ID NO: 19)以及 Trastuzumab 轻链(SEQ ID NO:25)及Pertuzumab轻链突变体PerLV (L56TY)-CHl (SEQ ID NO:23)的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
16.一种组合物，含有权利要求1所述的Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab双靶向抗体，和药学上可接受的载体。
17.权利要求1所述的Tras-PerCrossMab及Tras-Permut CrossMab双祀向抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。
18.权利要求14所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
19.权利要求17、18任一所述的用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。
【专利摘要】本发明公开了一类抗HER2双靶向抗体，其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明公开了具有类似全抗体结构与功能的双靶向抗体Tras-Per CrossMab和Tras-Permut CrossMab,其氨基酸序列、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，既保留了全抗体类似的功能，又可以双靶向HER2靶蛋白，具有比单靶向的HER2抗体Trastuzumab、Pertuzumab更好的抗肿瘤活性。
【IPC分类】C12N15-85, A61K39-395, C07K16-46, A61P35-00, C07K16-30, C12N15-13, C12N5-10
【公开号】CN104610453
【申请号】CN201410703689
【发明人】张帆, 赵磊, 杨俊兰
【申请人】张帆
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月23日