大白菜叶绿体来源的小rna及其热响应作用的制作方法

专利名称：大白菜叶绿体来源的小rna及其热响应作用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及大白菜叶绿体来源的小RNA及其热响应作用。
背景技术：
真核生物中，非编码小RNA在许多细胞程序中有重要的作用，例如转录、翻译、剪切，DNA复制以及RNA加工等。在植物中，一个现代的观点认为小RNA通过Dicer-Iike蛋白(DCLs)剪切其茎环结构的前体或双链RNA分子而产生。这些小RNA直接与Piwi/Argonaute (AGO)家族的蛋白作用形成RNA沉默复合体(RISC)。然而,来自动物中的数据显 示小RNA与复合体间的关系更为复杂。最近在哺乳动物中的实验也掲示了小RNA生物合成的分子机制。新一代测序技术产生了大量的测序数据，更掲示了小RNA来源的多祥性，诸如有些小RNA来源于基因组重复区序列，基因间区域，以及tRNA。然而这些研究更多关注于细胞核与细胞质，在动物、植物以及真菌中报道来源于亚细胞基因组，诸如叶绿体和线粒体的小RNA逐渐增多。叶绿体和线粒体被广泛的认为是由细胞中内共生细菌休演化而来，具有独立的环形基因组，有自己的基因表达机制[Dyall SD, Brown MT, Johnson PJ Ancientinvasions fromendosymbionts to organelles. Science 2004,304:253-257」。细胞器基因组的ー个标志是具有转录后调控的优势，包括特异基因及整体范围的RNA加工和运输。在叶绿体中，几个非编码RNA最初在烟草中被发现，并在其他几个被子植物中具有保守性，例如，ー个218-nt长的质体编码的RNA被认为与16S核糖体RNA成熟有关[Vera A,bugiura M A novel RNA gene in the tobacco plastidgenome its possible role inthe maturation of 16S rRNA. EMBO Journal 1994,13 :2211-2217],在烟草叶绿体中发现12个未知功能的非编码小RNA,其中一些预测可形成莖环结构[Lung B, Zemann A, MadejMJ, Schuelke M, Techritz S, Ruf S, Bock R, Hiittenhofer A identification of smallnon-coding RNAs frommitochondria and chloroplasts. Nucleic Acids Res 2006,34:3842-3852]。在叶绿体中，几乎所有的多顺反子转录都被核酸内切酶及核酸外切酶加工，核酸酶可能減少核糖体组装的ニ级结构。此外，叶绿体中RNA 3’端加工使用了原核生物途径，即rho-独立的末端，产生成熟区侧端的莖环结构[Rott R, Drager RG, Stern DB, SchusteLr :The 3’untranslated regions of chloroplast genes inChiamydomonas reinhardtiido not serve as efficient transcriptional terminators. Mo丄 Gen Genet 1996,252:676-683]。尽管如此，与已知的大肠杆菌相比，叶绿体中RNA加工仍然还知之甚少，酶机制仅仅是ー个探索性的开始，其详尽的分子机制仍待阐明。白菜(Brassica rapa ssp. chinensis)是ー种广泛栽培的绿叶蔬菜,其有大量的叶绿体。其特性是在十字花科中与拟南芥亲缘关系最近，因此可通过比较生物学研究其叶绿体发育。白菜适宜的生长温度是18°C到22°C，在长江流域其产量受热压カ影响非常大。在高温天气下，茎和根的生长受到严重抑制，导致叶片褪绿及漂白。在黄化叶子部分，叶绿体积累及发育，以及光合活性都被明显抑制[Yamashita T, Butler WL Jnhibitionof chloroplasts by UV-irradiation andheat-treatment. Plant Physiol 1968,43:2037-2040]，可见叶绿体对热压カ反应剧烈。近年来，大白菜及其他重要经济作物对热反应及抗热育种越来越受到重视，小RNA在抗逆反应中的重要作用也日益受到重视，尤其是叶绿体小 RNA[Lung B, Zemann A, Madej MJ, Schuelke M, Techritz S, Ruf S, BockR, Hiittenhofer A :Identification of small non-coding RNAs from mitochondriaandchloroplasts. Nucleic Acids Res 2006,34:3842-3852]。因此，还需要探索大白菜叶绿体热反应相关的小RNA，进而寻找到有益于提高作物抗热能力的技术手段。

发明内容
本发明的目的在于提供大白菜叶绿体来源的小RNA及其热响应作用。在本发明的第一方面，提供一种筛选具有热响应作用的小RNA的方法，所述方法包括 (I)将2-4周(较佳地2. 5-3. 5周，更佳地3周)大小的热敏感白菜苗在46±0.5°C热处理I ±0. I小时，作为热处理组；以未经热处理的2-4周(较佳地2. 5-3. 5周，更佳地3周)大小的热敏感白菜苗作为对照组；(2)分别提取热处理组和对照组白菜苗的RNA，分别获得热处理组和对照组的小RNA测序数据库，其中小RNA序列的长度为9-36nt ；(3)比较热处理组的小RNA测序数据库与对照组的小RNA测序数据库的序列信息，从热处理组的小RNA测序数据库中分离出相对于对照组的小RNA序列丰度(较佳地，通过测序结果计算丰度变化)显著下降2倍以上(较佳地3倍以上，更佳地4倍以上，更佳地5倍以上)的小RNA序列，其即为(潜在的)具有热响应作用的小RNA。在另一优选例中，所述的小RNA包括mRNA, rRNA, tRNA或基因间RNA(intergenicRNA)。在另ー优选例中，步骤(I)中，将2.5-3.5周(更佳地3周)大小的热敏感白菜苗在46±0. 2°C热处理1±0. 05小时，作为热处理组；以未经热处理的2. 5-3. 5周(更佳地3周)大小的热敏感白菜苗作为对照组。在另ー优选例中，步骤(2)中，在分别提取热处理组和对照组白菜苗的RNA，还包括步骤测序并分离出叶绿体相关的RNA序列。在另ー优选例中，步骤(2)中，通过BLAST分析，将所述的RNA与叶绿体基因组序列进行匹配，从而分离出叶绿体相关的RNA序列。在另ー优选例中，通过Northern blot方法进ー步验证小RNA的表达情况。在另ー优选例中，非热处理的阶段，所述的热敏感白菜在常温下培养。在另ー优选例中，所述的常温是22 ± 3°C。在另ー优选例中，所述的常温是22 ± 2°C ;更佳地，所述的常温是22 ± I °C。在本发明的另一方面，提供一种分离的小RNA，其是通过所述的方法获得的。在另ー优选例中，所述的小RNA具有选自SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供所述的小RNA的用途，用于响应热信号，參与植物的抗热反应。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图I、白菜植株在热压カ下黄化变化。 A、22°C，lh，生长到20天的植株；B,44°C, Ih,生长到20天的植株；C、46°C，lh,生长到20天的植株；D、不同高温处理后叶片发生黄化的时间进程；其中，緑色(叶片绿色)表示热处理后緑色叶片比例，黄色(叶片黄化)表示热处理后黄化的叶片比例。图2、每个测序数据库中csRNA占有比例。A、白菜测序数据库中唯一序列和富集序列中csRNA比例；B、拟南芥数据库中唯一序列和富集序列中csRNA比例；C、白菜和拟南芥测序数据库唯一序列中csRNA同异比例。图3、白菜csRNA在高温及常温培养条件下唯一序列及丰度序列变化。由图中第一列(total即总体上包括所有的叶绿体小RNA，其它几列是细分rRNA，tRNA, mRNA, igRNA)的两个柱形图可以看出，纵坐标是HT比MT，S卩I代表为MT的值，第一列中唯一序列柱形图值为O. 75，即HT是MT的75%，也就是总的叶绿体小RNA (csRNA) HT比MT减少了 25% ;第一列柱形图小RNA总丰度值是O. 64，即HT是MT的64%，也就是总的叶绿体小RNA丰度HT比MT減少了 36%。图4、针对来源于白菜叶绿体ig-RNA的24nt长的csRNA的Northern blot结果。图5、针对来源于白菜叶绿体rRNA的32nt长的csRNA的Northern blot结果。图6、针对来源于白菜叶绿体tRNA的29nt长的csRNA的Northern blot结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次掲示了一种适用于筛选白菜热响应相关的小RNA的方法，所述方法通过对处于特定生长时间段的热敏植株进行适当热处理，然后获取该植株对叶绿体相关小RNA，与非热处理的对照植株的叶绿体相关小RNA进行比较而实现筛选。本发明还提供了一些筛选获得的具有热响应反应的小RNA。术语如本文所用，所述的“植物(作物)”包括各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限干)双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。作为ー种优选方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限干十字花科芸薹属的大白菜、小白菜等，十字花科鼠耳芥属的拟南芥等，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。如本文所用，所述的“白菜(Brassica rapa ssp. chinensis) ”为十字花科芸薹属一年生、二年生草本植物。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“小RNA”是指来源于植物叶绿体的、长度在9_36nt的RNA序列，其潜在地參与了对其相应的靶序列表达的调控。所述的“小RNA”包括但不限于mRNA，rRNA, tRNA,基因间 RNA (intergenic RNA)。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上 由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。所述的“抗热反应”是指植物对于高温的环境所做出的应激反应，植物中一些对高温有响应的基因表达也会发生变化，以适应环境或參与ー些事件以抵抗高热。所述的高温一般指空气温度大于30°C (如35°C，40°C )，而相应的土壤表面温度可高达40-60°C。如本文所用，所述的“唯一序列”是指单一的小RNA序列，就是把所有相同序列的小RNA合并成ー个种类,ー个唯一序列就是ー种小RNA。如本文所用，所述的“丰度”就是ー种序列的小RNA存在的总数量(如序列的条数)，也即相同序列的小RNA的总数量。小RNA的筛选为了高效地获得对热反应响应的叶绿体小RNA，本发明人致力于开发高通量的筛选方法。在研究筛选手段的过程中发现，为了获得具有可比性且差异显著的小RNA序列信息，对热处理组植物的高温处理方法、处理条件(包括温度、时间)是较为关键的，植物所处的生理阶段也是较为关键的。经过深入的研究，本发明人将2-4周大小的热敏感白菜苗在46±0. 5°C热处理1±0. I小时，作为热处理组；将未经热处理的2-4周大小的热敏感白菜苗作为对照组。以该两组为基础，分别从中分离出小RNA(如叶绿体来源的小RNA)，进行丰度和/或表达量的比较，获得热处理后丰度和/或表达量发生显著改变的小RNA，该小RNA或其靶序列可以作为潜在的參与植物抗热反应的物质。本发明的筛选方法中，优选以2-4周大小的热敏感白菜苗进行热处理。本发明人长期研究发现，该周龄的白菜苗对于热处理是较为敏感的，2-4周苗就可以鉴定出对热敏感程度，并在基因的转录、表达上形成差异化。选择2-4周苗进行热处理而非选择种子(如萌动种子)相比，其优点在于2-4周的苗已经具备完全的植株特征，即具有典型的根、茎、叶等生物学特征，这个时期植株本身涉及正常生长发育的基因都已经启动，遗传信息全面，包括各种生理生化反应进程，这个时期进行热处理，可以更好地收集对热反应的遗传信息表达变化,即通过叶绿体小RNA的高通量测序分析，能够全面理解植物叶绿体小RNA对热响应发生的变化，有利于进ー步寻找有抗热价值的叶绿体小RNA。如果利用萌动种子进行热处理，不能提供全面的遗传信息表达规律，即植株没有长成，不具备典型的根、茎、叶等器官组织特征，许多基因没有表达。本发明的筛选方法中，优选在46±0. 5°C进行热处理。本发明人长期研究发现，该温度是适合于筛选工作的，可较好地体现小RNA的表达差异。低于该温度则差异显著性差；高于该温度则导致植物的叶片过快发生黄化甚至死亡。在经过热处理后，白菜苗恢复到在常温条件下培养。用于培养白菜的培养介质没有特别的限制，适合于白菜苗期生长的培养介质均是可用的。RNA序列的比较或匹配是本领域技术人员熟知的技术，常规的例如可通过BLAST法，许多现有的软件也可支持序列比较。丰度的测定可通过小RNA高通量测序(Illumina GAII)的方法測定，或通过本领域已知的其它方法进行。小RNA的表达量可通过领域技术人员熟知的技术来获得，常规的例如通过Northern印迹技木，例如可设计特异性针对该小RNA的探针(携帯可检测信号，如荧光)来測定。
在本发明的具体实施例中，本发明人选取了热敏感的白菜品系，给予不同温度处理，寻找到一个比较合适的热处理条件，即3周大小的种苗46°C热处理lh，对照为正常生长条件下种苗，分别对处理和对照种苗进行提取叶绿体RNA样品，然后送样进行小RNA高通量测序。获得高通量小RNA测序结果，经过去测序接头序列后，再除去质量差的序列，获得了比较理想的热处理和对照组的白菜叶绿体小RNA高通量测序数据库。对数据库分析发现，叶绿体小RNA包括了 mRNA，rRNA, tRNA,以及基因间RNA(intergenic RNA)，其中rRNA来源的小RNA主要集中定位在rRNA的3’端，而tRNA来源的小RNA主要定位在tRNA的5’端。热处理后，叶绿体来源的小RNA大量減少，除了 24nt长的小RNA。热反应作用的小RNA本发明还包括采用所述筛选方法获得的小RNA，这些小RNA是对高温具有响应作用的小RNA，也是潜在的參与植物抗热作用的小RNA。这些筛选获得的小RNA可以构成ー个库，便于进行进ー步的实验或研究，从中找到确定的參与植物抗热作用的小RNA。作为本发明的优选方式，提供了 3个新的白菜叶绿体小RNA，它们分别为来自ig-RNA 的 24nt 长的 UUCAUGGACGUUGAUAAGAUCUUU (SEQ ID NO 1);来自 rRNA 的 32nt 长的 UGAGGCAUCCUAACAGACCGGUAGACUUGNAC (SEQ ID NO 2, N 表示 A、U、C 或 G)；以及来自 tRNA 的29nt 长的 GGGGAUAUAGCUCAGUUGGUAGAGCUCCG(SEQ ID NO :3)。在热处理过程中，这三个小RNA热反应变化最大，这些新的叶绿体小RNA可能在植物抗热反应中起作用，更可能调控叶绿体RNA加工，蛋白质翻译以及亚细胞信号，从而为作物抗热育种开辟新的认识方式及理论依据。采用所述方法筛选获得的小RNA所对应的靶基因也是研究的对象，小RNA表达或丰度的显著降低预示着其靶基因的表达也发生了变化，因此这些靶基因是潜在的參与植物抗热作用的基因。下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法植物材料与培养条件白菜热敏感系Wu-Il(种子来自于上海孙桥农业科技有限公司)。将白菜种子浸润，播在培养皿中，22°C培养至种子萌发，I周后，萌发的幼苗转移到土盆中，人工气侯室继续培养，22°C，每天光照16h，黑暗8h。3周大小的种苗46°C热处理lh，恢复22°C正常培养。观察叶片黄化的情況。另有一部分热处理后种苗直接提取总RNA。对照为22°C正常培养，以确定小RNA的表达模式。RNA提取和质量检测 上述条件热处理后样品(热处理后直接提取RNA)及对照种苗在液氮中研磨，每个样品10株苗分成两个重复,使用TRIzol Reagent (Invitrogen)提取总RNA。RNA样品浓度和质量利用 Eppendorf Biophotometer 6121 (Eppendorf)检测，样品中的 DNA 利用 TURBODNA-free kit (Ambion)去除。具体如下I)液氮中将材料研磨充分。2)研磨好的材料转到EP管中，加Iml Trizol。3)震荡，室温放置10分钟。4)加入O. 2ml氯仿，震荡，室温放置10分钟。5)4で，12000rpm，离心 10 分钟。6)取上清，加入I倍体积异丙醇，混匀，冰上放置15分钟。7) 4°C, 12000rpm 离心 10 分钟，弃上清。8)70%こ醇洗ー次，离心(4で，12000印111，5分钟)，弃上清。超净台吹干。9)用30 μ I DEPC处理过的水溶解，_70°C存放。叶绿体分离种苗样品中叶绿体分离使用蔗糖梯度离心Percoll (GE，17089101)gradient-Dased method[Kubis bE, Lilley KS, Jarvis P-Isolation and preparationofchloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.Methods Mol Biol 2008,425:171-186]。叶绿体的完整度利用显微镜观察检验(Olympus BX51 wide-fieldmicroscopewith differential interference contrast)和 Hill reaction[Bregman A Laboratoryinvestigations in cell and molecular biology (Third Edition)New York John Wiley& Sons ； 1990]。小RNA高通量测序及序列分析大白菜及拟南芥总RNA 样品被送到 Keygene N. V. , ffageningen, theNetherlands和浙江大学加州纳米研究所(Zhejiang-California Nanosystemslnstitute,China),利用Illumina GAII sequencer 进行测序。使用 EMBOSS 软件包的 vectorship 去除 Illumina接头序列，长度为9 36nt的小RNA序列匹配到白菜叶绿体基因组(GenBank accessionnumber DQ231548)of Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis)以及拟南芥基因组(http://www.arabidopsis.org)。所有的数据在比较分析前都进行均一化。Northern blot 分析
RNA (20 μ g)样品在19%变性聚丙烯凝胶电泳(PAGE)上分离，利用毛细管作用在 20 X SSC 溶液中转移到 Hybond-XL 膜(Amersham biosciences-GEhealthcare)上，利用UV-crosslinking 固定在膜上。预杂交 42°C, 2X 30min,使用杂交液 PrefectHyb(Sigma)。DNA 探针利用 T4polynucleotide kinase (Roche)标记上 y 32P ATP (5000Ci/mmol)。杂交42°C过夜。RNA分子大小用32P-标记的Decade Marker System(Ambion)做标记。为了分析叶绿体转录本积累情况，另ー个RNA转移膜按照Bollenbach TJ, Schuster G, SternDB Cooperation ofEndo-and Exoribonuclease in cnloroplast mRNA turnover.ProgNucleic Acid ResMol Biol 2004，78 :305-377 方法进行分析。环形RT-PCR (cRT-PCR)
叶绿体小RNA的5’和3’端精确位置利用环形RT-PCR获得。DNase酶处理过的叶绿体RNAs样品在40单位(U)的T4RNA连接酶(New England Biolabs)作用下，产生5’与3’端连接的环形RNA分子。用酹-氯仿抽提后，在反转录酶Revertra Ace (TRT-101,Toyobo)和特异引物作用下，单链cDNAs被合成。接下来利用PCR扩增产物，正向引物(cRTPrimer I gctcgacgccaggatg(SEQ ID NO :7))同 csR-5sr-l,反向引物(cRT Primer 2:gtgttaagcttttcat(SEQ ID NO :8))。PCR 条件 30 个循环，94 °C，30s，48 °C，30s 和 72 °C，30s。cRT-PCR 产物用 MagExtractor (NPK-600，Toyobo)纯化，然后连接到测序载体 pMD18_Tvector (D101A, Takara)送样测序。II.实施例实施例I、不同温度和时间处理条件下叶片白化水平——确定热处理条件为确定高温对叶片白化的影响，本发明人将白菜种苗置于44，45，46，47和48°C，分别处理O. 5，1和2小时。如图I所示，种苗在44°C处理0.5h，生长与正常22°C (MT)下相同，当在44°C处理lh，其生长比正常条件下缓慢，热处理后22天叶片开始黄化。这指出44°C，lh热处理引起种苗形态和生理发生变化。温度提高及处理时间延长，生长受抑制表现更为严重(图1D)。本发明人发现，热处理46°C、lh，种苗在处理后12天叶片开始黄化(图1C);热处理47°C、lh，叶片黄化在热处理后第5天。这掲示了 47°C、lh是这一生态型植株热忍受警戒线。由于在早期基因表达和生理反应之间的不同，如果选用热处理47°C、lh，种苗的叶片过早黄化，有些热响应基因还没有得到充分热响应表达就因种苗生长受到抑制而被印制；如果选用热处理44°C，lh，种苗对热反应引起的形态和生理变化缓慢，不能更好地表现出热响应基因应有的热响应表达模式，因此，从热反应表型作为依据，本发明人选择分别以46°C处理I小时(HT，热处理组)和正常温度22°C (MT，对照组)处理用于小RNA高通量测序并比较，能够更好地反应出热响应小RNA的热响应表达模式的变化。实施例2、白菜叶绿体基因组产生的小RNA-测序数据分析，将小RNA序列匹配
到叶绿体基因组上为了解白菜小RNA表达模式，本发明人对HT和MT处理种苗提取的RNA样品进行测序，利用 Illumina Genome Analyzer MiRvana kit (Ambion, Inc)分析 9-36 核苷酸(nt)长度的小RNA。两个重复HT处理分别产生1460万(HTl)和1280万(HT2)个序列读数，两个重复MT处理分别产生1470万(MTl)和1130万(MT2)个序列读数。为了从整个序列读数群中选择叶绿体小RNA，本发明人去除接头序列后，对白菜基因组序列进行BLAST，整理出完全匹配到叶绿体上的小RNA,命名为叶绿体相关小RNA(chloroplast_related smallRNA(csRNA))。本发明人从MT和HT中分别获得2，228，924和I, 331，972个csRNA,分别代表了142，542个和97，337个唯一小RNA序列，分别占总小RNA数(以HTl和MTl的读数计)的约15% (叶绿体小RNA丰度占总小RNA丰度的比值，(2，228，924/1470万)X 100% )和约10% ((I, 331，972/1460 万)X 100% )(图 2A)。通过对拟南芥叶绿体基因组DNA匹配，多于96%的白菜csRNA完全匹配到拟南芥叶绿体基因组上。拟南芥数据库中唯一序列和富集序列中csRNA比例见图2B。白菜和拟南芥测序数据库唯一序列中csRNA同异比例见图2C。实施例3、csRNA的抗热反应——热处理与对照之间小RNA表达差异(表现为丰度和种类)在亚细胞水平，热压カ严重损害了叶绿体活性和结构[Smillie RM, CritchleyC,Bain JM, Norr REffect of Growth Temperature on Chloroplast Structure·andActivity in Barley. Plant physiol 1978,62 :191-196],例如叶绿体 Cu/Zn 过氧化物超氧歧化酶丢失和对光合系统II损害增加[Sainz M, Diaz P, Monza J, BorsaniO Heatstress results in loss of chloroplast Cu//,n superoxide dismutase anaincreaseddamage to Photosystem II in combined drought—heat stressed Lotusjaponicus.Physiol Plant 2010,140 :46-56]。植株在46°C处理I小时，与常温状态比，csRNA明显减少，分别为常温总量的25%唯一序列和36%丰度(图3)。实施例4、一组来源白菜叶绿体的csRNA热响应作用对实施例2获得小RNA测序样本数据库进行统计分析，选取热处理与对照相比较表达下降超过5倍的典型的小RNA序列,表达变化通过丰度体现,之后可进ー步用Northernblot验证这种表达的变化，即在热处理中下降。通过高通量测序结果分析热处理组小RNA序列和对照组小RNA序列，本发明人确定了在常温及高温条件下变化剧烈(表达量降低5倍以上)的小RNA对热反应响应。找到的对热反应响应的小RNA分别为来自ig-RNA 的 24nt 长的 UUCAUGGACGUUGAUAAGAUCUUU (SEQ IDNO 1);来自 rRNA的 32nt 长的 UGAGGCAUCCUAACAGACCGGUAGACUUGNAC(SEQ ID NO :2，N 表示 A、U、C 或 G);以及来自 tRNA 的 29nt 长的 GGGGAUAUAGCUCAGUUGGUAGAGCUCCG(SEQ ID NO :3)。它们的更为详细的信息如表I。表I、HT中相对于MT下调至20%以下的CsRNAa
CSRNAim 大た丰度(Reads)bmm被CDS信息
__Μ._
__腸腿一 I ^=|
^^^^GA^UCCG7 29 5359 4742 507 539 102742..102770 tm-Ala—3 tRNA stmnd=+ 103665 103702 hi1=2CMUAAGAUCTOU 24 1914 1543 333 299 103694..103717 ig-RNA 114 ig-RNA stamd—+ 104539 104690 hit-2ACCC^AGACUUGNAC 32 6 20 1 1 106746..106777 4.5S rm rRNA strand=+ 107599 107701 hit=^
a:所述的下调表示(ΗΤ-1+ΗΤ-2)/(ΜΓ-1+ΜΤ-2) < 0.2b:所述的为在标准化—midi—on)之前的序列读数用Northern blot进ー步确证小RNA对温度的反应(即验证其表达量变化)。针对来源于白菜叶绿体ig-RNA 的 24n 长 csRNA (SEQ ID NO I)的 Northern blot结果见图4，探针序列为TTCATGGACGTTGATAAGATCTTT(SEQID NO 4)的反向互补序列。针对来源于白菜叶绿体rRNA的32nt长csRNA (SEQ ID NO 2)的Northernblot结果见图 5，探针序列为 TGAGGCATCCTAACAGACCGGTAGACTTGNAC(SEQ ID NO 5)的反向互补序列。针对来源于白菜叶绿体tRNA的29nt长csRNA (SEQ ID NO 3)的Northernblot结果见图6，探针序列为GGGGATATAGCTCAGTTGGTAGAGCTCCG(SEQID NO 6)的反向互补序列。实施例5、csRNA对植物抗热有重要作用叶片黄化是植物对高温敏感的ー个重要指标，当细胞内环境暴露在温和热压カ下，类囊体膜结构受到损害，光合系统I中电子传递流动量増加，导致产生大量光氧化压力和伴随释放高強度细胞毒性的自由基和活性氧。当叶绿体亚细胞结构在热压カ下受损，光合能力急剧下降。这个改变通常伴随叶片黄化。对于白菜抗热品系，相对于热敏感品系，叶片黄化出现的较晩，较轻。高温条件下，46°c处理lh，叶片黄化后csRNA大量減少。提示热响应csRNA跟叶片黄化表型有夫。ー个合理解释是热响应csRNA具有维持叶绿体亚细胞结构和光合能力的作用。当植株暴露在高温条件下，热响应csRNA生物合成受抑制，导致这些csRNA丰度急剧降低。或者可以认为，热响应csRNA在高温条件下降解。每ー个csRNA參与调控叶绿体亚细胞结构和光合能力中的基因表达，植物叶绿体的这个生物加工与叶片发育是紧密相关联的，这个过程也包括了ー些miRNAs参与。结论叶绿体是ー个重要的器官，其含有大量的小RNA，本发明人的试验数据表明，叶绿体小RNA不是RNA降解或生物合成的随机产物，而是ー类新的有精确定位的小RNA，在叶绿体RNA加工、翻译调控和信号转导过程中有重要抗热调节作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为參考，就如同每ー篇文献被単独引用作为參考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选具有热响应作用的小RNA的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)将2-4周大小的热敏感白菜苗在46±0.5°C热处理I±0. I小时，作为热处理组；以未经热处理的2-4周大小的热敏感白菜苗作为对照组； (2)分别提取热处理组和对照组白菜苗的RNA，分别获得热处理组和对照组的小RNA测序数据库，其中小RNA序列的长度为9-36nt ； (3)比较热处理组的小RNA测序数据库与对照组的小RNA测序数据库的序列信息，从热处理组的小RNA测序数据库中分离出相对于对照组的小RNA序列丰度显著下降2倍以上的小RNA序列，其即为具有热响应作用的小RNA。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的小RNA包括mRNA，rRNA,tRNA或基因间 RNA。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，将2.5-3. 5周大小的热敏感白菜苗在46±0. 2°C热处理1±0. 05小时，作为热处理组；以未经热处理的2. 5-3. 5周大小的热敏感白菜苗作为对照组。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在分别提取热处理组和对照组白菜苗的RNA，还包括步骤测序并分离出叶绿体相关的RNA序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过BLAST分析，将所述的RNA与叶绿体基因组序列进行匹配，从而分离出叶绿体相关的RNA序列。
6.如权利要求I所述的方法,其特征在于,通过Northernblot方法进ー步验证小RNA的表达情况。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，非热处理的阶段，所述的热敏感白菜在常温下培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的常温是22±3°C。
9.一种分离的小RNA，其是通过权利要求1-8任一所述的方法获得的。
10.如权利要求9所述的小RNA，其特征在于，所述的小RNA具有选自SEQIDNO 1,SEQID NO :2或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
11.权利要求9或10所述的小RNA的用途，用于响应热信号，參与植物的抗热反应。
全文摘要
本发明涉及大白菜叶绿体来源的小RNA及其热响应作用。首次揭示了一种适用于筛选白菜热响应相关的小RNA的方法，所述方法通过对处于特定生长时间段的热敏植株进行适当热处理，然后获取该植株对叶绿体相关小RNA，与非热处理的对照植株的叶绿体相关小RNA进行比较而实现筛选。本发明还提供了一些筛选获得的具有热响应反应的小RNA。
文档编号C12N15/11GK102690820SQ20111007430
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者于祥, 何玉科, 孙传宝, 王晗, 王璐 申请人:中国科学院上海生命科学研究院