专利名称：人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列，及其在制备HIV免疫原中的应用，在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用，在制备HIV检测试剂盒中的应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDQ，即艾滋病。据联合国艾滋病规划署2009年底新的统计，目前全球HIV感染者约6000万，2500万人死于艾滋病相关疾病。 我国现存HIV感染者和艾滋病病人约70多万，其中70%以上为性接触传播，艾滋病已经成为我国及全球所面临的重大公共卫生问题。目前采用高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽能延缓艾滋病病情的发展，但不能完全清除病毒；行为干预也仅减缓HIV感染传播速度而无法终止其流行。因此，迫切需要开发研制新的有效的药物以控制HIV的传播和感染。感染人类的HIV有HIV-I和HIV-2两型，两者核苷酸序列相差可超过40%。世界各地主要流行的是HIV-I，HIV-2则主要流行在非洲西部地区。HIV-I(trans-activator of transcription, Tat) ^ HIV-I 感染早期产生的重要调控蛋白。根据HIV-I毒株的不同，Tat蛋白由86-101个氨基酸残基组成，由两个独立的外显子编码第1个外显子编码1-72位氨基酸(aa)，具有完全的转录激活活性；第2外显子编码Tat C末端区(73-lOlaa)。试验证实Tat在HIV-I复制、扩散及致病中起重要作用。研究表明，在感染细胞内，Tat可反式激活HIV基因组转录的起始和延长，从而启动和促进病毒的复制；而分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性， 如参与免疫抑制、神经系统损伤及Kaposi肉瘤形成等致病过程，被称为“病毒毒素”(参见文献:Silvers JM, Aksenova MV, Aksenov MY, Mactutus CF, Booze RM. Neurotoxicity of HIV-ITatprotein :involvement of Dl dopamine receptor. Neurotoxicology. 2007 ； 28(6) :1184-1190. )。Tat上述生物学特性及致病效应已使其成为HIV预防性及治疗性疫苗的候选抗原之一。HIV-ITat分子为天然非折叠蛋白，属于无规卷曲类型的分子。虽然Tat序列在 HIV-I不同亚型间具有高度保守性，但其缺乏稳定二级结构和高级结构，使其分子构象极不稳定，处于快速动态的变化之中。上述HIV-I Tat分子本身的序列及结构特征，使得天然 Tat作为HIV疫苗的候选抗原尚存在诱发免疫保护性抗体滴度低、交叉反应性差等不足。因此通过分子生物学手段，对HIV-I天然Tat分子结构进行改造，是获得分子构象相对稳定的新型Tat免疫原的一条有效途径，具有潜在的HIV疫苗开发价值。
发明内容
本发明的目的在于制备构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV Tat 免疫原。
本发明通过对人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I) HXB2株天然Tat (参见文献0pi S, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Campbell G, de Mareuil J, Walburger A, Solomiac Μ, Gregoire C, Bouveret Ε, Yirrell DL, Loret EP. Tat HIV-I primary andtertiary structures critical to immune response against non-homologous variants. JBiol Chem. 2002 ；277 (39) :35915-35919.)分子不同区段进行合理截取，即取 Tatl-37、Tat 1-61 和Tat22-101区段分别构建原核表达质粒，经过转化大肠杆菌(E. coli)BL21 (DE3)，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl^-D-l-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，以及经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western blot鉴定，筛选获得三种构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-ITat免疫原，本发明制备获得的HIV-ITat免疫原在国内外未见报道。本发明提供了以下三种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列一、Tat突变体抗原1 (Tatl-37)由37个氨基酸组成，其氨基酸序列为H2N-MEPVD PRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVC-COOH(如 SEQ ID NO :2 所示)；编码Tatl-37突变体的核苷酸序列为5 ‘ -ATGGAACCGGTTGACCCGCGTCTGGAACCGTGGAAACACCCGGGTTCTCAGCCGAAAACCGCTTG CACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTGCTTCCACTGCCAGGTTTGC-3 ‘(如 SEQ ID NO 1 所示)。二、Tat突变体抗原2 (Tat 1-61)由61个氨基酸组成，其氨基酸序列为H2N-MEPVD PRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRAHQN-COOH(如 SEQ ID NO :4所示)；编码Tatl-61突变体的核苷酸序列为5 ‘ -ATGGAACCGGTTGACCCGCGTCTGGAACCGTGGAAACACCCGGGTTCTCAGCCGAAAACCGCTT GCACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTGCTTCCACTGCCAGGTTTGCTTCATCACCAAAGCTCTGGGTATCTCTTAC GGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGCT CACCAGAAC-3‘(如 SEQ ID NO 3 所示)。三、Tat突变体抗原3(Tat22_101)由80个氨基酸组成，其氨基酸序列为H2N-CTN CYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPVD-C00H(如 SEQ ID NO 6 所示)；编码Tat22_101突变体的核苷酸序列为5 ‘ -CCGAAAGAATCTAAAAAAAAAGTTGAACGTGAAACCGAAACCGACCCGGTTGACTCTGGGTATC TCTTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTCACCAGAACTCTCAGACCCACCAGGCTTCTCTGTCTAA ACAGCCGGCTTCTCAGCCGCGTGGTGACCCGACCGGTTGCACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTGCTTCCACTGCC AGGTTTGCTTCATCACCAAAGC-3‘(如 SEQID NO 5 所示)。本发明还提供了上述人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV免疫原中的应用。本发明还提供了上述人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。本发明还提供了上述人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV检测试剂盒中的应用。与天然HIV-ITat抗原相比，以上三种HIV-ITat融合抗原的表达量高，构象相对稳定，实验结果表明以上三种抗Tat突变体蛋白兔抗血清(抗Tatl-37-PET、抗Tatl-61-PET和抗Tat22-101-PET)均与HIV-I全长Tat蛋白呈特异性反应；尤其是Tat22_101能诱导产生更强的针对HIB-ITat C端抗原的免疫反应。本发明的HIB-ITat突变体免疫原的制备方法如下(1)以pMD18-T-tatl-101质粒(参见文献陈璐，潘卫，曹洁，卢海妹，何俊，蒋少华，唐萍，李存枚，廖文婷，邓松华；HIV-1HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析；安徽医科大学学报，2008 ；43 (3) =239-243)为模板，用PCR方法扩增3个目的基因的DNA片段(tat 1-37、tat 1-61和tat22-101)，经1· 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR 扩增的目的基因片段大小与理论值相符，分别为lllbp、18;3bp和MObp。(2)用胶回收试剂盒回收PCR产物，该3种目的片段tatl-37、tatl-61和 tat22-101分别与克隆载体pMD18-T(T载体)连接，连接产物转化大肠杆菌(E. coli) DH5 α，取单克隆转化菌落经PCR鉴定为阳性后，再进行测序鉴定。(3)抽提测序正确的阳性克隆质粒，以其为模板用PCR方法分别扩增含3种目的基因的DNA片段，用胶回收试剂盒回收PCR产物，分别经BamH I和Hind III两种限制性内切酶酶切并回收目的片段，再分别与同样经BamH I和Hind III酶切后的表达载体 pET3h连接，连接产物转化Ε. coli DH5ci。抽提单克隆转化菌落的质粒并进行PCR、酶切鉴定及序列测定，测序正确的重组质粒分别命名为pET3h-Tatl-37、pET32a-Tatl-61和 pET32a-Tat22-101。(4)用上述3种重组质粒分别转化Ε. coli BL21 (DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 检测和Wfestern blot试验，结果表明表达的3种Tat突变体融合蛋白(Tatl-37-PET、 Tat 1-61-PET和Tat22-101_PET)的分子量大小与理论值相符，分别为22千道尔顿(KDa)、 24. 9KDa和26. 9KDa,通过亲和层析法分别对上述3种Tat蛋白进行纯化，经Glyko BandScan 5. O软件分析显示纯度分别为94. 4%,86. 6%,86. 6%0(5)取上述3种Tat突变体蛋白分别经皮下注射新西兰大白兔，首次免疫用弗氏完全佐剂，第二、三、四次用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫1次，最后一次免疫两周后经颈总动脉大量取血，离心后取上清于-40°C保存。(6)取上述3种免疫兔抗血清(抗Tatl-37-PET、抗Tatl-61-PET和抗 Tat22-101-PET)分别检测其与融合表达的HIV-1全长Tat蛋白(Tatl-lOl-PEP，*_PEP为另外一种载体PPEPTIDE2表达的融合蛋白)、Tat C末端融合表达抗原(Tat49-101_PEP和 Tat60-101-PEP)的反应性，经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，该3种兔抗血清均与HIV-I 全长Tat蛋白呈特异性反应，其中抗Tat22-101-PET血清与上述两种Tat C端抗原的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强。经SDS-PAGE分析和^festern blot鉴定，表明本发明的三种HIV-ITat突变体蛋白 (Tatl-37-PET、Tat 1-61-PET 和 Tat22_101_PET)均得到了良好表达。经 ELISA 试验验证， 表明抗该发明的三种Tat突变体蛋白的兔抗血清均与HIV-I全长Tat蛋白呈特异性反应， 其中抗Tat22-101-PET血清与两种Tat C端抗原Tat49_101_PET和Tat60_101_PET的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强，提示Tat22_101可作为一种新的Tat免疫原，能诱导产生有更高滴度的针对Tat C端的抗体，有望达到阻断野生型Tat蛋白生物学功能的作用，可用以制备抗HIV感染多肽药物的组成成分或作为制备HIV Tat疫苗的候选抗原。
图1是体外合成三种目的基因片段的PCR产物琼脂糖电泳图M, DL2000Marker (从上至下 DNA 片段大小依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1，tatl-37 (Illbp) ；2，tatl-61 (183bp) ；2. tat22-101 (240bp) (注1， 2，3泳道上面的条带均为目的条带，下面的条带为PCR扩增时引物之间形成的二聚体)。图2是三种重组表达质粒的PCR鉴定结果A，PCR 鉴定重组质粒 pET3h-Tatl_37 ；Μ, DL2000Marker ；1-7,阳性单克隆菌落质粒的PCR产物；8，阴性对照(DH5 α空菌对照)。B，PCR鉴定重组质粒pET3h-Tatl_61 ；Μ, DL2000Marker ;1-8，阳性单克隆菌落质粒的PCR产物。9.阴性对照(DH5a空菌对照。C， PCR鉴定重组质粒pET3^i-Tat22-101 ；Μ, DL2000Marker ；1-5,阳性单克隆菌落质粒的PCR 产物；6，阴性对照(DH5 α空菌对照)。图3是三种重组表达质粒的酶切鉴定结果Α，酶切鉴定重组质粒 pET32a-Tatl-37 ；Μ, DL2000Marker ； 1，Hind III 和 Bam H I酶切后产物；2，未酶切pET32a-Tatl-37 ；B,酶切鉴定重组质粒pET32a_Tatl_61 ；Μ, DL2000Marker ；1，Hind III 和 Bam H I 酶切后产物；2，未酶切 pET32a_Tatl_37 ；C，酶切鉴定重组质粒 pET32a-Tat22-101 ；Μ, DL2000Marker ； 1，Hind III 和 Bam H I 酶切后产物；2， 未酶切pET3h-Tat22-101。图中箭头表示双酶切后产物中与预期目的基因大小相同的DNA 片段。图4是三种Tat突变体融合蛋白表达的SDS-PAGE分析结果M，蛋白Marker ；l，Tatl-37_PET融合蛋白经IPTG诱导表达后细胞裂解液上清；2， Tatl-37-PET融合蛋白未经IPTG诱导的细胞裂解液上清；3，Tatl-61-PET融合蛋白经IPTG 诱导后细胞裂解液上清；4，Tatl-61-PET融合蛋白未经IPTG诱导的细胞裂解液上清；5， Tat22-101-PET融合蛋白经IPTG诱导后细胞裂解液上清；6，Tat22-101-PET融合蛋白未经 IPTG诱导的细胞裂解液上清；7，阴性对照(BL21 (DE3)空菌裂解液上清)。图5是三种Tat突变体融合蛋白纯化后SDS-PAGE分析及flfestern blot鉴定结果A，三种Tat突变体融合蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果。M，蛋白Marker ；1，纯化后Tatl-37-PET融合蛋白；2，纯化后Tatl_61_PET融合蛋白；3，纯化后Tat22-101-PET融合蛋白。B，三种Tat突变体融合蛋白纯化后flfestern blot鉴定结果。1，Tatl-IOl-PET融合蛋白(阳性对照)；2，纯化后Tatl-37-PET融合蛋白；3，纯化后 Tat 1-61-PET融合蛋白；4，纯化后Tat22-101_PET融合蛋白；5，pET3h载体蛋白(阴性对照)。图6是三种兔抗血清与HIV-I全长Tat融合蛋白(Tatl-101-PEP)反应的抗体滴度测定结果。图7四种抗Tat兔抗血清分别与两种HIV-ITat C端抗原的反应性A，抗 Tat 兔抗血清(抗 Tatl_37_PET、抗 Tatl_61_PET、抗 Tat22_101_PET 和抗 Tatl-101-PET)分别与Tat C端抗原Tat49_101_PEP的反应性；B，抗Tat兔抗血清(抗 ^ 1-37-ΡΕΤ、抗!"atl-ei-PET、抗 Tat22-101-PET 和抗 Tatl-101-PET)分别与 iTat C端抗原 Tat60-101-PEP 的反应性。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1 通过重组质粒的构建、原核表达及融合蛋白的免疫原性分析获得能与 HIV-I全长Tat蛋白呈特异性反应的三种截短的Tat蛋白突变体序列1、目的基因的体外合成用PCR方法体外合成编码HIV-ITat三个肽段的DNA片段。PCR反应体系包括模板 pMD18-T-tatl-101 质粒 IOng ；分别以引物 37-U 和 37_D、61_U 和 61-D 以及 101-U 和 101-D 为上下游引物各取2μ1(浓度为0. OlmM)(引物序列见表1) ；Taq酶1. 5U，dNTP IOOymol, Mg2+3mmol，反应体积 50 μ 1。PCR 扩增条件为94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 40s, 30 个循环；72°C IOmin0经1. 5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，结果PCR扩增的3个目的片段(tatl-37、tatl-61和tat22_101)大小与理论值相符，分别为lllbp、183bp和 240bp (见图 1)。表1体外合成目的基因的引物名称及其序列
名称描述序列37-U合成tatl-37上游引物CCGCCGGGATCCATGGAACCGGTTGACCCG (如 SEQ IDN0 7所示)37-D合成tatl-37下游引物GCCGCCAAGCTTCTAGCAAACCTGGCAGTGGAAG (如 SEQIDNO:8 所示)61-U合成tatl-61上游引物CCGCCGGGATCCATGGAACCGGTTGACCCG (如 SEQ IDNO:9 所示)61-D合成tatl-61下游引物GCCGCCAAGCTTCTAGTTCTGGTGAGCACGACG (如 SEQ ID N0:10 所示)IOlU合成tat22-101上游引GAACGGATCC TGCACCAACTGCTACT (如 SEQ ID物NO: 11所示)IOlD合成tat22-101下游引TGCTAAGCTTCTAGTCAACCGGGTCGGT (如 SEQID物NO: 12所示)2、目的基因克隆至pMD18-T载体用胶回收试剂盒3S DNA Gel Purification Kit 3. 1 分别回收纯化 tatl-37、 tatl-61和tat22-101的PCR产物后，将该3种目的DNA片段分别与pMD18_T载体按摩尔比1 1的比例于16°C连接16h，取200ng加入200 μ 1用常规氯化钙法制备的大肠杆菌 (E. coli)DH5a感受态细胞进行转化。具体转化条件为置冰水浴25min、42°C 90s、冰水浴1-2π η，ΜΛ 800μ1的LB培养基于37°C、150rpm振荡培养Ih后，涂LB平板(含Amp 100μ g/ml和Kana 35 μ g/ml)，置37°C孵箱培养过夜。对转化形成的单克隆进行PCR及酶切鉴定。PCR反应体系为以单克隆扩增后的菌液2μ 1为模板，分别以37-U和37-D、61-U和 61-D以及101-U和101-D为上下游引物各2μ 1(浓度为0. OlmM)(引物序列见表1)，Taq酶1. 5U, dNTP 100 μ mol, Mg2+3mmol，反应体积 50 μ 1。PCR 扩增条件为-MV 5min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 40s，30个循环；72°C IOmin0酶切鉴定的反应体系为克隆的质粒载体 15 μ 1, Hind III 和 BamH I 各 1. 5 μ 1，IOXKbuffer 3 μ 1，无菌双蒸水 9 μ 1，反应总体积 30μ 1，于37°C酶切2h，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。提取经PCR及酶切鉴定结果阳性的单克隆质粒，委托深圳华大基因研究院进行序列测定，测序结果用DNASTAR软件分析，序列正确的重组质粒分别命名为 pMD18-T-Tatl-37、pMD18-T-Tatl-61 和 pMD18_T-Tat22_101。3、重组表达载体的构建分别以pMD18-T-Tatl-37、pMD18-T-Tatl_61 和 pMD18-T-Tat22_101 为模板，以 T 载体通用引物RV-M和M13-47为上下游引物，分别扩增含3种目的基因的DNA片段，用胶回收试剂盒 3S DNA Gel Purification Kit 3. 1 回收 DNA 片段后，用 BamH I 禾Π Hind III 两种限制性内切酶进行双酶切以获得含粘性末端的目的基因。酶切反应体系包括DNA片段 25 μ 1 (6 μ g),BamH I 禾口 Hind III 各 2· 5 μ 1(25U)，10XK Buffer 5 μ 1, lmg/ml BSA 5μ 1， 无菌双蒸水 ο μ 1，反应总体积50 μ 1。将酶切后的目的基因与同样用BamH I和Hind III 双酶切的表达载体pET-3h连接。连接条件目的基因与pET-3h载体以摩尔比1 1比例连接，按总体积20 μ 1的1/10加入高效连接液2 μ 1于16°C连接16h。取连接产物10 μ 1 转化感受态细胞Ε. coli DH5ci。提取单克隆转化菌落质粒进行PCR及酶切鉴定，PCR反应体系包括及扩增条件同前。酶切鉴定的反应体系重组表达质粒15 μ 1，Hind III和Bam HI各1.5μ1，10ΧΚ buffer 3 μ 1，无菌双蒸水9 μ 1，反应总体积30 μ 1，于37°C酶切2h，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对经PCR鉴定(见图2)及酶切鉴定(见图3)结果阳性的单克隆质粒，委托深圳华大基因研究院进行其序列测定。测序结果用DNASTAR软件分析，测序正确的重组质粒分别命名为 pET32a-Tat 1-37、pET32a-Tat 1-61 和 pET32a_Tat22_101。4、Tat突变体融合蛋白的表达和纯化常规氯化钙法制备大肠杆菌BL21-TRXB (DE!3)感受态细菌；分别取上述3种重组质粒 pET3h-Tatl-37、pET3h-Tatl-61 和 pET32a-Tat22_101 各 200ng 加至 200 μ 1 感受态细菌 BL21-TRXB (DE3)中，冰水浴 30min，42°C、90s，再冰水浴 l_2min 后加 800 μ 1 的 LB 培养基于37 0C、150rpm培养Ih后涂LB培养基平板(含100 μ g/ml Amp和35 μ g/ml Kana)，于 37°C培养过夜。次日挑取单克隆转化菌落接种至:3ml LB液体培养基(含100 μ g/ml Amp和 35 μ g/ml Kana)，于37°C、150rpm振荡培养过夜后，取700μ 1过夜菌液，加300 μ 1甘油制备甘油保存菌种于_20°C保存；另按1 10的接种量将过夜培养的菌液转接到新鲜的:3ml LB 培养基中(含 100 μ g/ml Amp 和 35 μ g/ml Kana)，于 37°C、220rpm 振荡培养 3h 至 OD600 为1. 0时，加IM的IPTG 3 μ 1至终浓度ImM，诱导培养4h，于IOOOOrpm离心3min，弃上清， 沉淀加300μ1 0. OlM磷酸盐缓冲液(PBQ重悬后，取20μ1 PBS重悬液加入2 X SDS点样液 20 μ 1混勻，制成SDS样品，同时收集未经IPTG诱导的空菌BL21-TRXB(DE3)培养液按同法制成SDS样品后，进行SDS-PAGE电泳检测制备12% SDS聚丙烯酰胺凝胶，将上述SDS样品及蛋白标准品沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝进入分离胶后提高至12V/cm， 直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果可见分别含3种重组质粒pET3h-Tatl-37、pET32a-Tatl-61 和pET3h-Tat22-101的克隆在相对分子质量约22KDa、M. 9KDa和26. 9KDa处均有目的融合蛋白条带，空菌BL21-TRXB (DE3)未见该条带(见图4)。经Glyko BandScan5. 0软件分析，3种目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白比例分别为54. 8%、36. 7%和42. 1 %。随后对阳性细菌克隆进行大量诱导表达及纯化分别将含pET3h-Tatl-31/BL21、pET32a-Tatl-61/ BL21和pET3^i-Tat22-101/BL21甘油菌种按照1 10接种量接种至50ml LB培养基中 (含100yg/ml Amp和35 μ g/ml Kana)，于37°C、170rpm振荡培养过夜后，转接至新鲜的 450ml LB 中(含 100 μ g/ml Amp 和 35 μ g/mlKana)，于 37°C、220rpm 振荡培养 3. 5h 至 OD600 为1.0，之后加IM IPTG 50(^1至终浓度为11111，再于371、220印111振荡培养411后收集菌液，于4°C、5000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀加入30ml 8M尿素(pH 8.0)裂解，于4°C过夜。次日，裂解产物于4°C、10000rpm离心30min，取上清至另一离心管中，取其中20 μ 1上清液加2X SDS点样液20 μ 1混勻制成SDS样品后，经12% SDS-PAGE电泳检测分析；其余尿素裂解液于11000rpm、4°C离心20分钟，取上清过金属螯合亲和层析介质柱(Ni_NTA，购自德国QIAGEN公司)，Ni-NTA柱以8M尿素(pH 8.0)平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素 (pH 7. 0)洗柱，以8M尿素(pH 4. 5)洗脱，收集洗脱峰，用0. IM Tris中和，以PBS透析，经 12% SDS-PAGE分析纯化效果，结果显示在相对分子量约22KDa、M. 9KDa和26. 9KDa处可见清晰目的融合蛋白条带，经Glyko BandScan5. O软件分析显示3种重组蛋白纯化后纯度分别为 94. 4%，86. 6%，86. 6% (见图 5A)。5、Tat突变体融合蛋白的Western blot检测取出SDS-PAGE电泳凝胶作适当修剪，浸泡于转移缓冲液中准备转膜；剪12张与凝胶大小一致的滤纸与1张硝酸纤维素膜，带手套操作，将滤纸与硝酸纤维素膜用转膜缓冲液浸泡15分钟后，将6张滤纸整齐叠放，凝胶置于其上(靠近负极)，将硝酸纤维素膜(靠近正极)置于凝胶上，再叠放6张滤纸，在300mA条件下进行蛋白稳流转膜50min ；转膜结束后加适量封闭液(含0. 01mol/L PBS、10%脱脂奶粉、0. 1 % Tween-20,0. 2%柳硫汞)于4°C 封闭过夜；用PBST洗液洗涤5次，加入小鼠抗Tat单克隆抗体(1 1000稀释)(第二军医大学微生物学教研室制备)，37°C孵育池，漂洗液洗5次，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG-HRPd 1000稀释)，37°C孵育45min，漂洗液洗涤5次，加入底物二氨基联苯胺(Diaminobenzidin^DAB)显色5_10分钟，出现棕色条带后立即用蒸馏水冲洗，终止显色反应。结果可见3种Tat突变体融合蛋白(Tatl-37-PET、Tatl-61-PET和Tat22_101_PET) 和全长Tat融合蛋白Tatl-IOl-PET均与小鼠抗Tat单克隆抗体呈阳性反应，而pET3h载体蛋白则无此反应(见图5B)。6、动物免疫实验初次免疫取纯化后Tatl-37-PET、Tat 1-61-PET和Tat22_101_PET融合蛋白各 300 μ 1 (蛋白含量0. 2mg)分别与弗氏完全佐剂等体积混合后，于四肢和背部注射免疫健康雌性新西兰家兔(购自第二军医大学实验动物中心)，每组3只实验兔；2周后第2次免疫用弗氏不完全佐剂与0. Img蛋白样品等体积混合，注射家兔四肢和背部。每隔2周加强免疫1次，共加强免疫2次，方法及剂量均同第2次。用免疫前兔血清作为阴性对照。最后一次免疫两周后经颈总动脉大量取血，约60ml/只，IOOOOrpm离心lOmin，取上层血清按:3ml/ 只分装，于_40°C冻存备用。7、免疫兔血清的ELISA检测将纯化的HIV-I全长Tat融合蛋白(!"at 1-101-PEP)及2种I^at C末端融合蛋白 (Tat49-101-PEP 和 Tat60-101-PEP)分别用 50mM 碳酸盐缓冲液(pH 9. 6)按 1 200 稀释包被96孔酶联反应板，每种抗原包被3排复孔，0. 5 μ g/孔，37°C孵育池，弃包被液，加180 μ 1 10%脱脂奶粉于37°C封闭池，用PBST洗液洗涤4次后，分别加入1 2倍比稀释的兔抗全长Tat血清(抗htl-lOl-PET)及3种抗Tat突变体蛋白兔抗血清(抗I~atl-37-PET、抗 Tatl-61-PET 和抗 Tat22-101-PET)各 100 μ 1，最后 1 孔不加，37°C孵育 45min，用 PBST 洗涤 5次，加入HRP标记的羊抗兔IgG(l 1000稀释)，100μ 1/孔，37°C孵育45min，PBST洗涤 5 次，经 3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(3，3' ,5,5' -tetramethylbenzidine，TMB)显色， 加2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪(Bio Rad)于450nm波长处测定吸光度值(A45tl)。用免疫前兔血清作为阴性对照，以高于阴性对照~5(|值3倍的数值作为阳性判断标准。结果可见该3种抗Tat突变体蛋白兔抗血清(抗Tatl-37-PET、抗Tatl-61-PET和抗Tat22-101_PET) 均与HIV-I全长Tat蛋白呈特异性反应(见图6)，其中抗Tat22-101-PET血清与上述两种 Tat C端抗原的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强(见图7)。
权利要求
1.人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQID N0:2、4或6所示。
2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备HIV免疫原中的应用。
3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备预防和治疗性 HIV疫苗中的应用。
4.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体在制备HIV检测试剂盒中的应用。
5.编码如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1、3 或 5 所示。
6.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV免疫原中的应用。
7.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。
8.根据权利要求5所述的编码人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体的核苷酸序列在制备HIV检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域。HIV-1型转录反式激活因子(trans-activator of transcription，Tat)是HIV-1感染早期产生的重要调控蛋白。本发明的目的在于筛选到分子构象相对稳定且能引起较强免疫反应的HIV-1型Tat蛋白突变体序列。本发明提供的HIV-1Tat蛋白突变体其氨基酸序列如SEQID NO2、4或6所示。本发明的三种Tat突变体蛋白的兔抗血清均与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，且反应性更强，因此可用于制备抗HIV感染多肽药物的组成成分或作为制备HIV Tat疫苗的候选抗原。
文档编号C12R1/93GK102206255SQ20111007418
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者何婷, 刘超, 廖文婷, 张华群, 曹洁, 杨界, 潘卫, 王锦红, 祁培培, 章萍萍, 葛宜兵, 陈秋莉 申请人:中国人民解放军第二军医大学