具有产量增加潜能的植物生长相关enox蛋白、序列和方法
【专利说明】具有产量増加潜能的植物生长相关ENOX蛋白、序列和方法 发明领域
[0001]在某些方面，本发明设及基因工程、分子生物学、植物生物学、细菌学和农业领域。 [醒]发明背景 由于许多因素如天气、昆虫或其它动物侵袭，农民可能遭受低作物产量或作物歉收。当 此发生时，其可对农民具有经济影响。有时，由于运样的事件农民可能希望重新种植一种作 物来减轻其损失。在其它时候，农民可能只是希望通过种植第二种作物来增加其生产力。
[0003] 在单个季节内种植一种或多种作物的运种实践被称为"双作"或"复种"。复种允许 农民在给定的季节使用相同数量的±地同时增加其生产力。
[0004] 然而，取决于计时，在季节内可能没有足够的剩余时间使第二种作物成熟。因此， 成功的复种季节需要小屯、管理作物的种植日期和收获日期。
[0005] 种植的第二种作物可与种植的第一种作物相同，或其可为不同的。例如，可在第一 批大豆或第一批小麦之后种植第二批大豆。
[0006] 根据该背景，存在对具有增加的产量和/或减少的成熟时间的改善的和/或备选的 农产品的需求。本发明的各方面致力于运些需求。
[0007] 发明概述 在某些实施方案中，本发明描述了来自琴叶拟南芥(Arabidopsis Iyrata)的植物候选 组成型ENOX (CNOX或ENOXl)蛋白的克隆、表达和表征。编码该335 (165)个氨基酸的蛋白的 基因参见登录号XP-002882467。先前通过定点诱变鉴定并且存在于植物的候选ENOXl蛋白 中的ENOX蛋白的特征性功能基序包括腺嚷岭核巧酸和铜结合基序连同必需的半脫氨酸。然 而，人EN0X2的药物结合基序化EMTE)序列缺失。在大肠杆菌中表达的重组蛋白的活性不受 辣椒素、EGCg和其它EN0X2-抑制物质影响。用NAD(P化和还原型辅酶Q二者作为底物均显示 周期性氧化活性。结合的铜对于活性必不可少并且活性受到ENOXl-特异性抑制剂苦木内醋 D抑制。稱黑激素的加入使24 min周期相位同步(phase)W致下一个完整的周期在稱黑激素 加入后24 min开始，如同是一般性ENOXl活性所特有的。周期性蛋白二硫键-琉基互换活性 (disulfide-thiol interchange activity)连同24 min ENOXl蛋白周期特有的2氧化加3 互换活性模式也得到证明。纯化的植物ENOXl蛋白的浓缩溶液形成不可溶的聚集体，缺乏酶 活性，与淀粉样蛋白相似。聚集的制备物通过等电聚焦恢复活性。上述特征与哺乳动物 ENOXl的那些类似，使来自拟南芥属(Arabidopsis)的ENOXl成为植物中过表达的理想候选， 作为增加生物量和产量的手段。
[000引在某些方面，本发明设及在杂种生物体，例如，但不限于细菌、植物和植物种子中 克隆、转染和表达ENOX蛋白。
[0009]另外，本发明的实施方案描述了通过向植物施用ENOXl的小分子量激活剂增加植 物产量的方法。指定为TR-III，优选半脫氨酸的激活剂作为叶面喷洒W约0.005-1.0磅/英 亩Qb/A)的量施用。优选地，施用0.01化/A的半脫氨酸。此外，本发明提供增强植物生长的 方法，所述方法包括作为种子处理向植物种子施用半脫氨酸。半脫氨酸W约0.001-1 mg/g 合适载体(mg/g)例如滑石的量施用到种子。优选地，半脫氨酸在0.002-0.02 mg/g滑石的范 围之间施用。本发明还提供增强植物根生长和茎直径(增加的站立能力）的方法，其包括向 植物施用半脫氨酸。半脫氨酸W约0.005-1.0化/A的量施用。优选地，给植物施用O. Ol化/ A的半脫氨酸。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明公开了植物候选组成型ENOX蛋白的克隆、表达和表 征，在某些实施方案中所述蛋白被天然（IAA)和合成的（2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D)生长素 植物生长调节因子W约1 iiM的最适条件激活，并且更高的浓度不太有效。先前通过定点诱 变鉴定并且在候选的生长素-激活的ENOX (dNOX)中存在的植物ENOXl蛋白的特征性功能基 序，除了先前鉴定的生长素结合基序外还包括腺嚷岭核巧酸和铜结合基序连同必需的半脫 氨酸。通过氧化的[NAD(P)H和还原型辅酶Q作为底物]均显示周期性氧化活性，W及对于蛋 白二硫键互换，产生其它生长-相关ENOX蛋白的24 min周期性特征性的2氧化加3互换活性 模式。结合的铜对于活性必不可少并且活性受至化NOXl-特异性抑制剂苦木内醋D抑制。制备 物在生长素不存在时缺乏活性。无活性的生长素2,3-D无效，如EN0X2抑制剂一样。纯化的植 物ENOXl蛋白的浓缩溶液形成不可溶的聚集体，缺乏酶活性，与淀粉样蛋白相似。聚集的制 备物通过等电聚焦恢复活性。上述与哺乳动物ENOXl的那些类似的特征使植物dNOX成为在 植物中过表达的第二候选，作为增加生物量和产量的手段。
[0011] 在此随附的权利要求书中提供了另外的概述，其各自被认为是本发明的一个实施 方案的概述。
[0012] 本发明前述和又进一步的方面将从下列详述和附图变得更显而易见。
[001引 附图简述 图1.细胞生长与ENOXl活性相关。
[0014] 图2.人ENOXl过表达增加细胞大小。
[0015] 图3. NCBI参考序列：XI^_002882467.1 (沈Q ID NO 5)。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YML117W (沈Q ID NO: 6)与拟南芥属ENOXl (SEQ ID NO: 7)的比对。重组拟 南芥属ENOXl氨基酸84-126与YML117W氨基酸932-968之间存在37% (16/43)的同一性和58% (25/43)的相似性。
[0016] 图4.在银染色的15% SDS-PAGE上显示的14 kD重组拟南芥属ENOXl的表达。泳道1 和2:祀TlIa-AraENOXl转化的大肠杆菌的全细胞(2 );泳道3:弗式压碎器压碎的祀TlIa- Ar址NOXl转化的大肠杆菌的沉淀(2 yl)。表达的重组拟南芥属ENOXl (箭头)存在于弗式压 碎器压碎的大肠杆菌的沉淀中。
[0017] 图5.对于IEF纯化的拟南芥属ENOXl的级分显示12 min期间对作为NADH消耗的量 度的A34日减少的连续跟踪。测定条件如(Jiang, Z., Gorenstein, N. M., Morr自，D. M.和 Morr自，D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)所描述的，不同之处在于NADH浓度为 0.75 ml和使用S阳CTRA max 340PC微板阅读器自动收集和存储数据。混合物在200山的总 体积中包含大约20 yg ENOXl。
[0018] 图6. IEF-纯化的重组拟南芥属ENOXl的NADH氧化酶活性。图示了5个极大值的振 荡模式。相隔6 min的主要极大值由标记为1和2的极大值指示。之后的=个次要的极大值与 主要的极大值分离并且彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4) = 24]。
[0019] 图7. IEF-纯化的重组拟南芥属ENOXl的NADH氧化酶活性和对1 yM稱黑激素的反 应。加入稱黑激素后，新的极大值在稱黑激素加入(箭头)之后24 min出现，其为ENOXl的一 个特征。
[0020] 图8.从二硫代二化晚(DTDP)底物的裂解测量的IEF-纯化的重组拟南芥属ENOXl 的蛋白二硫键-琉基互换活性。观察到振荡的活性，活性与相隔4.5 min的=个极大值而非 相隔6 min的两个极大值最密切相关。
[002。 图9.通过A"q(A)的增加或A29Q (B)的减少测量的重组拟南芥属ENOXl氧化氨酿 (还原型辅酶Q)的能力。如图6的NADH氧化一样，活性振荡，具有相隔6 min的突出的极大值 (箭头），W建立包含相隔4.5 min的3个额外的极大值(总计5个极大值)的24 min周期。
[0022] 图10.通过等电聚焦，纯化和活化重组拟南芥属ENOXl。
[0023] 图11.特异性ENOXl苦木苦味素抑制剂苦木内醋D对重组拟南芥属ENOXl的抑制。
[0024] 图12.用TFA +浴铜灵减小的重组拟南芥属ENOXl的NADH氧化酶活性。A.在TFA 的存在下，24 min的周期未受影响。B.当用TFA和浴铜灵测定时，24 min的周期大大减少。 C.通过透析去除浴铜灵和重新加入铜恢复全部的活性。
[0025] 图13.当在〇2〇中测定时拟南芥属ENOXl的NADH氧化酶活性显示24 min至30 min 的周期长度增加。重水增加周期长度的作用为生物钟的标志之一。
[00%] 图14.半脫氨酸对NADH氧化的刺激对在细菌中表达的重组ENOXl蛋白的ENOXl活 性周期的极大值③特异。
[0027] 图15.使大豆种子于黑暗中在赔石中发芽并收集恰在钩部分化OOk)下方的2 cm 下胚轴切片。将运些均质化，制备质膜，并测定ENOXl活性。
[0028] 图16.如图15中，除了在溫室中生长1个月后的大豆植物的叶组织(第一和第二个 S叶)外。
[0029] 图17.使大豆植物种子于黑暗中在赔石中发芽，7天后，从根上方切除幼苗并放置 在光照中的小瓶所包含的水中。
[0030] 图18.如图17中，不同之处在于使未处理的种子发芽和将切除的芽转移至在水中 制备的不同浓度的TR-III溶液中。
[0031] 图19.植物在溫室中自处理的种子生长。
[0032] 图20.如图19中，不同之处在于植物来自未处理的种子和用不同比率的TR-III喷 雾。该实验仍在进行中但在0.01化/A TR-III时观察到上胚轴增大，与过去一样，0.001或 0.1化/A作用很小或无作用。
[0033] 图21.田间实验中每棵大豆植物的豆芙，该实验比较了无 TR-III (实屯、符号)与7 月3日作为叶面喷洒施用的0.01化/A TR-III (开符号，虚线）。
[0034] 图22.比较无 TR-III、TR-III 1:50和TR-III 1:500,从用滑石处理的种子生长的 植物的大豆茎的次生木质部的增加。
[00对图23.来自图21的田间实验的大豆的站立能力。无 TR-III植物(左)严重倒伏。TR-III处理的植物(右)不倒伏。
[0036] 图24.重组生长素-活化的ENOX蛋白（ABP-20)的序列（SEQ ID NO: 8)。
[0037] 图25.在银染色的15% SDS-PAGE上显示的20 kD重组ABP-20的表达。泳道1:携带 载体祀T-Ub的全细胞;泳道2:祀Tl A-ABP-20转化的大肠杆菌的全细胞(2 y 1);泳道3:弗 式压碎器压碎的祀Tl A-ABP-20转化的大肠杆菌的上清液(2 yl);泳道4:弗式压碎器压碎 的祀TUb-ABP-20转化的大肠杆菌的沉淀(2 yl)。表达的重组ABP-20存在于弗式压碎器压 碎的大肠杆菌的沉淀中（箭头）。
[003引图26. IEF纯化的重组ABP-20的NADH氧化酶活性。在60 min时加入2,4-二氯苯氧 乙酸（2,4-D) (1 yM)W活化该酶。图示了5个极大值的振荡模式。相隔6 min的主要极大值 由单箭头指示。之后的=个次要极大值与主要极大值分离并彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4)] = 24]。
[0039] 图27.如图26,不同之处在于通过60 m