in后加入的10础吗I噪-3-乙酸（箭头）活 化。
[0040] 图28.从二硫代二化晚(DTDP)底物的裂解测量的IEF-纯化的重组ABP-20的蛋白 二硫键-琉基互换活性。60 min时加入2,4-D (1 yM)W活化该酶。观察到振荡的活性，活性 与相隔4.5 min的立个极大值③、④和⑤而非相隔6 min的两个极大值①和②最密切相关。 [00川图29.通过A"q(A)的增加或A29Q (B)的减少测量的重组ABP-20氧化氨酿(还原型 辅酶Q =泛醇）的能力。如图6的NADH氧化一样，活性振荡，具有相隔6 min的突出的极大值 (箭头），建立包含相隔4.5 min的3个额外的极大值(总计5个极大值)的24 min周期。60 min 时加入2,4-D (1 yM)W活化该酶。
[0042] 图30.用TFA +浴铜灵减小的重组ABP-20的NADH氧化酶活性。A.在TFA的存在 下，24 min的周期未受影响。B.当用TFA和浴铜灵测定时，24 min的周期大大减少。C.通过 透析去除浴铜灵和重新加入铜恢复全部的活性。从开始时加入2,4-D (1 yM)W活化该酶。 [00创发明详述 为了促进理解本发明原理的目的，现在将参考某些实施方案并且将使用特定的语言对 其进行描述。然而要理解，不因而意在限制本发明的范围，考虑如本发明所设及领域的技术 人员通常会想到的本文所描述的发明原理的运样的变更和进一步的修饰，W及运样的进一 步的应用。
[0044] 冠词和短语例如，"所述"，"一个"、"一种"、"至少一个"和"第一"、"包括"、"具有" 和"包含"在此处不限于仅指一个，而是囊括的和开放式的，还任选包括两个或多个所述要 素和/或其它要素。关于本文的词语或术语或短语的含义，其中的字面差异并非多余的并且 具有不同的含义，并且不与同一权利要求或其它权利要求中的词语或术语或短语同义。
[0045] 本专利基于植物、动物和酵母菌的生长-相关细胞表面NADH氧化酶化CTO-NOX = ENOX)蛋白家族的潜在效用。ENOX化CTO-NOX =外-烟酷胺二核巧酸氧化酶二硫键琉基互 换）蛋白显示交替的氯化物-不敏感的、计时的还原型辅酶Q (CoQ出）（NAD(P)H)氧化酶 (NOX)活性和蛋白二硫键-琉基互换活性(Morr自，D. J. 1998.In: Asard, H., Bgrczi, H. and Canbergs, R.，eds.，质膜氧化还原系统及其在生物应激和疾病中的作用 (Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease), Kluwer, Dordrecht, pp. 121-156;Mo;r;r自，D. J.和Morr自，D. M.2003. Free Radical Res. 37: 795-808) dENOX蛋白执行质膜电子转运和蛋白二硫键-琉基互换活性， 后者驱动细胞增大。我们已经从拟南芥属、酵母菌(酿酒酵母)和人鉴定和克隆了组成型的 ENOX (ENOXl)蛋白W及同样为人源的癌症-特异性EN0X2形式。我们有证据表明一种或多种 运些ENOX家族成员在农作物中适当过表达将导致显著增加的产量。ECTO命名源自其在质膜 外表面上的外部定位并将其与所有其它细胞NADH氧化酶区别开来。该外部定位W及氧化和 蛋白二硫键互换活性的交替已经在大范围的动物和植物组织及细胞系中得到证明（D. J. Morr和D. M. Morr自，2012，ECTO-NOX蛋白巧CTO-NOX Proteins), Springer,化W York, 507 pp)。在ENOX蛋白中，组成型CNOX或ENOXl由于对于在生产农业中过表达具有最大的效 用而显现出来。
[0046] 我们在ENOXl蛋白中的兴趣基于近30年发表的表明ENOXl在植物和动物细胞二者 中驱动细胞增大的重要和必要作用的基础研究化.J. Mor巧和D. M. Morr自，2012, ENOX 蛋白巧NOX Proteins), Springer, New York, 507卵）。大约100位同行评审了已经发表 的追溯到20世纪60年代早期的与理解细胞生长增大期有关的期刊文章，ENOX蛋白从20世纪 70年代中期-20世纪80年代中期开始设及。
[0047] 实验室结论主要基于=条证据线索： 1.细胞增大与ENOXl活性之间的强烈相关(图1)。
[0048] 2. ENOXl和细胞增大二者的相对特异的抑制剂对细胞增大(和生长)的抑制(Morr 有，D. J.和Greico, P. A. 1999.Int. J. Plant Sci. 160:291-297)。
[0049] 3.克隆的ENOXl在哺乳动物细胞系化EK)中的过表达导致细胞增大的速率增加和 细胞体积增加(Bosneaga, E.和!"ang, X. U吨ublished)。
[0050] 对细胞生长的伸长(细胞扩大）期必不可少的生长-相关细胞表面ENOX-I蛋白首先 在人ENOXl基因中克隆（Jiang, Z.，Gorenstein, N. M.，Morr自，D. M.和Morr自，D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)，该基因在Williams 82大豆中过表达。结果为更短 的节间，总体约2.5个结芙节/植物的增加，约3英寸的植物高度增加，木质部和茎直径的增 加和主要由额外的结芙节引起的15%的产量增加。同时，作为用于在植物中过表达的更可能 的候选，如同来自拟南芥属的ENOXl，克隆了来自酵母菌酿酒酵母的EN0X1。还克隆了植物独 特的第二种ENOXl样蛋白（dNOX)，其活性依赖于天然或合成的生长素的存在。
[0051] 另外，我们发现了一种专有的小分子ENOXl活化剂，其作为种子处理有效并且已经 在很少费用或无额外费用时产生大幅增加的产量，特别是对于双作大豆。种子处理的一个 优点在于其加速晚夏缩短的光周期的植物发育W在可用W生产作物的时间内使豆芙产量 达到最大。
[0052] 哺乳动物ENOXl的过表达 来自人基因组的组成型ENOXl蛋白的基因由Jiang等人(2008)克隆，命名为ENOXl (W 前为CNOX)，类似于增殖-诱导基因38蛋白。所述蛋白在大肠杆菌中克隆和表达（该蛋白的 NCBI登录号为AB028524)。
[0053] 当用NusA标签在细菌中表达时，cENOXl具有来自其它哺乳动物或植物源的ENOXl 蛋白的活性特征。在人类基因组中，该基因位于染色体13上（13q 14.11)并且编码643个氨 基酸的开放阅读框。编码cENOXl的基因存在于所有目前测序的脊椎动物和昆虫物种的基因 组中并且该蛋白高度保守。在具有XY性别决定系统的哺乳动物中，该基因具有X染色体的常 染色体定位。尽管具有常见的功能基序，但哺乳动物ENOXl与植物、酵母菌或原核生物中的 ENOXl之间未发现相似性，但植物和酵母菌ENOXl副本与人基因不具有序列相似性。
[0054] 为了将概念变为实践，通过Iowa State University, Ames, Iowa的基因转染服 务(Gene Transfection Service)将哺乳动物ENOXl基因引入大豆中。在2011和2012两年在 两个地点Indiana和111 ino i S，释放调节物质用于田间试验。使用旗子和标粧W允许的区域 作为边界确定释放位点。生长季节结束时，除了收获的种子W外将所有的调节物质留在调 节位点并通过耕作破坏。
[0化5] 基因型： 目的基因： 启动子:来自花挪菜花叶病毒的35S -增强的35S 增强子:来自烟草蚀纹多病毒(polyvirus)的TEV-来自35S启动子的额外上游序列 基因：来自智人的CNOX -使用密码子使用表设计的基因 终止子:来自根癌农杆菌的NOX -来自T-DNA的NOX 3' 选择标记： 启动子:来自花挪菜花叶病毒的35S -增强的35S 增强子:来自烟草蚀纹多病毒的TEV-来自35S启动子的额外上游序列 基因：来自吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)的除草剂抗性-选择标记 终止子:来自根癌农杆菌的NOX -来自T-DNA的NOX 3' 在Williams 82中表达的CNOX巧NOXl)合成基因构建体的2011田间试验的性能评估 2011年大约一半的可用于评估的调节物质分布在两个释放位点之间，AtIanta， Indiana位点约S分之二，Downs, Illinois位点约S分之一。
[0056] 手工收集和收获所有的转基因植物并与Iowa Sl:ate University Williams 82变 种加可比数量的来自Indiana和Missouri种子库的WiIIiams 82植物比较(表1)。评估的表 型参数在表2和3中列出。对从获自所有四个来源的种子生长的Williams 82植物进行比较 (表1)。从AtIanta, Indiana释放位点收获在四个来源中平分并在与转基因植物完全相同 的条件下生长的五十五(55)棵Williams 82,野生型非转基因植物，并从Downs, Illinois 位点收获二十四（24)棵Wi 11 iams 82植物。在Wi 11 iams 82植物的四个来源之间未注意到差 异。综合数据作为不同Williams 82来源之间的均值±标准差呈现。
[0化7] 从Atlanta, Indiana位点收获和分析了来自18个不同事件的一百 h五（115)棵 转基因植物，从Downs, Illinois位点收获了来自5个事件的十一（11)棵植物。并非所有的 事件都产生植物。收获所有达到成熟的转基因植物并包含在最终的数据汇总中。表2和3中 给出的发现为产生植物的所有事件的平均值±事件之间的标准差。
[0化引比较野生型Williams 82与转基因，植物高度在很大程度上不受影响（表2)。来自 Atlanta位置的结果(表2A)显示11%的结芙节增加、20%的满豆芙/结芙节增加和小而轻微显 著的每颗豆子重量的增加。运=个参数(结芙节的增加、满豆芙/节的增加和每颗豆子重量 的增加)提供了 33%的组合增加，与每棵植物豆子总重量32%的增加有利地比较。
[0059] 用从Downs, Illinois位点收集的物质观察到相似的结果(表2B)。
[0060] 比较转基因植物与Williams 82植物的其他参数(表3)在很大程度上未改变。分枝 程度、豆子/豆芙、空豆芙/植物(作为总豆芙的百分数;空豆芙从满豆芙计数中排除）与来自 Atlan1:a，Indiana释放位点（表3A)或来自Downs, 111inois释放位点（表3B)的植物均无不 同。仅对于从植物顶端起第九个节间处，约从顶端至基部的中间位置测量的茎直径，注意到 差异。转基因植物的茎比来自相同位置的Williams 82植物平均厚15% (茎直径增加15%，来 自Atlan化位点的转基因植物)和厚7% (来自Downs，111 inois位点的转基因植物）。
[0061 ] 在Atlanta释放位点的四个WiIliams 82种植区（planting)和Atlanta释放位点的 转基因种植区中的=个包含23或更多（31 ± 8)棵相邻植物。来自运些植物的评估显示58 bu/A (Williams 82)和83 bu/A (转基因）的计算产量，总体增加43% (表2A)。
[0062] 绝对计算产量基于相隔5.5英寸的平均株距（相隔4英寸73%发芽）和30英寸的行 距。比较中包含的Williams 82地块和转基因事件小块±地具有几乎完全相同的株距并且 同样在30英