涉及具有强烈降低的受体结合亲和力的细胞因子的融合因子的制作方法
【专利说明】溃及具有强烈降低的受体结合亲和力的细胞因子的融合因子
[0001] 本发明设及一种包含至少两个细胞因子的融合蛋白，其中至少一个是对它的受体 或对它的一种受体具有强烈降低的结合亲和力的修饰的细胞因子。优选地，两个细胞因子 由接头，优选是GGS接头连接。本发明还设及用于治疗疾病的所述融合蛋白。
[0002] 细胞因子是分泌或膜结合的小蛋白质，其在细胞间通讯中起至关重要作用。细胞 因子结合于它的同源受体复合物会触发细胞内信号传导事件的级联，所述级联使得细胞能 够根据细胞、细胞作为其一部分的组织和器官的需要感应它的周围环境并对它的周围环境 起应答。它们在特征上是多效性的，运意味着视祀细胞的性质和发育状态而定，它们激起广 泛范围的应答。此外，它们中的一些是高度冗余的，因为若干细胞因子具有重叠活性，此使 得它们能够在功能上弥补相互损失。细胞因子活性可为自分泌性、旁分泌性或内分泌性的， 从而导致在指定术语细胞因子、肤激素和生长因子之间的模糊界限。
[0003] 已知六种不同结构类别的细胞因子:a螺旋束细胞因子，其包括大多数白介素、集 落刺激因子和激素样生长激素和瘦素(Nicola和化Iton, 1998) 聚肿瘤坏死因子(TNF)家 族(I化iss和Naismith,2000);半脫氨酸结生长因子(Sun和Davies, 1995);包括白介素-1家 族的PS叶形折叠(0-trefoil fold)组(Murzin等，1992);白介素17(比-17)家族(Gaffen, 2011)和趋化因子(Nomiyama等，2013)。
[0004] 若干细胞因子已得到重要临床应用。实例包括红血球生成素化PO)、粒细胞集落刺 激因子(G-CSF)、干扰素 a2和-PW及生长激素。相反，常常由于它们的促炎症性质，使所选细 胞因子括抗也得到特定医学应用。此处的主要实例是用W阻断TWa活性W抗击如类风湿 性关节炎的自体免疫疾病的策略。由于运些成功，正在探究用W优化细胞因子在临床中的 活性的策略。运些策略包括优化半衰期，降低免疫原性，向特定细胞类型进行祀向递送W及 遗传融合两个细胞因子，即所谓融合因子(fusokine)。
[0005] 融合因子是使用接头序列遗传连接的两个不同细胞因子的人工组合。融合因子的 首个实例是作为粒细胞-巨隧细胞集落刺激因子(GMCSF)和IL-3的融合蛋白的PIXY321或 pixykine(Donahue等，1988)，其相较于任一单独细胞因子显示优越的造血和免疫作用。运 个作用可通过与它们的相应受体复合物的结合增强来解释。值得注意的是，两种受体共有 信号传导性ec亚单位，从而排除在信号转导水平上的协同作用。在III期临床试验中， PIXY321在相较于单独GM-CSF时未显示优越性质（O'Shau曲nessy等，1996)。也探究了与IL-2家族的细胞因子的基于GM-CSF的融合因子。运些细胞因子都通过包含T C亚单位的受体复 合物进行信号传导。与GM-CSF的此类融合因子的实例包括化-2(Stagg等，2004)、化-15 (Rafei 等，2007)和比-21 (Williams 等，2010a)，也称为GIFT2、GIFT15 和GIFT21。在信号传导 水平（即祀细胞内的协同作用）与细胞水平（即不同祀细胞类型之间的协同作用）两者上均 可预期协同作用。举例来说，GIFT2相较于未融合细胞因子的组合诱导更强力NK细胞活化 (Penafuerte等，2009)，而GIFT15诱导未曾预期的强力免疫抑制性B细胞群体（Rafei等， 2009a)。同样地，GIFT21对单核细胞发挥出乎意料的促炎性作用(Williams等，201化）。组合 a螺旋细胞因子的融合因子的另一实例是比-2^kl2(Gillies等，2002;化hn等，2012)。
[0006] 另一类别的融合因子组合来自不同结构家族的细胞因子。实例包括IL-18(IL-1细 胞因子家族的成员）和IL-2的融合物(Acres等，2005) W及IL-18与EGF(表皮生长因子)之间 的融合物。因为常观察到EGFR在某些肿瘤细胞类型上过度表达，所W后述融合因子提供使 比-18活性祀向EGFR+肿瘤细胞的可能性化U等，2008)。也更详细地探究了a螺旋束细胞因子 与趋化因子之间的融合物。趋化因子常使用浓度梯度起操纵免疫细胞向感染和炎症部位 迁移的作用。许多趋化因子受体显示限制性表达模式，从而允许祀向所选(免疫)细胞。此 夕h通过蛇根碱(serpentine)进行信号传导，G蛋白偶联趋化因子受体在根本上不同于由a 螺旋束细胞因子受体复合物活化的路径，并且可预期正协同和负协同交互作用机理。值得 注意的是，趋化因子的设计N末端截短形式可保留它们的受体结合性质，但显示括抗性行 为。一实例是GM-CSF与缺乏前5个N末端氨基酸的N末端截短的CCL2之间的融合因子，也称为 GMMEl (Rafei等，2009b)。运个融合因子诱导炎症性CCR化细胞的调亡，并且用GMMEl处理的 小鼠显示实验诱发的自体免疫疾病评分(包括分别针对多发性硬化症(Rafei等，2009b)和 类风湿性关节炎(Rafei等，2009c)的EAE和CIA)降低。同样地，运个融合因子诱导CCR化肿瘤 细胞的调亡(Rafei等，2011)。
[0007]然而，W前未探究野生型细胞因子与对它的同源受体复合物具有强烈降低的亲和 力的突变细胞因子之间的融合物。运个方法的优势是野生型细胞因子的可能全身性毒性被 消除。惊人地，我们发现此类融合因子允许细胞因子活性达成细胞特异性祀向，借此此类突 变细胞因子可重新获得它对祀向细胞的活性，而不具有野生型细胞因子的负面作用。如W 下所例示，已使用=种各自由来自在结构上不同的细胞因子类别的两个细胞因子组成的融 合因子证明该原理的一般适用性。
[000引 X化l/IFNa2突变体
[0009] X化1是一种由CD8+T细胞、Thl细胞极化CD4+T细胞和NK细胞分泌的93个氨基酸的趋 化因子。它与仅由树突细胞表达的趋化因子受体XCRl相互作用。在小鼠中，XCRl在大多数脾 CDllc+CD8a+树突细胞中表达，而仅有极少的子组CDScT树突细胞表达运个受体(Dorner等 2009) dXCRI是与小鼠 CDSa+树突细胞同源的哺乳动物细胞(包括人细胞)的保守选择性标志 物(Crozat等2010)。引起关注的是，已显示I型干扰素（IFNa/e)对运个树突细胞子组的作用 对小鼠中先天性免疫识别生长的肿瘤至关重要(化ertes等2011)。
[0010] 全身性IFNa疗法具有相当大的毒性，包括如重度疲劳、发热、寒冷、抑郁、甲状腺功 能障碍、视网膜疾病、脱发、皮肤干燥、皮疹、发痒和骨髓抑制的副作用。因此，将高度值得的 是使IFN活性仅祀向应该用IFN处理的细胞群体。对于在抗肿瘤疗法中应用，祀向表达XCRl 的树突细胞的群体是高度合乎需要的，因为运些细胞专口致力于抗原交叉递呈(Bachem等 2012)。许多实验数据表明表达XCRl的树突细胞群体代表在肿瘤微环境中必须与I型IFN反 应W引发最终将允许达成肿瘤破坏和免疫的免疫应答的关键细胞群体(Gajewski等2012)。
[0011] 人IF化2-Q124R突变体对鼠类IFNARl链具有高亲和力，而对鼠类IFNAR2链具有低 亲和力(Weber等，1987)。它显示对鼠类细胞的活性极低，并且因此代表适于使IF脚舌性祀向 所选小鼠细胞的工程改造的I型IFN亚型的原型(PCT/EP2013/050787)。
[0012] (XL2O/IL10
[0013] CC趋化因子(XL20,也称为肝和活化调控的趋化因子（LARC)、巨隧细胞炎症性蛋 白-3a(MIP-3a)或Exodus-I,是一种主要在肝和淋己组织中表达的96个氨基酸的蛋白质 化iesMma等，1997)。在分泌后，(XL20通过结合属于G蛋白偶联受体(GPCR)I家族的CC趋化 因子受体6(CCR6)来发挥它的活性(Baba等，1997)。报道了关于不同白细胞子组的CCR6表 达，但化17细胞群体的CCR6表达被文献最充分证明（Sin曲等，2008)。正常化17功能为针对 一定范围的病原体的保护性免疫所必不可少，所述病原体包括结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis ) (Khader等，2007)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) "e等，2001)和百日咳博德特氏菌（BordetelIa pe;rtussis)巧iggins等， 2006) O
[0014]已坚定地确定IL-10对不同T细胞子组(特别是化17细胞）的扩增和分化的增强作 用（Sutton等，2006; Acosta-Ro化iguez等，2007; Dunne等，2010;化aw等，2012)。在T细胞子 组之中，化17细胞表达最高水平的IL-1R，并且IL-I在化17致敏中起重要作用。因此，控制激 动性IL-I活性可应用于其中免疫刺激性作用将为合乎需要的不同生理/病理过程中。然而， 关于在免疫刺激性疗法中使用IL-I的一个主要顾虑是它在全身性施用时的重度毒性。因 此，当可使IL-I作用限于所选细胞群体时，毒性问题可能被解决，运打开例如作为T细胞佐 剂用于增强对微弱疫苗的应答的治疗远景(Ben-Sasson等，2011)。为使IL-I突变体特异性 祀向化17细胞群体，使用由融合于CCL20祀向部分的突变IL-I组成的IL-I变体。因为活化将 仅被限于表达CCR6的细胞(即Thl7细胞），所W预期无重大全身性毒性。
[001引 TNFa/瘦素突变体
[0016] TWa是一种具有广泛范围的生物活性的细胞因子，所述活性包括细胞毒性、调控 免疫细胞W及介导炎症性应答。它是一种具有233个氨基酸的自我装配性、非共价结合的同 源S聚II型跨膜蛋白。TNFa作为膜结合W及可溶性蛋白质具有活性，在由TNFa转化酶 (TACE，也称为ADAM17)蛋白水解裂解76个氨基末端氨基酸(前导序列）之后从细胞膜释放。 它通过均为在配体结合的细胞外结构域中具有富含半脫胺酸的基序的跨膜糖蛋白的巧中不 同受体，即TNF-Rl (p55)和TNF-R2 (p75)进行信号传导。尽管具有细胞外同源性，但它们具有 不同的细胞内结构域，并且因此信号传导不同的TN巧舌性化ehlgans和Pfeffer ,2005)。如W 前由Bosched等，2010所述，我们产生由通过GGGGS接头偶联的S个TNF单体组成的单链变 体（scTNF)。
[0017] 瘦素是一种设及许多生物过程，包括免疫、繁殖、线性生长、葡萄糖稳态、骨代谢和 脂肪氧化的16kDa的脂肪细胞细胞因子，但因它作为饱腹感信号的显著作用而最众所周知 化alaas等，1995)。由于它对免疫细胞的作用，瘦素也牵设于若干自体免疫疾病中（Ukuni 等，2008)。瘦素活性的选择性祀向可有益于代谢病症与免疫或炎症相关病症两者。
[0018] 本发明的第一方面是一种包含至少两个细胞因子的融合蛋白，其中至少一个