改善的具有高效能的纳米颗粒型寡核苷酸结构及其制备方法

改善的具有高效能的纳米颗粒型寡核苷酸结构及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及具有高效能的寡核巧酸结构，其可有效用于治疗癌症、感染性疾病等。
[0002] 本发明的寡核巧酸结构具有运样的结构，其中通过使用简单的共价键或由衔接物 介导的共价键将亲水性材料和疏水性材料缀合于寡核巧酸的两端，使得包含在寡核巧酸结 构中的寡核巧酸有效递送到细胞中，其中可通过寡核巧酸结构在水溶液中的疏水性相互作 用将所述结构转化为纳米颗粒形式。
[0003] 此外，本发明设及包含所述寡核巧酸结构的药物组合物、制备所述寡核巧酸结构 的方法及使用所述寡核巧酸结构递送寡核巧酸的技术。
【背景技术】
[0004] 目前已经积极地开发了基于寡核巧酸诸如反义寡核巧酸(ASO)、RNA干扰（W下称 为' RNAi '）、微小RNA(miRNA)等的各类治疗剂。
[0005] ASO具有通过改变mRNA经单链RNA或DNA链的中间代谢来控制信息由基因转移至蛋 白的功能，从而通过选择充分互补且特定杂交的碱基序列而实现预期的对祀标蛋白的表达 控制。ASOW序列特异性结合于祀标基因，其对除祀标基因 W外的其它基因的表达不具有作 用。因此，ASO技术是一种用于分析特定蛋白的体内功能的工具且具有用作针对特定疾病的 基因疗法的可能性(FA沈BJ. 9,1288-1296,1995)。
[0006] miRNA(微小RNA)是在受试者中天然产生的一大类小的RNA，且它们中的至少一些 控制祀标基因的表达。miRNA由约70个核巧酸单链发夹结构前体转录组通过核糖核酸酶 Dicer 形成（Ambros et al. 2003. current biologyl3( 10) :807-818),其中Dicer 切割前体 W形成21-23个核巧酸双链miRNA。在许多情况下，miRNA由一些功能尚未被发现的DNA序列 转录。miRNA不被翻译为蛋白，但是miRNA与阻断翻译的特定mRNA结合。据信miRNA与其祀标 不正确地形成碱基对，从而抑制翻译。
[0007] 自从已经发现了 RNAi的作用，在各种类型的哺乳动物细胞中发现RNAiW序列特异 性对mRNA 发挥作用（Silence of the transcripts : RNA interference in medicine.J Mol Med，2005，83:764-773)。当将双链RNA的长链递送到细胞中时，所递送的双链RNA转化 为小干扰RNA( W下称为'siRNA'），其通过称为Dicer的核酸内切酶被加工为21至23个碱基 对(bp) DSiRNA具有双链RNA的含有19至27个碱基的短链且偶联至由RNA诱导的沉默复合物 (RISC),由此向导（反义)链识别并分解祀标mRNA,从而序列特异性地抑制祀标基因的表达 (Nucleic-acid therapeutics:basic principles and recent applications.Nature Reviews Drug Discovery.2002.1,503-514)〇
[000引具体地，由外部递送的双链RNA的长链存在由于干扰素在哺乳动物细胞中表达而 过度引起非序列特异性免疫反应的问题；然而，发现该问题可通过短链SiRNA来克服 (Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature.2001.411,494-498)。
[0009]然而，SiRNA也具有由细胞中存在的感受器产生先天免疫应答刺激的可能性，且因 此，为了克服该可能性，改变SiRNA的特异性结构或已经开发了 2-甲氧基替代物或2-氣替代 物。
[0010] 化学合成的SiRNA具有约19-27个碱基对(bps)的双链且在3'-端具有2-nt(核巧 酸)悬突结构，且为了双链SiRNA表达活性而已知的是，双链SiRNA具有由3 径基(OH)和5 ' -憐酸基团（P〇4)构成的结构化ffect of asymmetric terminal st;ruc1:ures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection.Nucleic Acids Res IOctober 2008:5812-5821)。已知的是，商品化和合成的SiRNA具有其中在两端存在径 基的结构，且当合成的SiRNA被递送到细胞中时，SiRNA 5'-端通过憐酸化激酶被憐酸化W 表达SiRNA的功能（siRNA function in RNAi :A chemical modification analysis.RNA 2003.9:10:34-1048)。
[0011] Bedrand等人发现与在相同祀标基因上的反义寡核巧酸(ASO)相比，siRNA具有显 著抑制m R N A体外和体内表达的作用，且相应的作用可长时间地保持（C O m P a r i S O n O f antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo.Biochem.Biophys. Res.Commun.2002.296:1000-1004)〇
[001 ^ 此外，由于SiRNA与祀标mRNA互补性地偶联，从而序列特异性地调节祀标基因的表 达，相比于现有的基于抗体的医药产品或小分子药物而言，SiRNA的作用机制所具有的优 势是可显著增加能够被施用的勒!标（Progress Towards in Vivo Use of S iRNAs. MOLECULAR T肥RAPY.200613(4):664-670)。
[0013]即使基于寡核巧酸（SiRNA等）的治疗剂具有良好的作用和广泛使用范围，为了开 发作为治疗剂的SiRNA, SiRNA也需要通过改善SiRNA的稳定性和SiRNA的细胞递送效能而被 有效地递送到祀标细胞中化arnessing in vivo SiRNA delivery for 化Ug discoveiT and therapeutic development.Drug Discov Tod曰y.2006Jan;11(1-2):67-73)〇
[0014] 具体地，由于寡核巧酸诸如SiRNA等由于其荷负电而不能穿过细胞的疏水性憐脂 双层，因此将其通过简单的扩散而递送到细胞中是困难的。
[0015] 为了提高寡核巧酸的体内或体外递送效能，已经开发了各种类型的细胞递送材 料。通常且广泛使用脂质体、阳离子表面活性剂等。此外，已经知晓了使用载体的方法，诸如 将基因融合在脂质体中的方法、使用阳离子脂质或阳离子聚合物等的方法、改变化学结构 即改变寡核巧酸与甲基麟酸醋、肤核酸(PM)等的组合基本结构的方法及使用缀合物的方 法（Chemically modified s i RNA:tools and appIications.Dru邑 Discov Today .20080ct；13(19-20):842-855；Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides.Nucleic Acids Res.2008Jul;36 (12):4158-71)0
[0016] 在运些方法中，使用纳米载体的方法即使用各种聚合物诸如脂质体、阳离子聚合 物复合物等的方法用于通过形成纳米颗粒而在纳米载体中捕获寡核巧酸，从而将捕获的寡 核巧酸递送到细胞中。在使用纳米载体的方法中，主要应用的是使用聚合纳米颗粒、聚合物 胶束、脂质复合物等的方法，其中脂质复合物由与细胞的内涵体的阴离子脂质相互作用的 阳离子脂质构成，由此诱导内涵体的脱稳定化作用W将SiRNA递送到细胞中(Mechanism Of oligonucleotide release from cationic liposomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.19960ct 15;93(21):11493-8)。
[0017] 具体地，已知当寡核巧酸为SiRNA时，化学材料等连接于SiRNA过客(有义)链的端 部W提供增强的药代动力学特性，由此可体内诱导高效能(Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified si民NAs.Nature.2004Nov 11:432(7014) :173-8)。在此，SiRNA的稳定性可取决于与SiRNA有义(过客)或反义（向导)链 的端部连接的化学材料的性质而变化。例如，与聚合物化合物诸如聚乙二醇(PEG)缀合的 SiRNA与SiRNA的阴离子憐酸基团在阳离子材料的存在下相互作用W形成复合物，由此作为 具有改善的SiRNA稳定性的载体(Xocal and systemic delivery of VEGF SiRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer.J Control Release. 200 8J11I 14; 129(2): 107-16)。具体地，相比于用作药物递送媒介物的其它系统诸 如微球、纳米颗粒等，由聚合物复合物构成的胶束具有极小的尺寸、显著均匀的分布且是自 发形成的，由此易于控制形成质量且获得重现性。
[0018] 此外，为了改善SiRNA的细胞内递送效能，开发了使用SiRNA缀合物的技术W由此 获得SiRNA的稳定性且具有有效的细胞膜渗透性，在所述SiRNA缀合物中，亲水性材料为生 物相容性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))，其通过简单的共价键或由衔接物介导的共价键缀 合于SiRNA(参见韩国专利公开文本883471)。然而，SiRNA的化学修饰及与聚乙二醇(PEG)的 缀合(PEG化)仍然具有W下缺陷，即在生物体中的稳定性差且向祀标组织的递送不平顺。
[0019] 为了解决所述缺陷，开发了包含双链寡RNA的结构（'双链寡RNA结构'），其中亲水 性材料和疏水性材料与寡核巧酸且具体为双链寡RNA诸如SiRNA结合，其中双链寡RNA结构 通过疏水性材料的疏水性相互作用形成自组装纳米颗粒，其称为自组装胶束抑制性RNA (SAMiRNA?)(参见韩国专利公开文本1224828) ,SAMiRNA?技术相比于现有的递送技术而言 具有W下优势，即能够获得具有显著小的尺寸的均匀的纳米颗粒。
[0020] 作为SAMiRNA?技术的具体实例，PEG(聚乙二醇）用作亲水性材料，其中PEG为合成 聚合物，其用于提高药物且具体为蛋白的溶解性且用于控制药代动力学。阳G如所有合成聚 合物一样为多分散材料，一批中的聚合物由不同数目的单体的总和构成，分子量W高斯曲 线显示，且多分散性指数(Mw/Mn)表示物质的均匀程度。也就是说，当PEG具有低的分子量(3 至化化)时，多分散性指数为约1.01，且当PEG具有高的分子量(20W)a)时，多分散性指数为 约1.2,其是高的，由此当分子量更高时，物质的均匀度是相对低的(F.M.Veronese.化Ptide and protein PEGylation:a review of problems and solutions.Biomaterials(2001) 22:405-417)。
[0021] 因此，当PEG结合于药物时，PEG的多分散性特征反映在缀合物上，由此难于确定 单一物质。最近，为了克服该问题，通过合成PEG且改善纯化方法来生产具有低的多分散性 指数的物质处于一个上升的趋势，但是仍然具有由于所述物质的多分散特性而产生的问 题，具体地，当PEG结合于具有小分子量的物质时，难于证实该结合是否容易地进行等 (Francesco M.Veronese and Gianfranco Pasut.PEGylation,successful approach to drug delive巧.DRUG DISCOVERY T0DAY(2005)10(21):1451-1458)0
[0022] 此外，纳米颗粒的尺寸显著地影响向祀标细胞的递送有效性，当纳米颗粒的尺寸 为50nm或更小时，纳米颗粒经由排泄而从体内快速清除，且当纳米颗粒的尺寸为IOOnm或更 大时，纳米颗粒无法均匀地递送到组织中，且效果是降低的。因此，需要形成各自具有预定 尺寸的纳米颗粒（Wim H De Jong and 化ul JA Borm. Int J Nanomedicine. 2008June; 3 (2):133-149.)〇
[0023] 因此，市面上迫切地需要一种新概念的寡核巧酸递送技术W解决亲水性材料诸如 PEG等本身的多分散性特征同时保持它们所属相关领域的SAMiRNA?的优秀效果。

【发明内容】

[0024] 本发明的一个目标是提供一种新概念的具有小尺寸和改善的多分散性的纳米颗 粒及形成所述纳米颗粒的寡核巧酸结构。
[0025] 此外，本发明的另一个目标是提供一种制备寡核巧酸结构和由所述寡核巧酸结构 形成的纳米颗粒的方法、包含所述寡核巧酸结构的药物组合物及使用所述寡核巧酸结构控 制基因表达的技术。
[0026] 发明人有如下发现并完成了本发明：在作为现有的自组装纳米颗粒的SAMiRNA?技 术中，当构成SAMiRNA?的寡核巧酸结构的亲水性材料被嵌段为包含具有预定分子量的均一 单体(单体数目为m)及衔接物(需要时）的基本单元并按需要使用适当数目的经嵌段的亲水 性材料时，相比于现有的SAMiRNA?,由所述寡核巧酸结构形成的纳米颗粒具有显著小的尺 寸及显著改善的多分散性。
【具体实施方式】
[0027] 本发明的寡核巧酸为由DNA(脱氧核糖核巧酸)或RNA(核糖核巧酸）构成的物质且 是指在互补结合所形成的单链或双链中形成的反义寡核巧酸、小干扰RNA(SiRNA)、小发夹 RNA(ShRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA抑制剂、适体等，但是本发明不限于此。
[0028] 具体地，当本发明的寡核巧酸为双链寡核巧酸时，反义链为在由RNA诱导的沉默复 合物(RI SC)中与祀标mRNA互补结合W分解祀标mRNA的链，由此具有RNAi活性，且有义链是 指具有与反义链互补的序列的链。本发明的巧补"或巧补结合"是指两个序列彼此结合W 形成双链结构，其中所述结合不必是完全匹配结合且在一些序列不同的情况下也可包含错 配。
[0029] 此外，本发明的miRNA模拟物为具有与天然存在的miRNA相同的序列和结构的双链 RNA，其是指呈化学合成形式的HiiRNAnmiRNA抑制剂是指化学合成的单链寡核巧酸，其与天 然存在的miRNA互补结合W抑制相应的miRNA的作用。
[0030] 在示例性实施方案中，本发明提供新形式的寡核巧酸结构，其具有由W下结构式 (1)或结构式(2)表示的结构。
[0031] Q-(Am-J)D-X-R-Y-B 结构式（1)
[0032] Q-(J-Am)D-X-R-Y-B 结构式（2)
[0033] 在结构式（1)和(2)中，A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，J为其中亲水性材料 单体(总数为m)彼此连接的衔接物或其中亲水性材料单体(总数为m)与寡核巧酸连接的衔 接物，X和Y各自独立地为简单的共价键或由衔