用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分离的其多核苷酸 ...的制作方法
【专利说明】用于从水解方式裂解玉米赤霉稀酬和/或玉米赤霉稀酬衍生 物的多化，分离的其多核昔酸，从及包含多化的添加剂、其用 途及方法
[0001] 本发明设及用于W水解方式裂解玉米赤霉締酬和/或至少一种玉米赤霉締酬衍生 物的多肤，编码此类多肤的分离的多核巧酸，W及包含此类多肤的添加剂，还设及此类多肤 的用途，W及设及用于W水解方式裂解玉米赤霉締酬和/或至少一种玉米赤霉締酬衍生物 的方法。
[0002] 真菌毒素是丝状真菌产生的次生代谢物。其一个重要的代表是世界范围传播的玉 米赤霉締酬(ZENK W前称为F-2毒素），其由许多镶抱菌真菌产生。运些真菌尤其侵染栽培 植物，例如各种各样的谷类，其中真菌侵染通常出现在收获之前，其中真菌生长或真菌毒素 产生可W在收获之前发生，或者在不适当的胆藏的情况下也可W在收获之后发生。FAO估 计，在世界范围内25%的农产品被真菌毒素污染，运导致巨大的经济损失。在一项最近在世 界范围内进行的研究中，从2009年1月至2011年12月分析了总共23,781个样品，其中81%经 测试为对于至少一种真菌毒素来说阳性和45%对于ZEN来说阳性。可W在世界的所有地区 中，同样地在所有经测试的谷物类别和饲料类别，例如玉米、大豆粉、小麦、麦教、孤GS(干酒 糟）中，W及在预制饲料混合物中，W直至100%的频率发现ZEN。
[0003] ZEN是一种非酱类的、雌激素的、大环的、通过聚酬化合物物质代谢途径合成的内 醋，其具有下述结构式：
[0004]
[0005] 和IUPAC命名名称"(沈，11S)-15,17-二径基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八 碳-1(18),2,14,16-四締-7,13-二酬"。
[0006] 然而，在自然界中还存在有许多ZEN衍生物，其通过ZEN的酶促或化学修饰而形成。 关于此的例子为糖巧式的或含硫酸醋的ZEN缀合物，其由真菌、植物或哺乳动物代谢来形 成；W及ZEN代谢物，其尤其在人或动物机体中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中 存在的或者通过化学或生物化学合成而制备的ZEN缀合物或ZEN代谢物，但特别地是指a-玉 米赤霉締醇(a-Z化；（26,73，115)-7，15，17-^径基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八 碳-l(18)，2，14，16-四締-13-酬）、(6-玉米赤霉締醇((6-Z化；（沈，7S，llS)-7，15，17-S?基-ll-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-la8)，2，14，16-四締-13-酬）、a-玉米赤霉醇(a-ZAレ（7R，llS)-7，15，17-S?基-ll-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-l(18)，14，16-S 締-13-酬）、e-玉米赤霉醇（0-241;(75，115)-7，15，17-^径基-11-甲基-12-氧杂双环 [12.4.0]十八碳-1(14)，15，17-^締-13-酬）、玉米赤霉締酬-14-硫酸醋(2145;[(沈，115)-15-径基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四締-17-基]硫酸氨醋）、玉米赤霉締酬-14-糖巧(Z14G;(2E，11S)-15-^基-11-甲基-17-[(3R，4S， 55,610-3,4,5-^径基-6-(径甲基）四氨化喃-2-基]氧基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1 a8)，2，14，16-四締-7，13-二酬似及玉米赤霉酬(ZAN;(llS)-15，17-二?基-ll-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18)，14,16-S締-7,13-二酬）。
[0007] ZEN，同样地还有ZEN衍生物，尤其是a-ZEL、(6-ZEL、Z14S、a-ZAL、(6-ZAL、Z14G和ZAN， 由于其高的化学和物理稳定性而还可W在经加工的食品或饲料例如面包或啤酒中检测到。 [000引ZEN与雌激素受体结合并且可W引起激素素乱，其中它在经口摄取后立即被吸收， 并且被哺乳动物转变为两个立体异构的代谢物，分别为a-ZHj日P-ZEL。在此，例如a-ZEL，还 有a-ZAL或ZAN具有比ZEN强得多的动情效应。经缀合的ZEN衍生物有时具有比ZEN低的雌激 素活性，然而如果情况可能，ZEN可W从运些ZEN衍生物中重新被释放到消化道中。
[0009] 虽然ZEN具有相对低的急性毒性并且具有直至20 ,OOOmgAg体重的口服LD50值，但 是在较长期摄入的情况下在动物或人中出现亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致崎形 的、致癌的、动情的和免疫抑制的效应。被ZEN污染的饲料导致哺乳动物中的发育障碍，其中 猪，特别是幼猪对于ZEN是极其敏感的。超过0.5ppm的在饲料中的ZE脚农度导致发育障碍，其 中例如超过1.5ppm的浓度可W导致猪中的超雌激素活性，和12ppm ZEN的浓度被认为对牛 中的流产负责。由于玉米赤霉締酬通过粘膜，特别是通过胃粘膜，但也通过口腔粘膜被迅速 吸收，因此立即的和尤其是定量的纯化是必要的。在ZEN的口服给药后30分钟已经可W在血 液中检测到它们。在运种情况下，使用经分离的针对微生物的酶具有优点，例如更高的比活 性或更快的作用。由于ZEN的有害效应，因而在欧盟存在有在食品中的强制性的ZEN上限W 及对于在饲料中的ZEN上限的推荐化C NO: 1881/2006)。
[0010] 为了减少食品或饲料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生长，例如通过遵循"良好 的农业实践经验"。运尤其包括，种子没有害虫和真菌侵染，或者及时从田地中移除农业废 料。此外，还可W通过使用杀真菌剂来减少田地上的真菌生长。在收获之后，应当将收获物 储藏在低于15%的残留水分含量和低的溫度下，W阻止真菌生长。同样地，应当在再加工之 前去除由于真菌侵染而被污染的物料。尽管有着运一系列措施，但I.Ro化iges和K.化e虹er (2012)仍然报道了，即使在具有最高农业标准的地区，例如USA和中欧，在2009年至2011年 中，分别有29 %和39 %的经测试的玉米样品被ZEN污染。
[0011] 用于从饲料或食品中去除ZEN的其他可能性为真菌毒素的吸附或转化。为此所必 需的是，真菌毒素与吸附剂的结合在宽的pH范围内是强的且特异的，并且在胃肠区域内的 整个消化过程中保持稳定。虽然对于黄曲霉毒素可W有效地使用几种非生物吸附剂，例如 活性炭、娃酸盐或合成的聚合物，例如消胆胺，但是它们用于其他真菌毒素则受到限制。吸 附剂的主要缺点是其他有时候对于营养供给来说必需的分子的非特异性结合。在文献中同 样也描述了生物吸附剂，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附剂像非生物吸附剂一样也 具有类似的限制。
[0012] 通过物理和化学处理来对ZEN进行解毒也受到限制。通过热处理，不能有效地使 ZEN纯化，但是可W通过挤出和用氧化剂进行处理，例如在80°C下用10%的过氧化氨溶液处 理16小时，来使ZEN含量降低83.9%。在饲料和食品的制备中挤出方法和氧化剂例如臭氧或 过氧化氨的使用，由于高的成本、品质损失、有时候低的效率和低的特异性而受限。
[0013] 借助于微生物例如隧真菌毒素丝抱酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)、粉 红粘靑霉(Gliocladium roseum)或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)菌株或者从其中分 离出的酶例如水解酶或过氧化物酶来进行ZEN的生物转化也例如在E . Vekiru等人， Appl.and Environ.Microb.，2010,76,7,2353-2359中进行了描述。
[0014] 从EP 0 938 575B1中知晓了红球菌属(I?hodococcus)和诺卡氏菌属(Nocardia)的 细菌，特别是球状红球菌(R. globerulus)、红串红球菌(R. eirthropolis)和球形诺卡氏菌 (N. globerula)的 ZEN 降解特性。
[0015] 从WO 02/076205中可获知从粉红粘靑霉中分离出的酶的ZEN降解作用，所述酶尤 其为a/e-水解酶、玉米赤霉締酬水解酶UZ皿1)，其借助于催化S元体来催化ZEN的降解。
[0016] 从WO 2012/113827中获知重组Zonase,即ZEN降解酶，其在胃肠道中保持稳定，特 别地在其中描述了微生物例如褐色双歧嗜热菌（Thermobifidia fusca)、脱叶链霉菌 (Sheptomyces exfoliatus)、德氏食酸菌（Acidovorans delafieldii)和链霉菌属物种 (Streptomyces sp.)。
[0017] 能够水解ZEN和/或至少一种ZEN衍生物的多肤或酶也可W称为Zonase。
[0018] 下面所使用的术语取自专业用语并且总是W传统的意义进行使用，除非另外指 出。因此，术语"多核巧酸"设及具有所有长度和序列的每一种类型的遗传物质，例如单链和 双链DNA和RNA分子，包括调控元件、结构元件、基因群、质粒、全基因组及其片段。名称"多 肤"包括蛋白质，例如酶、抗体，W及具有直至500个氨基酸的多肤，例如肤抑制剂，蛋白质的 结构域，还有具有小的序列长度例如少于10个氨基酸的短多肤，例如受体、配体、肤激素、标 签等。名称"在多核巧酸或多肤中的'位置'"设及在所述多核巧酸或多肤的序列中单个特定 的碱基或氨基酸。
[0019] 现在，本发明旨在提供运样的多肤W供使用，用所述多肤可成功实现将ZEN和/或 至少一种ZEN衍生物快速地且可靠地转化为经水解的ZEN和/或经水解的ZEN衍生物。为了解 决该任务，本发明的特征主要在于，所述多肤是具有选自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或 其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同 一性为至少40 %。
[0020] 根据本发明，名称"序列同一性"设及序列同一性百分比。对于氨基酸序列和核巧 酸序列，序列同一性可W目视测定，但是优选地用计算机程序来计算出来。还在序列区段内 进行序列比较，其中参考序列的连续序列被理解为区段，并且优选地包含该序列的保守区 域。
[0021 ] 在当前的情况下，序列同一性借助于程序NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)来进行测定，特别地对于多肤，用BLASTP，和对于多核巧酸，用BLASTN，其提供 在('National Center for Biotechnology Information"的主页（NCBI; http :// WWW.ncbi .nlm.n;Lh.gov/)上W供使用。因此，可能的是，根据Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. ,25:3389-3402)的算法，将两个或更多个序列互相进行比较。为了本发明的目 的，使用2013年5月15日的那个版本的程序。作为程序设置，考虑基本设置，但是特别地，对 于氨基酸序列比较："最大祀序列（max target sequence)" = 100 期望阔值（expected threshold)" = 10;。字长(word size)" =3;。矩阵（mahix)" =I3LOSOM62;。缺口成本（gap costs)"=。存在化xistence) : 11;延伸化Xtention) : 1";。计算调整（computational adjustment)" =。条件式组成得分矩阵调整（Conditional compositional score mahix adjustment)" ; W及对于核巧酸序列比较:字长：11;期望值(^Expect value): 10;缺口成本： 存在=5,延伸=2;过滤器(Filter)=低复杂度激活的（low complexity activated);匹 配/错配得分(Match/Mismatch Scores) :2,-3;过滤器字符串（Filter String) :L;m。
[0022] 术语"功能性多肤变体"或"功能性变体"一方面设及多肤的"等位基因变体"和多 肤的"功能性片段"，另一方面设及多肤的"修饰"，其中酶促功能基本上未改变。名称"等位 基因变体"设及运样的多肤，所述多肤通过在自然界中随机发生的核巧酸序列突变而产生 并且引起氨基酸序列的改变，其中其酶促功能未受影响。"修饰"可W例如是与多肤的C-末 端或N-末端融合物或者经突变的多肤，其中突变可W通过至少一个氨基酸的置换、插入或 缺失来获得，运特别地通过位点特异性诱变或随机诱变、重组和/或任何其他蛋白质工程方 法来进行。术语"置换"、"插入"和"缺失"W在基因技术中通常的和专业人员熟悉的含义来 进行使用。术语"功能性片段"设及多肤的部分或部分序列或者其功能性变体