胺 来连接的上述方法合成其中六乙二醇结合于3'端的寡RNA-亲水性材料结构的有义链，且将 包含二硫键的二十四烧结合于5'端，由此产生预期的RNA-聚合物结构的有义链。对于其中 用有义链进行退火的反义链，具有与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。
[0259] 当合成完成时，将通过在水浴中在60°C处理28% (v/v)氨水来合成的RNA单链和 RNA-聚合物结构各自与CPG分开并通过脱保护反应从其中除去保护部分。将从其中除去保 护部分的RNA单链和RNA-聚合物结构用体积比为10: 3:4的N-甲基化咯烧酬、S乙胺和S乙 胺=氨氣化物在烘箱中在70°C处理W除去2' TBDMS(叔下基二甲基甲娃烷基）。
[0260] 反应产物的RNA通过配备有Daisogel C18(Daiso,Japan)柱的HPLC LC918(Japan Analcal Indushy,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪（Shimadzu,Japan)证 实纯化的RNA是否符合祀标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA结构，将等量的有义链 和反义链彼此混合并置于1 X退火缓冲液(30mM肥阳S、IOOmM乙酸钟、2mM乙酸儀(pH 7.0至 7.5))中，随后在恒溫水浴中在90°C反应3分钟并再次在37°C反应，由此制备包含具有存活 素序列作为有义链的SiRNA的各种双链寡RNA结构。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构 是退火的。
[0261] 实施例5.2.制备包含其中引入有氨基的乙二醇作为亲水性材料单体的SAMiRNA
[0264]结构式(25)具体地由W下结构式(26)表示：[02651
[0262 ] 生'll 々山 1、I -必+ ~^*仁> _户 / O 广、二^^ ~AAt T7T7 占>护 +仁I -th 1~1~1、1知 -y* 口 1、玄IIjzl '1*山冬冬业、I
[0%3]
[0266]在结构式(25)和(26)中，S为SiRNA的有义链;AS为SiRNA的反义链;六乙二醇为亲 水性材料;Cs为具有6个碳且将[乙二醇]4与胺连接的衔接物;C24为疏水性材料即包含二硫 键的二十四烧;且5'和3'是指双链寡RNA端部的方向性。
[0267] 此外，亲水性材料嵌段在SiRNA有义链的3 '端连接于憐酸基团。
[0268] 结构式(25)和（26)的SiRNA的有义链如下制备:基于包含3'班巧酷亚胺衍生物的 CPG作为载体合成具有0-氯基乙基亚憐酷胺形式的4个六乙二醇，且凭借其中形成RNA骨架 结构的憐酸二醋键通过使用RNA 0-氯基乙基亚憐酷胺来连接的上述方法合成其中六乙二 醇结合于3'端的寡RNA-亲水性材料结构的有义链，且将包含二硫键的二十四烧结合于5' 端，由此产生预期的RNA-聚合物结构的有义链。对于其中用有义链进行退火的反义链，具有 与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。
[0269] 当合成完成时，将通过在水浴中在60°C处理28% (v/v)氨水来合成的RNA单链和 RNA-聚合物结构各自与CPG分开并通过脱保护反应从其中除去保护部分。将从其中除去保 护部分的RNA单链和RNA-聚合物结构用体积比为10: 3:4的N-甲基化咯烧酬、S乙胺和S乙 胺=氨氣化物在烘箱中在70°C处理W除去2' TBDMS(叔下基二甲基甲娃烷基）。
[0270] 反应产物的RNA通过配备有Daisogel ClS(DaisoJapan)柱的HPLC LC918(Japan Anal}ftical Indushy,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪（ShimadzuJapan)证 实纯化的RNA是否符合祀标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA结构，将等量的有义链 和反义链彼此混合并置于1 X退火缓冲液(30mM肥阳S、IOOmM乙酸钟、2mM乙酸儀(pH 7.0至 7.5))中，随后在恒溫水浴中在90°C反应3分钟并再次在37°C反应，由此制备包含具有存活 素序列作为有义链的S i RNA的各种双链寡RNA结构（W下分别称为SAM i RNA-存活素）。通过电 泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
[0271] 实施例5.3.制备包含其中引入有多组氨酸基团的乙二醇作为亲水性材料单体的 SAMiRNA
[0272] 制备由W下结构式(27)表示的双链寡RNA结构，其中将肤引入到亲水性材料中。
[0273]
[0274] 在结构式(27)中，H为组氨酸，且C为半脫氨酸。
[0275] 结构式(27)具体地由W下结构式(28)表示：
[02761
结构式(28)
[0277] 在结构式(27)和(28)中，S为SiRNA的有义链;AS为SiRNA的反义链；[乙二醇]4为亲 水性材料;衔接物为在肤和SAMiRNA之间的衔接;肤为由HHHHHHC序列构成的肤;C24为疏水性 材料即包含二硫键的二十四烧;且5 '和3 '是指双链寡RNA端部的方向性。
[027引此外，亲水性材料嵌段在SiRNA有义链的3 '端连接于憐酸基团。
[0279]结构式(27)和(28)中的SiRNA的有义链如下制备:将具有结合于胺的官能团（例如 NHS醋)和结合于肤的琉基(-SH)的官能团（例如马来酷亚胺）的衔接物与实施例5-2的由结 构式(25)和(26)表示的寡核巧酸连接。具体地，将衔接物连接于具有结构式(25)和(26)的 结构的寡核巧酸，然后通过HPLC或树脂纯化。将肤连接于纯化的寡核巧酸并通过HPLC纯化， 由此制备SiRNA的有义链。对于其中用有义链进行退火的反义链，具有与有义链互补的序 列的反义链通过上述反应产生。反应产物的RNA通过配备有化isogel C18扣aiso Japan)柱 的HPLC LC918(Japan Anal}ftical Indushy,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪 (化imadzu，Japan)证实纯化的RNA是否符合祀标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA 结构，将等量的有义链和反义链彼此混合并置于1 X退火缓冲液(30mM皿PES、IOOmM乙酸 钟、2mM乙酸儀(pH 7.0至7.5))中，随后在恒溫水浴中在90°C反应3分钟并再次在37°C反应， 由此制备包含具有存活素序列作为有义链的SiRNA的各种双链寡RNA结构（W下分别称为 SAMiRNA-存活素）。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
[0280] 实施例6.通过由双链寡核巧酸聚合物结构(六乙二醇-SAMiRNA)形成的纳米颗粒 在HeLa细胞系中抑制革己标基因表达
[0%1]通过使用由包含可减少存活素表达量的SiRNA序列的六乙二醇-SAMiRNA形成的纳 米颗粒转化子宫颈癌细胞系化eLa)，且祀标基因的表达方面在转化的子宫颈癌细胞系 化eLa)中WRNA水平进行分析。
[0巧。实施例6-1.人子宫颈癌细胞系的培养
[0283] 将由美国典型培养物保藏中屯、(ATCC)获得的人子宫颈癌细胞系化eLa)在与实施 例5-1相同的条件下培养。
[0284] 实施例6-2.将其中引入有氨基的六乙二醇-SAMiRNA转染到人子宫颈癌细胞系中
[0285] 将由实施例6-1培养的0.8X IO5个子宫颈癌细胞系化eLa化EMEM培养基中在12孔 板中在37°C和5%(v/v)0)2的条件下培养18小时并除去培养基并将相同量的化ti-MEM培养 基(GIBC0，USA)分配到每个孔中。通过与实施例5-1相同的方法将所得混合物在-75°C和 SmTorr的条件下冷冻干燥48小时W产生均一的纳米颗粒。加入由实施例3-2制备的六乙二 醇-SAMiRNA并W 50鞭/m《的浓度溶解在DPBS中并按照50、100和200nM的浓度在Opti-MEM 培养基（Iml)中处理。根据浓度在肿瘤细胞系的每个孔中分配并处理包含六乙二醇-SAMiRNA的Opti-MEM并将所得产物在37°C和5% (v/v)C〇2的条件下培养总计48小时。
[0巧引实施例6-3.对祀标基因 mRNA的相对定量分析
[0287]凭借与实施例4-3相同的方法通过由在实施例6-2中转染的细胞系提取全部RNA 来产生cDNA，且祀标基因的mRNA表达量通过实时PCR进行相对定量。祀标基因表达由于用其 中引入有氨基的六乙二醇-SAMiRNA进行处理而观察到的抑制量明确地证实了其中引入有 氨基的六乙二醇-SAMiRNA与对照组即六乙二醇-SAMiRNA相比的效能（图18)。
【主权项】
1. 具有由w下结构式(1)或结构式(2)表示的结构的寡核巧酸结构： Q-(Am-J)n-X-R-Y-B 结构式（1) Q-(J-Am)n-X-R-Y-B 结构式（2) 其中A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，J为用于在各组m个亲水性材料单体之间连 接的衔接物或用于在m个亲水性材料单体与寡核巧酸之间连接的衔接物，X和Y各自独立地 为简单的共价键或由衔接物介导的共价键，R为单链或双链寡核巧酸，m为1至15的整数，且η 为1至10的整数， Q为α广Zj)或P-J广J2， L为配体，其特异性结合于通过由受体介导的内吞作用（RME)促进祀标细胞内摄的受 体， Z为衔接物，其介导简单的共价键或介导亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体和配体 之间的键， i表示0-5的整数且优选为0-3的整数，且j表示0或1，条件是当i为加寸，j必须为0， P表示氨基或多组氨酸基团，且 Ji和J2独立地为衔接物，其介导简单的共价键或介导氨基或多组氨酸基团与亲水性材 料之间的键。2. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中R为双链寡核巧酸，且有义链或反义链具有19至31 个核巧酸。3. 权利要求2的寡核巧酸结构，其中憐酸基团结合于双链寡核巧酸的反义链的5'端。4. 权利要求3的寡核巧酸结构，其中连接于反义链的5'端的憐酸基团为一个至Ξ个。5. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中所述疏水性材料具有的分子量为250至1，000。6. 权利要求5的寡核巧酸结构，其中所述疏水性材料为选自W下的一种：类固醇衍生 物、甘油醋衍生物、甘油酸、聚丙二醇、Cl连C5G不饱和或饱和控、二酷基憐脂酷胆碱、脂肪 酸、憐脂和脂多胺。7. 权利要求6的寡核巧酸结构，其中所述类固醇衍生物选自胆固醇、胆酱烧醇、胆酸、胆 酱醇甲酸醋、胆酱烧醇甲酸醋和胆酱醇胺。8. 权利要求6的寡核巧酸结构，其中所述甘油醋衍生物选自甘油一醋、甘油二醋和甘油 Ξ醋。9. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中所述亲水性材料单体具有由W下化合物（1)表示的 结构：化合物（1) 其中G选自C出、0、S和畑。10. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中衔接物(J)选自P〇3\ S化和C〇2。11. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中Χ、γ和Z分别为不可降解的键或可降解的键。12. 权利要求11的寡核巧酸结构，其中所述不可降解的键为酷胺键或憐酸化键。13. 权利要求11的寡核巧酸结构，其中所述可降解的键为二硫键、酸可降解的键、醋键、 酢键、生物可降解的键或酶可降解的键。14. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中Q为化i-Zj)，Z为衔接物，其介导亲水性材料嵌段中 的亲水性材料单体和配体之间的键，且衔接物z包含六乙二醇。15. 权利要求14的寡核巧酸结构，其中衔接物Z为化合物(4):其中T是指1至15次重复的如下表示的化合物（1)，且G选自C出、0、S和NH，化合物（1)。16. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中Q为(Li-&化具有由W下结构式(19)表示的结构：结构式(19) 其中A、B、R、m、n、Z和L与在权利要求1的结构式(2)中的定义相同。17. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中Q为化1-?)，且配体化)选自糖类、肤和抗体。18. 权利要求17的寡核巧酸结构，其中所述糖类选自己糖胺、单糖、二糖和多糖。19. 权利要求1的寡核巧酸结构，其中Q为P-J1-J2，且P为选自W下的一种:伯氨基至叔氨 基或包含5至8个组氨酸的多组氨酸基团。20. 权利要求19的寡核巧酸结构，其中Jl和J2独立地选自简单的共价键、C2-12烷基、締 基、烘基、P〇3-、S〇3 和 C〇2。21. 由W下结构式(20)表示的固体载体：其中L为配体，其特异性结合于通过由受体介导的内吞作用(RME)促进祀标细胞内摄的 受体，T为其中化合物（1)重复1至15次的化合物(化合物（1)中的G选自CH2、0、S和畑）， -一化合物（1) C和D中的一个是指固体载体，C和D中的另一个是指二甲氧基Ξ苯甲基，i为0-3的整数， 且E和F独立为1至10。22. 通过使用权利要求21的固体载体制备权利要求1的单链或双链寡核巧酸结构的方 法。23. 权利要求22的方法，所述方法包括： (1) 将亲水性材料嵌段Wn次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体； (2) 基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链寡核巧酸； (3) 将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的寡核巧酸的5 '端;和 (4) 将寡核巧酸结构与固体载体分开。24. 权利要求22的方法，所述方法包括： (1) 将亲水性材料嵌段Wn次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体； (2) 基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA; (3) 将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的RNA的5'端； (4) 将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开;和 (5) 通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火形成双链寡核 巧酸。25. 权利要求23的方法，其中与步骤(2)的单链寡核巧酸互补的单链寡核巧酸具有结合 于该单链寡核巧酸的5'端的憐酸基团。26. 纳米颗粒，其包含权利要求1-20中任一项的寡核巧酸结构。27. 权利要求26的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒为低压冻干的。28. -种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的寡核巧酸结构。29. -种药物组合物，其包含权利要求26或27的纳米颗粒。30. 通过使用权利要求1-20中任一项的寡核巧酸结构控制体外或体内基因表达的方 法。31. 通过使用权利要求26或27的纳米颗粒控制体外或体内基因表达的方法。
【专利摘要】本发明涉及寡核苷酸结构及其制备方法且更具体地涉及这样的寡核苷酸结构，其中聚合物化合物经共价键连接至寡核苷酸以改善所述寡核苷酸的体内稳定性和所述寡核苷酸的细胞递送效能；且涉及其制备方法。所述寡核苷酸结构被改善为均质物质，由此解决了由于在连接至所述寡核苷酸的亲水性材料为合成聚合物时产生的多分散特性所导致的物质确认中的问题；相比于现有方法，所述核苷酸结构易于合成；且双螺旋寡RNA结构的大小可通过控制亲水性材料嵌段的重复数目而精确地调节，且因此所述寡核苷酸的基因表达调节功能通过合成优化的寡核苷酸结构而不会变坏，且所述寡核苷酸可甚至以相对低浓度的剂量递送到细胞中。因此，本发明的寡核苷酸结构可用作用于治疗癌症、感染性疾病等的一类新的寡核苷酸递送系统及工具。
【IPC分类】C07H21/00, C12N15/113, A61K48/00
【公开号】CN105705638
【申请号】CN201480048981
【发明人】朴翰浯, 蔡济旭, 尹坪伍, 韩宝兰, 磪基恩, 高映浩, 权泰宇, 李在敦, 金淳基
【申请人】柏业公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年7月4日
【公告号】CA2917299A1, EP3018208A1, WO2015002511A1