生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分离的多肤、表达该多肤的微生物和使用其生产0-班巧酷高丝氨酸的 方法，所述分离的多肤对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶 活性。
【背景技术】
[0002] 已知自然界中存在的大多数微生物利用0-班巧酷高丝氨酸或0-乙酷高丝氨酸作 为中间体用于生物合成甲硫氨酸。一般而言，由将班巧酷辅酶A的班巧酷基缀合至高丝氨酸 的高丝氨酸0-班巧酷转移酶(MetA)生产0-班巧酷高丝氨酸，并且由将乙酷辅酶A的乙酷基 缀合至高丝氨酸的高丝氨酸0-乙酷转移酶(MetX)生产0-乙酷高丝氨酸。即，在中间体间生 产0-班巧酷高丝氨酸中，metA在生产其的微生物的发育中是最重要的基因之一。同时，与 MetA不同，MetX已知为没有被反馈抑制并且具有高的酶稳定性。
[0003] 当甲硫氨酸生物合成途径中的脫硫酸丫合成酶被阻断时，0-班巧酷高丝氨酸被集 聚，并且因此产0-班巧酷高丝氨酸的菌株需要心甲硫氨酸。因此，将甲硫氨酸加入到培养基 中，并且高丝氨酸0-班巧酷转移酶的活性被加入到培养基中的甲硫氨酸抑制，并且最终，不 能获得高浓度的0-班巧酷高丝氨酸。
[0004] 因此，许多在先专利已经将它们的研究集中于从反馈控制系统解除（release) metA的反馈抑制。然而，由metA编码的高丝氨酸0-班巧酷转移酶具有W下问题:其野生型蛋 白本身具有低的稳定性并且为了解除反馈抑制引入突变加剧不稳定性。因此，对于具有高 生产力的产0-班巧酷高丝氨酸的菌株的开发而言，去除HietA基因的反馈抑制和稳固酶稳定 性是必需的。
【发明内容】
[000引[技术问题]
[0006] 为了解决上面描述的metA的反馈抑制的现象和酶不稳定性问题，本发明人已经努 力开发了具有稳固的酶稳定性同时不受甲硫氨酸反馈抑制的高丝氨酸0-班巧酷转移酶，并 且就运一点而言，已经筛选了具有活性的新型的酶。作为选择如此筛选的候选基因并在将 它们引入埃希氏杆菌属化scherichia)某种之后在烧瓶中培养的结果，本发明人已经发现 了 0-班巧酷高丝氨酸的生产，并且发现了如此选择的基因具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶活 性和对甲硫氨酸的反馈抑制的抗性，因此完成本发明。
[0007] [技术方案]
[000引本发明的目标是提供新型的分离的多肤，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且 具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性。
[0009] 本发明的另一目标是提供编码该新型的分离的多肤的多核巧酸。
[0010] 本发明的进一步的目标是提供生产0-班巧酷高丝氨酸的微生物，其表达该新型的 分离的多肤。
[0011] 本发明的进一步的目标是提供使用上面的微生物生产0-班巧酷高丝氨酸的方法。
[0012] [发明的有益效果]
[0013] 生产0-班巧酷高丝氨酸的微生物一一其包括新型的分离的多肤，该多肤对甲硫氨 酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性一一可W对甲硫氨酸的反 馈抑制具有抗性并且W高产量生产0-班巧酷高丝氨酸，并且因此可W有效地用于W高产量 生产心甲硫氨酸，其使用0-班巧酷高丝氨酸作为前体。
[0014] [实施本发明的最佳模式]
[0015] 为了实现上面的目标，在一方面，本发明提供了对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性 并且具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性的新型的分离的多肤。
[0016] 如本文所使用，术语"高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性"指的是将高丝氨酸转化为0-班巧酷高丝氨酸的活性。
[0017]如本文所使用，术语"反馈抑制"指的是高丝氨酸0-班巧酷转移酶的活性受甲硫氨 酸的抑制。
[0018] 本发明的多肤的特征在于它具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列，该氨基酸序列具有 高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。与上述多肤具有80% 或更多，特别地90%或更多，更特别地95%或更多，和甚至更特别地97%或更多的序列同源 性的任何多肤也在本发明的范围内，只要如本发明中建议的，该多肤具有高丝氨酸0-班巧 酷转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。同源性百分比可W使用BLAST 2.0--其是参考算法--测定，或者使用化arson的FASTA测定[Methods Enzymol183, 63 ( 1990 )，下文]。基于BLAST算法，已经开发了称为BLASTN和BLASTX的程序 [WWW.ncbi .nlm.nih.gov，下文]。
[0019] 在另一方面，本发明提供了编码上述多肤的分离的多核巧酸。具体而言，多肤由 SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的多核巧酸序列编码，由于密码子简并性，与上述序列具有至 少80 %，特别地90 %或更多，更特别地95 %或更多，和甚至更特别地97 %或更多的序列同源 性的那些多核巧酸也在本发明的范围内，但是不限于此。
[0020] 在仍另一方面，本发明提供了 W可操作方式包括该多核巧酸的载体。
[0021] 如本文所使用，术语"载体"指的是包括编码感兴趣的蛋白质的多核巧酸的核巧酸 序列的DNA构建体，其中感兴趣的蛋白质可操作地连接至适合的调控序列，使得感兴趣的蛋 白质可W在适合的宿主中表达。调控序列可W包括能够起始转录的启动子、用于调控转录 的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列和调控转录和翻译终止的 序列。载体在转化入适合的宿主之后，可W独立于宿主基因组复制或起作用，或者可W整合 入宿主基因组本身。
[0022] 本发明中使用的载体没有被具体地限制，只要载体在宿主中是可复制的，并且可 W使用本领域中已知的任何载体。
[0023] 在仍另一方面，本发明提供了表达多肤的产0-班巧酷高丝氨酸的微生物，所述多 肤对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸0-班巧酷转移酶活性。
[0024] 如本文所使用，术语"产0-班巧酷高丝氨酸的微生物"可W指可W生产0-班巧酷高 丝氨酸并且在细胞内和细胞外储存它的微生物。
[0025] 生产0-班巧酷高丝氨酸的微生物包括原核和真核微生物菌株，例如，属于埃希氏 杆菌属、欧文氏菌属化rwinia)、沙雷氏菌属（Serratia)、普罗维登斯菌属（Providencia)、 棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物菌株，但不限于此。 具体而言，微生物可W是属于埃希氏杆菌属的微生物，例如，大肠杆菌化SCherichia coli)O
[0026] 可W使用生产心赖氨酸a-苏氨酸或心异亮氨酸的微生物菌株，和特别地使用产 k苏氨酸的菌株制备产0-班巧酷高丝氨酸的微生物。由于产心苏氨酸的菌株是能够合成k 苏氨酸和高丝氨酸作为0-班巧酷高丝氨酸的前体的菌株，因此大量的甲硫氨酸前体，即0-班巧酷高丝氨酸，可W使用该菌株合成。
[0027] 在本发明中，多肤的表达可W通过W可操作方式转化有包含编码该多肤的基因的 重组载体或者通过将编码该多肤的多核巧酸插入染色体实现，但是方法不限于此。
[0028] 如本文所使用，术语"转化"指的是如此过程:将包含编码祀蛋白的多核巧酸的载 体引入宿主细胞，从而使得由多核巧酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。对于转化的多核 巧酸而言，它是否插入宿主细胞的染色体并且位于其中或者位于染色体的外面是无所谓 的，只要它在宿主细胞中能够表达。多核巧酸可W W任何形式插入，只要它能够被引入宿主 细胞并在其中表达。例如，多核巧酸可W W表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包括 自主表达所需要的所有必需元件的多核巧酸构建体。表达盒可W常规地包括可操作地连接 至基因的开放阅读框（"0RF"，下文）的启动子、转录中止信号、核糖体结合结构域和翻译中 止信号。
[0029] 本发明中使用的启动子可W不被具体地限制，只要它可W W高频率起始在宿主细 胞中转录编码祀蛋白的多核巧酸，并且可W使用本领域中已知的任何启动子。特别地，可W 使用T7启动子、trc启动子、tac启动子和cysK启动子(韩国专利号10-0966324)，但是不限于 此。
[0030] 在本发明的示例性实施方式中，可W进一步缺失或减弱微生物中编码脫硫酸丫合 成酶的me巧基因。
[0031] 在本发明的示例性实施方式中，可W进一步缺失或减弱微生物中编码高丝氨酸激 酶的t虹B基因和编码高丝氨酸0-班巧酷转移酶的metA基因。
[0032] 在本发明中，基因的序列可W从数据库获得，比如美国国家生物技术信息中屯、 (NCBI)。
[0033] 如本文所使用，术语"缺失"指的是在染色体内从对应于起始密码子的核巧酸序列 到对应于终止密码子的核巧酸序列去除祀基因的核巧酸序列区域的一部分或全部的类型， 或者去除其调控区域的核巧酸序列区域的一部分或全部的类型。
[0034] 如本文所使用，术语"减弱"指的是去除或降低微生物菌株中由对应的DNA编码的 至少一种酶的细胞内活性。例如，可W通过修饰启动子区或基因的5'-UTR的核巧酸序列减 弱蛋白质的表达，或者可W通过在对应基因的ORF区中引入突变来减弱蛋白质的活性。
[0035] 在另一方面，本发明提供了生产0-班巧酷高丝氨酸的方法，包括在培养基中培养 上述微生物W生产0-班巧酷高丝氨酸，和从微生物或培养基中获得0-班巧酷高丝氨酸。
[0036] 培养上面制备的生产0-班巧酷高丝氨酸的微生物菌株可W根据本领域中已知的 适合的培养基或培养条件进行。培养方法可W容易地由本领域普通技术人员根据待选择的 菌株调节W便使用。特别地，培养可W是分批培养、连续培养和补料培养，但不限于此。例 女日，在参考文南犬（James M.Lee, ''Biochemical En 邑 ineerin 邑''，Prentice -