产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法
【专利说明】产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生 〇-乙酰高丝氨酸的方法
[0001] 本申请是申请号为201010144906. 2,申请日为2010年3月22日，发明名称为"产 生〇-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生〇-乙酰高丝氨酸的方法"的中国专利 申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 参考2009年8月28日提交的美国专利申请12/550, 121和2010年3月22日提 交的中国专利申请201010144906. 2,其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明涉及能够以高产量产生0-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属（Escherichia sp.)的菌株。另外，本发明还涉及利用所述菌株产生0-乙酰高丝氨酸的方法。
【背景技术】
[0005] 可以通过化学或生物学方式合成在动物饲料、食品和医药中使用的蛋氨酸。
[0006] 在化学合成途径中，蛋氨酸基本上是通过水解5-[2_甲基巯基乙基]乙内酰脲产 生的。然而，合成蛋氨酸的不利之处在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，这需要困难 的额外方法将它们彼此分开。为了解决该问题，本发明的发明人开发了用于选择性地合成 L-蛋氨酸的生物学方法，L-蛋氨酸是已有专利申请（W0 2008/103432)要求保护的化学物 质。该方法（简称为"两步法"）包括发酵产生L-蛋氨酸前体以及由L-蛋氨酸前体向L-蛋 氨酸的酶促转化。所述蛋氨酸前体优选包括〇-乙酰高丝氨酸和〇-琥珀酰高丝氨酸。就对 常规方法存在的问题的克服对所述两步法进行评价，所述常规方法存在的问题例如硫化物 的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反馈调控，以及胱硫醚γ合酶、0-琥珀酰高丝氨 酸硫化氢解酶和0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对中间产物的降解。另外，与产生DL-蛋氨酸 的常规化学合成法相比，所述两步法具有以下优点：仅对L-蛋氨酸具有选择性，并且伴随 产生作为有用副产物的有机酸，例如琥珀酸和乙酸。
[0007] 作为蛋氨酸生物合成途径中的中间产物，0-乙酰-高丝氨酸被用作产生蛋氨酸 的前体（W0 2008/013432)。如下式所示，在0-乙酰转移酶的协助下由L-高丝氨酸和乙 酰-CoA合成0-乙酰-高丝氨酸：
[0008] L-高丝氨酸+乙酰-CoA - 0-乙酰-高丝氨酸。
[0009] 在本申请的受让人的美国专利申请第12/062835号中公开了其中引入了负责天 冬氨酸激酶活性和高丝氨酸脱氢酶活性的thrA基因和编码高丝氨酸乙酰转移酶的源自奇 球菌（Deinococcus)的metX基因从而分别提高L-高丝氨酸和0-乙酰高丝氨酸的生物合 成的微生物株，和利用所述微生物株高产量地产生0-乙酰高丝氨酸的方法。
[0010] 关于这一点，本发明的发明人认为增强负责高丝氨酸生物合成途径中催化反应的 其他三种酶能够以更高于US12/062835所述方法的产量产生0-乙酰高丝氨酸，其中所述其 他三种酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、天冬氨酸氨基转移酶（aspC)和天冬氨酸半醛 脱氢酶（asd)。
[0011] 与根据本发明的共同增强（concomitant enhancement)参与从磷酸稀醇式丙酮酸 到〇-乙酰高丝氨酸的转化的一系列酶类似，已经尝试通过同时表达在由天冬氨酸衍生的 L-氨基酸（例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-蛋氨酸）的生物合成中发挥重要作用的酶来提 高L-氨基酸的产量。
[0012] EP00900872涉及在大肠杆菌（Escherichia coli)中有效地产生L-赖氨酸， 其特征在于提高参与赖氨酸生物合成的一系列酶的活性，所述酶包括二氢吡啶二羧酸合 酶（dapA)、天冬氨酸激酶（IysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶（dapB)、二氨基庚二酸脱氢酶 (ddh)、四氢吡啶二羧酸瑭泊酰酶（tetrahydropicolinate succinylase，（^。0)、瑭泊酰二 氨基庚二酸脱酰酶（succinyl diaminopimelate diacylase，lysE)、天冬氨酸半醛脱氢酶 (asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)。日本专利第JP2006-520460和JP2000-244921号 公开了通过提高天冬氨酸半醛脱氢酶（asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、天冬氨酸激 酶（thrA)、高丝氨酸脱氢酶（thrA)、高丝氨酸激酶（thrB)和苏氨酸合酶（thrC)的活性从 而在大肠杆菌中有效产生L-苏氨酸。另外，WO 2007/012078公开了能够产生水平增加的 L-蛋氨酸的棒杆菌（Corynebacterium)重组菌株，其中编码天冬氨酸激酶（IysC)、高丝氨 酸脱氢酶（hom)、高丝氨酸乙酰转移酶（metX)、0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶（metY)、胱硫 醚γ合酶（metB)、维生素 B12依赖性甲基转移酶（metH)、维生素 B12非依赖性蛋氨酸合酶 (metE)、甲基四氢叶酸还原酶（metF)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶（zwf)的基因的表达水平提 高，而编码蛋氨酸阻遏物蛋白（mcbR)、高丝氨酸激酶（hsk)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（metK) 和苏氨酸脱氢酶（IivA)的基因的表达水平降低。
[0013] 所有这些专利均涉及有效产生天冬氨酸衍生的L-氨基酸，即分别为L-丝氨酸、 L-苏氨酸和L-蛋氨酸，特征在于应用依赖于各自产物的基因组合。
[0014] 在本发明中，经过设计使负责0-乙酰高丝氨酸生物合成途径中从磷酸烯醇式丙 酮酸到0-乙酰高丝氨酸的催化步骤中的一系列酶的表达水平提高，从而以较高的产量产 生0-乙酰高丝氨酸，这在之前的文献中并没有提及。另外，由于终产物不同，本发明中应用 的酶组合不同于用于产生天冬氨酸衍生的L-氨基酸（例如L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-蛋 氨酸）的酶组合。
[0015] 为实现本发明，本发明的发明人对以最大产量产生0-乙酰高丝氨酸进行了广泛 而深入的研宄，结果发现共同增强微生物株中基因组DNA和/或质粒形式的编码天冬氨酸 激酶和高丝氨酸脱氢酶（thrA)以及高丝氨酸乙酰转移酶（metX)的基因，和编码选自磷酸 稀醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、天冬氨酸氨基转移酶（aspC)和天冬氨酸半醛脱氢酶（asd)的 至少一种酶的基因可以使〇-乙酰高丝氨酸的产量显著增加。
【发明内容】
[0016] 因此，本发明的目的是提供能够以高产量产生0-乙酰高丝氨酸的微生物株，其经 过设计以增强负责参与从磷酸烯醇式丙酮酸到O-乙酰高丝氨酸的高丝氨酸生物合成途径 的酶的一系列基因。
[0017] 本发明的另一个目的是提供利用所述微生物株以高产量产生0-乙酰高丝氨酸的 方法。
[0018] 根据本发明的一个方面，提供能够以高产量产生ο-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属 的菌株，其中在所述菌株中引入以下酶并增强其活性：(a)高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸 激酶和高丝氨酸脱氢酶；和（b)选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和 天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组的至少一种酶。
[0019] 根据本发明的另一方面，提供在培养基中产生0-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法 包括在所述培养基中发酵菌株。
[0020] 根据本发明的再一方面，提供产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括：（a)发 酵所述菌株从而产生〇-乙酰高丝氨酸；(b)分离0-乙酰高丝氨酸；和（C)在选自由胱硫醚 γ合酶、0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和0-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶组成的组的酶存在 下，将0-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸（acetate)。
[0021] 因此，根据本发明，可以通过发酵埃希氏菌属的菌株以高产量产生0-乙酰高 丝氨酸，其中所述菌株以染色体DNA和/或质粒的形式含有负责从磷酸烯醇式丙酮酸 到0-乙酰高丝氨酸的生物合成途径的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶（thrA)、高丝氨 酸乙酰转移酶（metX)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、天冬氨酸氨基转移酶（aspC)和 天冬氨酸半醛脱氢酶（asd)的所有六种基因。此外，根据本发明的发明人提交的发明名 称为''Microorganism producing L-methionine precursor and method of producing L-methionine and organic acid from the L-methionine precursor"的 W02008/013432 中的公开，由本发明的菌株产生的0-乙酰-L-高丝氨酸可以被高产量地转化为L-蛋氨酸。 本发明涉及的生物保藏信息如下： 大肠杆菌CJM-X，其于2008年1月23日保藏在位于韩国首尔西大门区弘济I洞儒林 大厦的韩国微生物保藏中心（Korean Culture of Microorganism，简称KCCM)，保藏编号为 KCCM10921P ； 大肠杆菌CJM2-X，其于2008年2月12日保藏在位于韩国首尔西大门区弘济I洞儒林 大厦的韩国微生物保藏中心，保藏编号为KCCM10925P ; 大肠杆菌CA05-0567,其于2009年8月11日保藏在位于韩国首尔西大门区弘济I洞儒 林大厦的韩国微生物保藏中心，保藏编号为KCCMl 1025P。
【附图说明】
[0022] 参考以下详细说明并结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特 点和优点，在附图中：
[0023] 图1为显示本发明菌株的0-乙酰高丝氨酸生物合成途径的示意图；
[0024] 图2为显示用于染色体整合的pSG_2ppc载体的遗传图和构建的示意图；
[0025] 图3为显示用于染色体整合的pSG_2aspC载体的遗传图和构建的示意图；
[0026] 图4为显示用于染色体整合的pSG_2asd载体的遗传图和构建的示意图；
[0027] 图5为显示表达载体pCJ-thrA(M)-metX_CL的遗传图和构建的示意图。
【具体实施方式】
[0028] 根据本发明的一个方面，本发明涉及能够以高产量产生0-乙酰高丝氨酸的埃希 氏菌属菌株，在所述菌株中引入以下酶并增强其活性：(a)高丝氨酸乙酰转移酶、天冬氨酸 激酶和高丝氨酸脱氢酶；和（b)选自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和 天冬氨酸半醛脱氢酶组成的组的至少一种酶。
[0029] 本文使用的术语"L-蛋氨酸前体"旨在表示在蛋氨酸生物合