一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌群体感应抑制物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌群体感应抑制物的技术，该方法同样也适用于A1-1等长、短链N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)的群体感应分子抑制物的筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5a F’、XL1-Blue等，涉及的载体为可感应QS分子导致细菌发光的载体，例如pSB536、pJBA130、pREC-FF等。属于病原微生物预防与控制领域。
【背景技术】
[0002]当前病原细菌的耐药形势非常严峻，单纯的药物-靶点模式的抗生素研发从长远看无法解决细菌迅速突变导致耐药的问题，因此，一些以细菌特有生理功能为靶点的新型抑菌药物正引起研究人员的广泛关注。例如消除细菌生物膜生成、抑制细菌群体感应以及抗体靶向抑制耐药菌的策略，为新型药物开发提供了新的思路。
[0003]细菌的群体感应(QS，quorum sensing)是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质(又称为自诱导物，AI，autoinducer)分为以下4类:一类信号分子为A1-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)及其衍生物，广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程;第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物A1-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP(Autoinducing peptide)以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统(A1-3)信号分子。
[0004]为了检测QS分子，目前研发了多种检测不同类型QS分子的报告菌株(Quorumsensing b1sensors)。例如大肠杆菌的pSB536质粒上带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI ’和生物发光基因luxCDABE，当添加入短链AHLs分子后，AhyR蛋白感应QS分子，激活ahyl ’启动子，从而启动LuxCDABE蛋白，使细菌生物发光。
[0005]由于QS在细菌的生命活动中所起的重要作用，抑制细菌群体感应并不影响细菌的生长，但却可以减少生物膜的生成、影响细菌毒素的分泌并且很难产生耐药性，因此，开发针对QS相关基因或者其分泌的信号小分子物质的抑制物，称之为群体感应抑制剂(QSI，quorum sensing inhibitor)或者群体感应淬灭(QQ，quorum quenching)，是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物来源，成为当前药物开发研究的热点。
【发明内容】
[0006]关于群体感应抑制剂(QSI分子)的筛选，目前主要集中在对AHLs和A1-2的抑制上。QSI的来源可以大致分为4种，一种是从环境中提取的天然QSI分子。例如从海洋红藻Delisea pulchra、海洋珊瑚Eunicea knight1、大蒜等天然物质中提取的AHLs和呋喃酮类物质;一种是根据信号分子的结构，人工设计和合成其相似结构分子，以达到与QS分子竞争底物但又不激活活性的目的；还有一种是利用表达QS分子降解酶的方法;此外，还有利用QS筛选特异抗体或者适体的方法。以上四种是当前获得QSI的主要来源，但是都存在一些问题:植物等来源的样品成份复杂，QSI前期的提取、鉴定和纯化过程繁琐而且还受到样品纯度与温度、地域等不确定因素的限制；人工设计合成与抗体筛选不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题。
[0007]这些问题制约着QSI分子筛选的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效QSI分子的新方法。因此，本发明所要解决的技术问题是:建立一种简单、快速地筛选抑制不同类型QS分子特异性多肽的技术。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
在本专利项目中，申请者将噬菌体展示随机肽库与QS感应菌株相结合的方法来筛选QSI分子。噬菌体展示随机肽库(Phage display)，是将一段长度大约为15-36 bp的随机核苷酸序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上，7个随机氨基酸序列可产生约207种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合革E物质的多肽。该技术一般采用生物淘选(B1panning)的方法来筛选抗原表位，其基本技术流程大致为:将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。但由于本专利研究的靶物质是N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物质，很难直接包被在平板上进行富集，因此本专利中采用一个与传统生物淘选方法完全不同的特异多肽筛选策略。主要原理是如图2所示:QS生物发光感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，在添加入相应抗生素、特异QS分子和X-gal诱导孵育平板长菌。在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；荧光照射下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制生物发光基因启动子的表达而发生GFP荧光或者生物发光，而非特异多肽则发光。然后将候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。
[0009]本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的:如图3所示，本发明公开了一个利用M13噬菌体展示随机肽库筛选QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感应载体pSB536为例，利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB536的大肠杆菌ER2738，然后在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、X-gal的平皿中筛选出可见光下显蓝色、激发光下不发或者发弱生物荧光的细菌克隆。然后将该噬菌体扩增，添加上述物质的平板中划线培养，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。
[0010]具体方法包括如下:
pSB536质粒由诺丁汉大学Matthew Fletcher教授馈赠而来并于本实验室保存，热激转化于大肠杆菌ER2738感受态细胞中，验证后保存并命名为ER536。
[0011 ] (I)将QS分子C4-AHL感应质粒PSB536转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得ER536菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到到5 ml添加有20 yg/mL四环素和100 pg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 0C,250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期并以1:10000稀释于液体LB培养基中待用；
(2)将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10nL稀释到990 HL无菌水中，再分别将步骤⑴中待用的200 UL菌液与10 UL噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min;吸取上述所有预混液加入3 mL、45 °C温浴已融化的含有0.7 wt.%琼脂粉的上