一种筛选n-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)模拟物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)多肽模拟物的技术，该方法同样也适用于各种类型长、短链AHLs的多肽模拟物筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F ’细菌，例如ER2738、DH5a F’、XLl_Blue等，涉及的载体为感应QS分子诱导细菌携带耐药抗性基因的载体PSB538。属于病原微生物预防与控制领域。
【背景技术】
[0002]随着细菌耐药的形势日益严峻，替代抗生素的新型抑菌技术和策略的研究和开发迫在眉睫。其中，通过免疫细菌群体感应(QS, quorum sensing)效应分子来提高宿主抗菌能力是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略。细菌的群体感应是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质(又称为自诱导物，Al，autoinducer)分为以下4类:一类信号分子为A1-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)及其衍生物，广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机理的研究相对比较透彻= AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数(只有C7—个奇数)，从C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程;第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物A1-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报道A1-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP(Autoinducing peptide)以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统(A1-3)信号分子。
[0003]研究发现，AHLs分子具有免疫保护作用。1998年，Tateda等人发现，3-OXO-C12_HSL分子可以刺激宿主增加IgG和IgE浓度并提高免疫保护力。此后，研究人员陆续发现该分子还可以刺激IL-8表达，提高中性细胞数目和噬菌细胞活性，并介导炎症发生，提示AHLs可能作为潜在的疫苗候选物。2006年，Miyairi等人将3-OXO-C12-HSL偶联BSA制备成半抗原后免疫小鼠，结果发现小鼠感染铜绿假单胞菌的存活率得到显著提高，进一步证实了AHLs分子作为疫苗候选物的可能性。
[0004]本专利中运用到QS分子或者QS抑制剂感应菌株。目前研发了多种检测不同类型AHLs分子及其抑制物的报告菌株(Quorum sensing b1sensors)，其原理是通过感应到外源添加的QS分子，从而诱导系统启动发光或者自杀基因，从而达到筛选的目的。例如大肠杆菌的PSB536质粒上带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和生物发光基因lux⑶ABE，当添加入短链AHLs分子后，AhyR蛋白感应QS分子，激活AhyI’启动子，从而启动Lux⑶ABE蛋白，使细菌生物发光。又如大肠杆菌的QSISl系统，pTBR2iB载体携带费氏弧菌的luxRI’和QS分子激活启动的自杀基因phlA。在添加入相应QS分子和候选QS抑制物后，细菌只在能抑制QS分子启动自杀基因的QS抑制物培养基中存活，从而筛选到QS抑制物。
[0005]本专利中运用到的另一个技术是■菌体展示随机肽库(Phagedisplay)技术，它是将一段长度大约为15_36bp的随机核苷酸序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上，7个随机氨基酸序列可产生约207种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶物质的多肽。该技术一般采用生物淘选(B1panning)的方法来筛选抗原表位，其常规技术流程大致为:将革E蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。
【发明内容】
[0006]虽然AHLs分子可以作为疫苗候选物，但是该化合物或者其衍生物是一类脂类的小分子物质，前期的提取、鉴定和纯化过程复杂，而且人工设计合成不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题，导致该分子及其衍生物价格昂贵，目前无法大量纯化生产并应用于宿主疫苗，只在科研实验范围内运用。这些问题制约着AHLs分子及其模拟物的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效AHLs分子或者具有其相似功能的模拟物分子的新方法。因此，本研究所要解决的技术问题是:如何筛选出价格便宜，宿主免疫保护效果显著的AHLs分子类似物。本发明的主要目的是:建立一种简单、快速地筛选AHLs分子类似物的技术。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
本研究专利基于多肽适体与小分子物质结合靶蛋白相同位点，可触发相同生物学效应的假说，利用随机肽库可模拟AHLs分子效应空间结构的原理。其主要原理如图2所示:首先构建一个可以感应外源添加的特定AHLs分子，诱导抗生素抗性，从而在抗生素筛选平板中存活的质粒系统。然后携带有该质粒的细菌与噬菌体随机肽库孵育侵染，在不添加特定AHLs分子的平板中孵育。在利用抗生素抗性的质粒系统中，不能诱导产生抗生素抗性的非特异噬菌体感染的细菌，不能在添加抗生素的平板中存活，而能表达与QS分子相同效应的特异噬菌体，因能形成与QS分子类似功能结构而诱导抗生素抗性表达，从而使细菌在抗生素平板中存活。然后将目的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的AHLs分子模拟物多肽。
[0008]本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的:本发明公开了一种利用M13噬菌体展示随机肽库筛选AHLs分子模拟多肽的方法。以QS分子-C4-AHL感应诱导抗性载体PSB538为例，如图1所示，该质粒由QS感应菌株pSB536(SM0N SWIFT et，1997)为实验室保存。带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4-AHL分子或者其模拟多肽时，激活Ahyl’启动子，诱导抗性基因表达。在添加氨苄抗生素的培养基中培养，只有添加C4-AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活。主要原理如图3所示，利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出可见光下显蓝色，且12小时孵育后能正常生长的噬菌斑。然后将该噬菌体扩增，加入带有PSB536的QS感应菌株中，通过C4-AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列。本专利的方法不只限于利用抗生素抗性和生物发光来筛选特异噬菌体感染克隆，诱导GFP等发光报告系统的细菌，都可适用。
[0009]所述方法具体为:
(1)将含有QS信号分子C4-AHL感应抗生素抗性质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株;从划线平板中分别挑取单菌落ER2738接种至5 ml添加有20 yg/mL四环素和100 pg/mL氨节青霉素的LB培养基中，37 0C,250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期，含pSB538质粒菌收集I mL菌体后重悬于200