一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌群体感应抑制物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌群体感应抑制物的技术，该方法同样也适用于长、短链N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)的群体感应分子抑制物的筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5a F’ ,XLl-Blue，涉及的载体为加入QS分子可导致自身基因诱导细菌死亡的载体pSB537。属于病原微生物预防与控制领域。
【背景技术】
[0002]细菌耐药的形势严峻，如何提高新药研发速度，抑制或杀死病原菌的要求迫在眉睫。目前新药的开发主要有几种方法:一是传统的经典方法，即从自然环境例如土壤或者植物中筛选天然抗生素或者抗菌物质。但筛选天然抗菌物质的方法存在着过程繁琐，工作量大等问题，需要在筛选规模与通量上得到质的提高;二是人工合成或者半合成的抗生素，通过修改一些化学修饰改变化合物结构，提高药效。但由于同类合成的抗生素都具有类似化学结构和作用机理，因此容易对同类耐药细菌产生抗性;三、近十几年来在国际知名药物公司和科研机构中发展十分迅速的高通量药物筛选技术，使新药的大规模筛选、靶点确认、自动化以及效价评估成为可能。同时，该技术也面临着筛选模型与数据库有限的技术难题;除上述几种抑菌方法以外，还有一些利用细菌特殊生理功能以及重要靶点的新型抑菌药物正在研究开发。例如消除细菌生物膜生成、抑制细菌群体感应以及抗体靶向抑制耐药菌的策略。这些方法为新型药物开发提供了新的思路，有待于进一步研究。
[0003]细菌的群体感应(QS，quorum sensing)是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质(又称为自诱导物，AI，autoinducer)分为以下4类:一类信号分子为A1-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)及其衍生物，广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机理的研究相对比较透彻:AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数(只有C7—个奇数)，从C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。如图1所示，以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程;第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物A1-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报道A1-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP(Autoinducing peptide)以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统(A1-3)信号分子。
[0004]由于QS在细菌的生命活动中所起的重要作用，抑制细菌群体感应并不影响细菌的生长，但却可以减少生物膜的生成、影响细菌毒素的分泌并且很难产生耐药性，因此，开发针对QS相关基因或者其分泌的信号小分子物质的抑制物，称之为群体感应抑制剂(QSI，quorum sensing inhibitor)或者群体感应淬灭(QQ，quorum quenching)，是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物来源，成为当前药物开发研究的热点。
【发明内容】
[0005]
关于QSI分子的筛选，目前主要集中在对AHLs和A1-2的抑制上。QSI的来源可以大致分为4种，一种是从环境中提取的天然QSI分子。例如从海洋红藻DeIisea pulchra、海洋珊瑚Eunicea knight1、大蒜等天然物质中提取的AHLs和呋喃酮类物质;一种是根据信号分子的结构，人工设计和合成其相似结构分子，以达到与QS分子竞争底物但又不激活活性的目的；还有一种是利用表达QS分子降解酶的方法;此外，还有利用QS筛选特异抗体或者适体的方法。以上四种是当前获得QSI的主要来源，但是都存在一些问题:植物等来源的样品成份复杂，QSI前期的提取、鉴定和纯化过程繁琐而且还受到样品纯度与温度、地域等不确定因素的限制;人工设计合成与抗体筛选不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题。
[0006]这些问题制约着QSI分子筛选的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效QSI分子的新方法。因此，本发明所要解决的技术问题是:建立一种简单、快速地筛选抑制不同类型QS分子特异性多肽的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
将噬菌体展示随机肽库与QS自杀感应菌株相结合的方法来筛选QSI分子。噬菌体展示随机肽库(Phage display)，是将一段长度大约为15-36 bp的随机核苷酸序列插入■菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上，7个随机氨基酸序列可产生约207种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶物质的多肽。该技术一般采用生物淘选(B1panning)的方法来筛选抗原表位，其基本技术流程大致为:将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。但由于本专利研究的靶物质是N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物质，很难直接包被在平板上进行富集，因此本专利中采用一个与传统生物淘选方法完全不同的特异多肽筛选策略。主要原理是如图2所示:感应到QS分子将致死的感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，在添加入相应抗生素、特异QS信号分子、致死条件诱导剂和IPTG/X-gal诱导孵育平板长菌。在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色;在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活。而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死。然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。
[0008]本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的:如图2所示，本发明公开了一个利用M13噬菌体展示随机肽库筛选QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感应致死载体PSB537为例，如图2所示，该质粒带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和条件致死基因SacB，AhyR蛋白感应C4-AHL分子，激活AhyI ’启动子，诱导细菌表达SacB蛋白。在添加自杀诱导物20%蔗糖后，可导致细菌死亡，只有添加或者产生QSI分子才能使细胞存活。然后利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB537的F’大肠杆菌，在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、20%蔗糖和IPTG/X-gal的平皿中筛选出在可见光下显蓝色、12小时孵育后能正常生长的噬菌斑。然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。需要指出的是，目前已经有利用自杀基因SacB或者PhlA来筛选QSI的载体，例如QSISl和QSIS213，因此本专利重点描述的是利用噬菌体展示技术与QS感应自杀载体结合的技术。
[0009]所述方法具体包括如下:
(1)将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到5 ml添加有20 yg/mL四环素和100 yg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 0C,250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期并收集I mL菌体后重悬于200 yL LB培养基中待用；
(2)将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10yL稀释到90此无菌水中，再分别将步骤(I)中待用重悬后的200yL菌液与10 yL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀