mH1、EcoRI替换成致死基因序列SacB，经测序及功能验证后保存于-20 °C备用，命名为pSB537;同时将噬菌体环7肽库试剂盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化钙法制备感受态(参考分子克隆实验指南第四版)；然后取出核酸含量为100 ng的pSB537质粒运用热激转化法将该质粒转导入所制备的ER2738感受态中。以上该步骤的实施，有效的提高了本实验筛选的过程中噬菌体对宿主菌侵染能力，故将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒pSB537转导入大肠杆菌ER2738菌株尤为必要。从划线平板中挑取单菌落ER2738接种至5ml含有终浓度为20 yg/mL四环素和100 yg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中37 0C,250 rpm振荡过夜;翌日，取过夜菌以1: 200转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期并收集I mL菌体后重悬于200 yL LB培养基中待用； (2)然后，将噬菌体C7C环肽文库(NEB公司)放置冰上化冻，取出10yL稀释至90 yL无菌水中，再分别将步骤(I)稀释后待用的200此菌液与该稀释后10此的噬菌体肽库轻轻混匀，置于室温条件下孵育2-5 min;接着吸取上述预混液加入45 °G温浴已融化的含有10-30wt.%鹿糖、0.7 wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基，迅速充分混勾并倾倒至含有终浓度为20 pg/mL 四环素、100 yg/mL 氨节青霉素、20 wt.% 鹿糖和10 μΜ C4_AHL、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-gal下层固体LB培琼脂培养基平板上；除以上实验组之外，还设置了一组不添加信号分子的对照组，等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 °e培养箱中静置培养14 h;
(3)翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落以及对照未显蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37 0C,250 rpm振条件下，培养5 h；
(4)此后，将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含QS信号分子C4-AHL感应质粒PSB536菌株过夜活化后以体积比1:100转接到LB培养基中200 rpm 3 h，再将其以1:100稀释于LB培养基中并添加终浓度为10 μΜ的C4-AHL混匀后，以每孔200 yL体积量添加于96孔黑色微孔板中，再外源添加筛选出阳性结果的上清10此为实验组，并以不含信号分子为阴性对照以及含有信号分子为阳性对照，每组设三个重复;将上清液加入96孔黑色微孔板充分混匀后于37 °C培养箱，静置过夜培养。
[0024](5)最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10 min。结果如图5所示，不含外源添加物和添加随机序列的噬菌体上清的阳性对照发光强度和490 nm吸收光值最强，其他挑选的peptide 2_5上清与不添加信号分子的阴性对照一样不发光。最终，将这些验证后目的噬菌斑扩增后失活，送至北京金唯智测序公司测序，以进行进一步生物验证分析。
[0025]综上所述，利用QS感应自杀菌株可以被QSI抑制拯救的特性，结合噬菌体随机文库展示技术进行QSI的筛选，解决传统噬菌体文库展示方法中，小分子物质化学结构复杂，难以固定的难题，可以迅速、大规模地筛选针对各种不同类型QS分子的QSI;同时，根据QSI多肽的空间结构，可以为研究与QS分子相互作用的天然蛋白三维构象预测提供参考依据。因此，本专利具有理论与实际运用的多重优点。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于:所述方法为:感应到QS分子将致死的感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，再添加入相应抗生素、特异QS分子、致死条件诱导剂和IPTG/X-gal诱导孵育平板长菌，在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色;在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活;而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死;然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。2.根据权利要求1所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于:所述方法具体包括如下: (1)将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到5 ml添加有20 yg/mL四环素和100 pg/mL氨节青霉素的LB培养基中，37 0C,250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期并收集I mL菌体后重悬于200 pL LB培养基中待用； (2)将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10nL稀释到90 HL无菌水中，再分别将步骤(I)中待用重悬后的200 HL菌液与10 HL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5min;吸取上述所有预混液加入3 mL、45 °G温浴已融化的含有10-30 wt.%蔗糖、0.7 wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20 pg/mL四环素、100 pg/mL 氨苄青霉素、10 μΜ C4-AHL、10-30 wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-gal LB培养基平板上;待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37°?咅养箱中静置培养12-16 h; (3)翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37 0C,250rpm振条件下，培养4-5 h； (4)然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活化后，按2 %接种量转接至LB培养基中培养3 h，再以体积比1:100稀释于LB培养基后添加终浓度为10 μΜ C4-AHL信号分子待用，最后以每孔200 yL体积量添加于96孔黑色微孔板中，并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10 UL加入到96孔黑色微孔板，充分混匀后于37 °(:多孔道酶标仪中，在0D490 nm波长下每小时监测一次，共监测12-16 h; (5)利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10 min;根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活后送测序。3.根据权利要求2所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于:所述的IPTG/X-gal LB培养基制备方法为:称取1.25 g IPTG.l g Χ-gal溶于25mL 二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，pH= 7.4-7.6,1000 mL。4.根据权利要求2所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于:所述质粒为PSB537，其制备方法为，将含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE替换成致死基因序列SacB，经测序及功能验证后保存于-20 °C备用，发光基因序列LuxCDABE序列如SEQ ID N0.1所示致 死基因序列SacB序列如SEQ ID N0.2所不。
【专利摘要】本发明提供一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活；而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死；然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。
【IPC分类】C07K1/04
【公开号】CN105504002
【申请号】CN201610039619
【发明人】林向民, 姚祖杰, 林文雄
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月21日