专利名称：细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用。
背景技术：
细菌作为单细胞生物除了能够独立生存和繁殖以外，在漫长的进化历史中逐渐发 展出不同个体、甚至不同种群间的信号交流途径。这种交流依赖于细菌自身分泌的小分 子信号物质，如N-酰基-L-高丝氨酸内酯(N-acyl-L-homoserine lactones, AHLs)、寡肽 分子(autoinducing polypepitides, AIP)、口夫口南酉先硼酸二酉旨(Furanosylboratediester， AI-2)等，其中研究最为深入的是AHLs类信号分子。细菌通过感知环境中此类信号分子 的浓度，判断细菌群体密度的大小，从而启动或关闭相关基因的表达来适应环境的变化， 这种细菌群体间的调控方式被称作群体感应(quorum sensing, QS) (Fuqua，C.，Parsek， Μ· R. & Greenberg, Ε· P. (2001). Regulation of gene expression by cell-to-cell communication :acyl_homoserine lactone quorum sensing.Annu Rev Genet. 35, 439-468.)。该调控系统是近年来倍受研究者重视的细菌学研究热点之一。利用AHLs作为信号分子的群体感应系统调控着细菌许多重要生物学功能的执 行，例如毒性基因的表达，细菌的群游，生物膜的形成，抗生素的合成，生物发光，固氮基 因的表达，Ti质粒的接合转移等。已知受QS调控的细菌表现型多与细菌和其寄主的互 作有关，尤其是在动物和植物病原细菌与其寄主的互作中，QS系统常常控制病原细菌致 病性相关性状的表达，如人类机会病原菌铜绿假单胞(Pseudomonasaeruginosa)的致病 性受两套QS系统的调控，Las系统产生信号分子N-3-0XO-C12-HSL，调控毒力因子lasB、 IasA和toxA的表达；Rhl系统产生信号分子C4-HSL，该系统调控rhlAB的表达。小鼠肺 炎模型试验表明，缺失IasR后P. aeruginosa的毒力明显下降(Tang，H. B.，E. DiMango, R. Bryan,M. Gambello,B. H. Iglewski,J. B. Goldberg,and A. Prince (1996)Contribution of specific Pseudomonas aeruginosa virulence factors to pathogenesis of pneumonia in a neonatal mouse model of infection. Infect. Immun. 64 :37_43)。在同一个模 型试验中，同时还对IasI突变、rhll突变和IasI rhll双突变进行分析，都表现毒力明 显下降(Pearson, J. P. , Μ· Feldman, B. H. Iglewski, and Α. Prince(2000)Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signaling is required for virulence in a model of acute pulmonary infection. Infect. Immun. 68 :4331_4334.)。在导致植物病害的病原细菌中， 根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中导致寄主植物根瘤的致病表现型Ti质粒 的接合转移；胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)、玉米欧氏菌(E. stewartii)、 菊欧氏菌(E. chrysanthem)禾口番爺青枯菌(Ralstonia solanacearum)中导致寄主病害 的毒力基因表达的诱导(见综述 Pierson III L. S. , Wood D. W. , Pierson Ε. Α. 1998. Homoserine lactone-mediated generegulation in plant-associated bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36 207-225 ；Melissa, B. Miller and Bonnie L. Bassler(2001)Quorum sensing in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 55 165-199)。因此在这些病害系统 中QS与植物病害的发生密切相关。胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种E.carotovora subsp. carotovora(Ecc)能够引起马铃薯、甘蓝、蕃茄、辣椒、胡萝卜、芹菜、洋葱、花椰菜 等许多植物的软腐病。其侵染寄主植物时合成和分泌能够降解植物细胞壁的水解酶，如 果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶等，瓦解植物组织结构，进而汲取养分支持其自身的生 长和繁殖，导致病害症状产生。研究表明，启动Ecc编码这些胞外酶基因的关键信号分子 是由其QS系统的AHLs类信号分子合成基因CarI合成的N-3-羰基己酸高丝氨酸内酯 (N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxo-C6-HSL)。 Ν_3_οχο_〇6_Η2 白勺浓度 随病原菌群体密度增高，当达到一定阈值时，N-3-oxo-C6-HSL与LuxR家族转录激活蛋白 结合，启动致病因子的表达。如果将合成AHL信号的基因CarI失活，突变体则不能在马 铃薯和烟草上引起病害，但是加入外源N-3-OXO-C6-HSL后，突变株的致病力随即得到恢 复(Jones, S. , Yu, B. , Bainton, N. J. , Birdsall, Μ. , Bycroft, B. W. , Chhabra, S. R. , Cox, Α. J. , Golby, P. , Reeves,P. J. and other authors (1993).The lux autoinducerregulates the production of exoenzyme virulence determinants in Erwinia carotovoraand Pseudomonas aeruginosa. EMBO J. 12 :2477_2482 ；Barnard, A. M. L. , Bowden, S.D. , Burr, Τ. , Coulthurst, S. J. , Monson, R. E. & Salmond, G. P. C. (2007). Quorum sensing, virulence and secondary metabolite production in plant soft-rotting bacteria. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 362:1165-1183.)。不同动植物病原细菌中QS调控致病性基因表达的机制相似，达到特定的AHLs浓 度是引发病原菌表达致病因子的关键。因此，AHLs信号分子可能成为防治动植物细菌病害 的新靶点，从而开辟一条防治细菌病害的新途径。自然界中通过长期的进化，有些生物已经 进化出破坏病原细菌QS系统的功能。这种干扰作用主要表现在产生降解酶破坏AHLs信号 分子，以降低信号分子在环境中的浓度。许多原核和真核生物都可以产生QS信号分子降解酶，不同的微生物所产生的QS 信号分子降解酶在结构和作用机制上也不同。其中首先报道的是从芽孢杆菌(Bacillus sp. )240B1中克隆得到的aiiA基因所编码一种AHL内酯水解酶(AHL-Iactonase)，AiiA能 够降解多种 AHLs 类的信号分子(Dong, Y. H.，Xu, J. L.，Li，Χ. Z.，and Zhang, L. H. (2000) AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci USA 97(7) 3526-3531.)；将该基因转入烟草和马铃薯可以提高植株的抗病性，证明利用 信号分子降解酶干扰病原菌的QS系统可能成为防治细菌病害的新方法。目前发现的QS系 统信号分子降解酶从作用机制上可以分为两类酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-lactonase)和 酰基高丝氨酸酰基转移酶(AHL-acylase)，它们分别水解AHLs信号分子保守结构中的内酯 环和酰胺键，破坏信号分子，从而干扰QS系统的功能(Wang，L. H，L. X. ffeng, Y. H. Dong, and L.H.Zhang· (2004)Specificity and enzyme kinetics of the quorum-quenching N-Acyl homoserine lactone lactonase(AHL-lactonase). J. Biol. Chem. 279 :13645-13651.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌群体感应信号降解酶。
本发明提供的细菌群体感应信号降解酶，命名为AidH，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与具有内酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。序列表2为细菌群体感应信号降解酶的氨基酸序列，包括271个氨基酸，在该蛋白 序列中，疏水氨基酸占117个，亲水氨基酸占144个，碱性氨基酸占33个，酸性氨基水占41 个，该蛋白质的分子量为29. 5KD，等电点为4. 64，属于α/β水解酶。该蛋白质是国际上未 曾报道的新蛋白质。为了使1)中的AidH便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
权利要求
一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的核苷酸 序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的 核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的自5'末端第7-819位核苷酸序列具有90%以上的同源性 且编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.一种表达权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求2或3所述基因通过表达载体 pET-22b(+)导入大肠杆菌得到重组大肠杆菌，表达得到权利要求1所述蛋白。
6.权利要求1所述蛋白作为内酯酶的应用。
7.权利要求1所述蛋白在降解N-酰基、-高丝氨酸内酯中的应用。
8.权利要求2或3所述基因在培育抗病转基因植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述抗病转基因植物为抗细菌性病害转 基因植物；所述细菌性病害是致病性与群体感应相关的细菌性病害。
10.权利要求1所述的蛋白或其编码基因在制备细菌性病害的治疗药物中的应用，所 述细菌性病害是致病性与群体感应相关的人或动物或植物的细菌性病害。
全文摘要
本发明公开了一种细菌群体感应信号降解酶及其编码基因与应用。所述降解酶是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与动植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的降解酶可以作为内酯酶，降解细菌群体感应信号N-酰基-L-高丝氨酸内酯，破坏由群体感应系统调控的细菌致病性的表达，从而达到预防和治疗动植物细菌性病害的目的。
文档编号A61K38/46GK101935640SQ20091008831
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者张力群, 梅桂英 申请人:中国农业大学