专利名称：作为铁传递氧化抑制剂的新的铁螯合剂的制作方法
技术领域：
本发明部分地由NIH Grant AI-33790和NIH Grant HL-48177的政府支持而作出。
本发明涉及以前未鉴定的高亲合性，铁-结合系列化合物的化学结构，它被以前的研究者称作为外螯素(exochelins)，它是由分支杆菌释放的。本发明也涉及修饰这些新的鉴定了的化合物以改变其生理性质以及这些新鉴定的和修饰的化合物的应用。
在急性心肌梗塞中，心脏组织被两个连续的事件，局部缺血期中的氧不足和在再灌注期中的氧化损伤所损害。在局部缺血期中损伤的心肌可通过往局部缺血区再导入血液而抢救。然而，作为在再灌注组织中，由白细胞迁移到组织中以及产生活泼的氧引起的炎症应答的结果，再灌注可导致损伤。最活泼的种类之一是羟基(·OH)，它在铁存在下产生并导致细胞死亡。防止(·OH)的形成将防止由此引起的致死细胞损害。已知(·OH)的形成依赖于游离铁的存在，而铁螯合剂将防止再灌注损伤。例如，铁螯合剂去铁胺，当再灌注之前给药时，在冠状动脉闭塞和再灌注期间防止损伤并减少心肌梗塞规模。然而，在流到局部缺血心肌的血重建之后，再灌注损伤迅速发生。
(·OH)基的形成依赖于游离铁的存在；铁螯合剂可以清除游离铁，因而使得铁不能催化羟基形成。然而，这些已知的铁螯合材料不能由Fenton反应(即EDTA)防止(·OH)产生，而且，进入细胞太慢(即去铁胺)以致于不能达到足够的量以迅速作用，而螯合足够的铁以防止(·OH)的形成和随后的细胞破坏。去铁胺已被证明如果在心肌梗塞发生之前给药是有效的，但如果在再灌注开始时或之后给药是无效的。
类似的心脏组织损伤可在心脏分流术过程中，如在开心手术期间发生，或在由于手术或损伤而缺乏带氧血液的其它器官上发生。
Macham，Ratledge和Barclay在England的University of Hull讨论(Lionel P.Macham，Colin Ratledge和Jennifer C.Nocton，“Extracellular Iron Acquisition byMycobacteriaRole of the Exochelinsand Evidence Against the Participation of Mycobactin”，Infection and Immunity，Vol，12，No.6，P1242-1251，Dec.1975；Raymond Baclay和Colin Ratledge，“Mycobactins and Exochelins of Mycobacterium tuberculosis，M.bovis，M.africanum and Other Related Species”，Journal of General Microbiology，134，771-776，(1988)；L.P.Macham和C.Ratledge，“A New Group of water-soluble Iron-binding Compounds from My cobacteriaThe Exochelins”，Journal of General Microbiology，89，379-382，(1975))简要描述了外螯素，并讨论了它们在分支杆菌内产生的功能。Macham确定了在细胞外流体中发现的一种物质的存在，他称之为外螯素。他描述外螯素为可溶于水和氯仿的化合物，该化合物具有螯合游离铁的能力。据Macham所言，此物与分布在细胞壁并使铁转移到细胞内的分支杆菌素具有相似性。然而，与此相反，分支杆菌素是亲脂的，不溶于水的分子，它不能扩散入，并从细胞外环境吸收游离铁。Macham等人认识到，外螯素在生理PH下的功能是使铁与血清中的其它带铁化合物，如转铁蛋白或铁蛋白分开，并使铁以可被分支杆菌素转移的形式存在。Macham等人没有分离或纯化外螯素，但确定它们为五-或六肽，具有分子量750至800，含有3mol ε-N-羟基赖氨酸，εN-乙酰基-εN-羟基赖氨酸，或εN-羟基赖氨酸和1mol苏氨酸。而且，取决于外螯素的细菌源，他揭示分子也可包括β-丙氨酸或水杨酸。
Barclay(同上)描述了从结核分支杆菌和相关种的二十二个不同菌株生产外螯素。然而，这些原研究者没有确定外螯素的具体结构或确定外螯素除其作为铁与分布于细胞壁内的分支杆菌素的传送介质的之外的任何应用。
因而需要一种在再灌注时可以容易地给药的物质，它将在其形成时螯合游离铁或使得能防止(·OH)基的形成。进一步地，需要确定外螯素的具体结构以使其功能可被更充分地了解，且其作为诊断，治疗和预防药征的应用可被阐明。
这些需要由本发明满足，它包括用外螯素防止由于(·OH)基的形成或存在引起的活组织的损伤。具体地，本发明涉及在再灌注之前或同时给梗塞的心肌施用外螯素，防止由铁介导的自由基形成引起的心肌损伤。并且介绍了外螯素的化学结构和修饰的外螯素，以及这些物质在治疗和诊断哺乳动物疾病方面的其它应用。
本发明的这些和其它特征，概况和优点参考下面的叙述，权利要求，和附图而变得更好理解，其中图1示出了外螯素铁螯合物(铁外螯素)和去铁外螯素(无铁)分子的化学结构。
图2示出了在220nm和450nm检测的结核分支杆菌培养物滤液的洗脱图。
图3示出了在450nm检测的同样滤液的洗脱图和所示各峰的分子量。
图4示出了在m/z＝720.3的主要含丝氨酸的外螯素的质谱和从其确定的结构。
图5是显示外螯素混合物用于心肌细胞结果的细胞损伤抑制的曲线。
图6是显示外螯素758C用于心肌细胞结果的细胞损伤抑制的曲线。
图7、8，和9是比较外螯素758C，772A和772C用于心肌细胞结果的细胞损伤抑制图。
图10示出了外螯素的铁螯合物(铁外螯素)和去铁外螯素(无铁)分子的化学结构及引用确定的修饰。本发明的详细叙述已经发现，外螯素可以阻断，或明显降低由铁介导的催化组织/自由基反应，如羟基(·OH)，尤其是在Fenton反应中产生的羟基引起的氧化性伤害，一般称为再灌注损伤。进一步已发现外螯素在再灌注开始时或同时给药时，有效地延缓或防止再灌注损伤。另外，已发现外螯素包含广泛得多的类型物质，并且与由Macham等人和Barclay等人原推断的不同的化学结构。
也已发现这些物质可螯合广泛的金属产生原先未知的物质。除了防止再灌注损伤之外，适当修饰的外螯素可被用于治疗某些疾病，攻击某些细胞，如癌细胞，和被用于监视药物治疗的效果并检测药物治疗的效果并检测某些病态的存在。特别是，已知成神经细胞瘤细胞的生长可通过用铁螯合化合物去铁胺除去铁而被负影响但对正常细胞的生长没有类似影响。外螯素的其它应用包括治疗由输液或癌症化疗，尤其是对白血病，引起的铁过载。
作为分离和纯化外螯素的结果，已发现外螯素是具有一个分子量范围和各种不同侧链的一族分子。进一步地，纯化的外螯素已被制备，且它们作为游离铁清除剂的应用，如它们在防止伤害组织的羟基(·OH)的形成方面有效，被第一次证明。特别地，纯化的结核分支杆菌的外螯素已被分离，并已显示在生理pH下可有效地从转铁蛋白，乳铁蛋白和铁蛋白中除去铁，而不传送衍生它们的细菌的任何传染性质。也已第一次证明，这些外螯素阻断通过Fenton反应的羟基形成，并且基于心脏心肌细胞的反应，在进攻发生之后以及发作后几小时给药，在心肌梗塞或血管损伤之后，可以有效防止对其它组织的再灌注损伤。
在分支杆菌素被广泛研究的同时，单个外螯素还没有被分离或纯化过，其结构和组成以前一直未被确定过。进一步地，我们已发现现有参考文献错误地表征了外螯素，因而未能确定这些化合物的结构。特别是，Macham(同上)认为它们是五-或六肽，具有750至800的分子量，含3mol ε-N-羟基赖氨酸，εN-乙酰基-εN-羟基赖氨酸，或εN-羟基鸟氨酸和1mol苏氨酸。我们发现外螯素具有更宽得多的分子量范围，由几个化合物系列组成，在分子量上具有可确定的差别，只包括2molε-N-羟基赖氨酸并且不是肽。肽是由第一分子的羰基与另一分子的氨基缩合形成酰胺键(-CO-NH-)形成的氨基酸(NH2-CHR-COOH)的聚合物。外螯素不能被认为是肽。代替的是，它们含有3个氨基酸和由酰胺(-NH-CO-)，羟基酰胺(-NH(OH)-CO-)和酯缩合(-CO-O-)形成的其它结构部分(水杨酸，二羧酸或单酯同系物，和羟基羧酸)。其铁-和去铁形式示于图1中。
制备-外螯素从结核分支杆菌的有毒(Erdman)和无毒(H37Ra)菌株产生和纯化。为了促进结核分支杆菌外螯素的产生，该菌在缺铁介质中培养。特别地，结核分支杆菌的Erdman菌株(美国典型培养物保藏中心35801)和H37Ra(ATCC25177)在37℃在5％CO2中在Middlebrook 7H11琼脂平板上生长。14天后，细菌被收获，在培养瓶中悬浮于150ml改良的Sauton’s培养基中并温育3至8周。改良的Sauton’s培养基含0.12mg/l柠檬酸铁铵而不加表面活性剂。
富铁外螯素(铁外螯素)然后通过过滤回收，用铁饱和，并用氯仿提取，通过高压液相色谱(HPLC)纯化。具体地，从上述悬浮液得到的上层清液连续滤过0.8μm和0.2μm低蛋白结合滤纸。外螯素然后通过与氯化铁(每升培养物滤液150mg)接触使过滤的上层清液饱和而载铁。铁外螯素与氯仿(每1.5体积的氯仿1体积培养物滤液)混合，分开各层后，富外螯素的氯仿层被取出并在无水硫酸镁(2g/l)中贮存。氯仿提取液然后通过烧结玻璃过滤器，并用旋转蒸发而蒸发，留下一褐色残余物。
此褐色残余物通过悬浮于5ml第一缓冲溶液(0.1％三氟乙酸)中，并引入液相色谱柱(C-18 Sep-Pak柱体)而进一步纯化。接近柱顶形成的褐色带用第二缓冲液(0.1％TFA，5 0％乙腈)洗脱。部分纯化物然后在0.1％三氟乙酸中稀释三倍并在1ml/min进行逆相高压液相色谱分离，接着暴露于C-18柱。在HPLC洗脱液中富铁外螯素的存在通过同时监测指示酰胺和芳香基的450nm峰(铁化合物)和220nm峰的UV吸收而检测。大约5个主峰和10个小峰，示于图2，从最后的C-18柱洗出，显示了高的450/220nm的吸收比。这些被质谱确证为外螯素。主峰通过在一烷基苯基柱上第二次逆相HPLC进一步纯化。从结核分支杆菌的Erdman菌株回收的外螯素与从H37Ra菌株回收的外螯素完全相同。
表征-基于以其铁-(Fe3+)形式，从柱子洗出的多个峰的LSIMS和ESI-MS分析，铁-外螯素不限于上面详细说明的两个具体分子，但包括质量在716至828道尔顿范围内的种族。该族的各个成员表现为与其邻物相差14道尔顿，反映出在R1烷基侧链中CH2的值，和/或2道尔顿，反映出在R1烷基侧链中双键的存在。因此，外螯素看起来形成两个系列，每个系列的随后成员在质量上差14道尔顿，饱和的系列具有质量约716，730，744，758，772，786，800，814和828道尔顿，而不饱和系列具有质量742，756，784，798，812和826。另外，在R3上存在或不存在甲基(即H或CH3)进一步定义了另外的两个系列分子，称作丝氨酸(R＝H)和苏氨酸系列(R3＝CH3)，由氨基酸分析确证。最极性的化合物在图的左边(早洗出)，而最小极性(最易溶于脂)的在右边。然而所有峰都是水溶性的。其中多于一个峰被发现具有同样的分子量，各个峰进一步被标为A，B或C(即758A，B和C)以指示极性水平，A代表极性更大的化合物，而C代表极性较小形式。极性更大的形式据信是由甲基连接在分子的不同位置上引起的。
外螯素的结构-图4示出了在主要饱和的含丝氨酸的去铁外螯素的诱导离解(He在2kev漂浮，碰撞能量6keV)条件下串联质谱计分析的结果，(M+H)+为m/z720.3。碎片离子被归结于从由酰胺或酯键产生的破裂产物产生的六个结构片断之一，相对于中性分子的氢转移，与示于附图4中的谱标明的各个峰关联。外螯素的酸水解和甲基化导致水杨酸和庚二酸的形成。质谱图解分析表明庚二酸作为甲基酯存在于外螯素内。
基于这一分析，铁外螯素和去铁外螯素的一般结构示于图1中。显示在R4位的甲基(如图10中定义的)可以在R5位。铁-外螯素芯分子围绕中心的铁。它含有3个氨基酸部分(两个N-羟基赖氨酸和1个丝氨酸或苏氨酸，取决于R3是氢还是甲基)。外螯素和结核分支杆菌的分支杆菌素之间的主要差别是外螯素中的R1要么以饱和烷基甲基酯((CH2)NCOOCH3)要么以单个不饱和烷基甲基酯(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3存在，且外螯素比分支杆菌具有短得多的烷基侧链，这些侧链终止于甲基酯部分。这些差别提供了外螯素的水溶性和其在细胞外环境中发挥功能的能力。
临床应用-外螯素给药防止再灌注损伤的临床应用通过用于成年大鼠心肌细胞而被证明。
在下面的实施例中，以去铁-和铁-形式的不同外螯素，将由在图3的洗脱曲线中所示的分子量确认。实施例1在大鼠被麻醉后，将雄性大鼠的心脏切除，实施开胸术，心脏就地冷冻。切除的心脏然后放在Langendorff上，并用胶原酶和透明质酸酶以50μM钙，在改良的Krebs Ringer缓冲溶液中灌注。然后将组织细分，并分散在胶原酶/胰蛋白酶溶液中，过滤到冷的胰蛋白酶抑制剂溶液中，并暴露以升高钙浓度。除去损坏的细胞后，保留的细胞悬浮液被放入几个涂有昆布氨酸的塑料培养皿中，其中装有含5％胎牛血清的培养基。
培养物被放置48小时后，往每个皿中加入过氧化氢，在不同的时间间隔测量指示细胞损伤的乳酸脱氢酶活性(LDH)。用于比较的细胞损伤指数(CII)通过测量LDH获得，LDH的测量是在非暴露的细胞培养物中，在条件(0指数)，和暴露于溶解100％心肌细胞的去污剂(1％Triton X-100)(代表CII为100)中进行。然后在不同时期在特定处理条件下测定LDH，测定的相应CII值和单个结果针对时间标绘图(图5)。
用上述操作，外螯素772C和784去铁形式的混合物(772C峰和784峰5050混合物)，-一个相对无极性的物质-，被分离并用于处理细胞培养物。外螯素通过在pH6用50毫摩尔EDTA温育几天而转化为去铁外螯素形式。去铁形式然后通过氯仿萃取再纯化。
三个细胞样品被暴露于a)H2O2，b)同时加入的H2O2和50μM去铁外螯素(无铁外螯素)，或者c)在往细胞培养物(预温育)中加入100μM去铁外螯素2小时之后加入的H2O2。在4小时后，未处理的细胞培养物显示几乎62％的细胞损伤。相对地，在过氧化物加入的同时，或2小时之前加入外螯素基本防止或明显降低了细胞损害，细胞损伤为大约2至9％。实施例2用比外螯素772C和784相对更具极性的去铁外螯素758C重复实施例1的过程。当去铁外螯素758C在输送H2O2同时或15分钟之内被输送时，在效果上只有很小的差别或没有差别。对于两种物质，2小时后，细胞损伤基本上与对照相同。然而，在H2O2导入之前2小时输送去铁外螯素758C，使细胞破坏削减到CII约20。结果示于图6中。实施例3用去铁外螯素772A，772C和758C重复上述过程。标绘于图7-9的是提前2小时，同时和延迟20分钟输送外螯素的结果。在所有条件下只有外螯素772C显示阻止损伤，而外螯素772A在任何条件下都无效。另一方面，外螯素758C只有如果在过氧化物导入前2小时被输送才显示保护作用。因而概括出，当在(·OH)基形成时或形成后，即损伤发生后给药时，相对非极性的更脂溶性的外螯素是有效的；更极性的外螯素必须在自由基产生前1至2小时给药才防止或降低细胞破坏。实施例4
外螯素与主体铁-结合性蛋白质争夺铁的容量通过将去铁外螯素与转铁蛋白，乳铁蛋白，或铁蛋白溶液以铁与外螯素4∶1和1∶1的摩尔比温育测定。外螯素从其去铁形式向铁形式的转化然后通过反相HPLC测定。将去铁外螯素暴露于95％铁-饱和的转铁蛋白1分钟内，外螯素开始从转铁蛋白吸收铁，1小时内，外螯素完全被铁饱和。铁也容易从40％铁-饱和的转铁蛋白除去，接近于存在于血清中转铁蛋白中的铁浓度。当去铁外螯素被暴露于铁-饱和的乳铁蛋白时，得到类似的结果。类似地，铁蛋白向外螯素释放铁，但与其它铁结合性蛋白质相比，速度较慢。
已经发现，外螯素在生理系统中在清除游离铁方面非常有效，并从带铁蛋白质中吸走铁。特别是已发现外螯素能有效地阻断羟基自由基(·OH)的形成，因而明显降低或防止损伤，当血液循环到该组织时，局部缺血组织被重建，更高分子量更小极性的外螯素在防止细胞破坏方面更有效。在对心组织的益处已被证明的同时，循流向血液中断的其它身体器官，包括但不限于脑、肾，肝、肠和骨骼肌肉的外螯素应用的益处现在也明显了。
实验显示，外螯素的亲合性不限于铁，其它金属也可被螯合，如Na，K，Mn，Mg，Al和Zn。因此，外螯素可被用于往体内输送各种需要的金属或在体内螯合各种不需要的金属。另外，某些细胞，包括某些癌细胞已知需要或亲合某些金属。这可被用于输送连接在外螯素上的细胞活泼的化合物以破坏该细胞(化疗)或将连接在外螯素上的有用药物瞄准患病器官。相反地，由于某些癌细胞需要很多铁，去铁外螯素可被用于结合游离铁，因此防止铁输送到癌细胞，导致癌细胞的破坏。
在从结核分支杆菌回收的外螯素的结构被示于图1的同时，已知其它分支杆菌可产生外螯素，依赖于衍生它们的分支杆菌，这些外螯素可具有不同结构并包括不同的氨基酸。然而，所有外螯素的行为相似，并以相似的系列存在，其相邻的成员具有相似的分子量级数。系列不同成员的效果也取决于分子的相对极性。因此，本发明预期外螯素从其它分枝杆菌产生，包括，但不限于，结核分枝杆菌，田鼠分枝杆菌，牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌，堪萨斯代分枝杆菌，海分枝杆菌，胃分枝杆菌，无色分枝杆菌，土分枝杆菌，次要分枝杆菌，M.malmoense，M.shimoidei，戈特氏分枝杆菌，M.asiaticum，M.szulgai，猿分枝杆菌，M.scrofulaceum，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，蟾分枝杆菌，溃疡分枝杆菌，M.hacmophilum，M.farcinogenes，鼠麻疯分枝杆菌，副结核分枝杆菌，M.chelonae subsp.chelonae，M.chelonae subsp.abscessus，偶发分枝杆菌，M.chitae，M.senegalense，M.agri，耻垢分枝杆菌，草分枝杆菌，M.thermoresistibile，M.aichiense，M.aurum，M.chubuense，M.duvalii，淡黄分枝杆菌，M.gadium，M.givum，M.komossense，M.neoaurum，M.obuense，M.parafortuitum，M.rhodesiac，M.sphagni，M.tokaiense或牝牛分枝杆菌。
也预期外螯素可被修饰以实现其溶解性，金属螯合能力或细胞吸收速率。另外，修饰的外螯素或外螯素以其金属螯合状态的检测，用单克隆抗体或化学分析作为诊断工具，通过血液分析，尿分析或非侵入性器械技术，以监测病态进展或治疗效果。特别地，对于示于图10中的含金属和无金属化合物的结构，下列取代基被提出R1＝(CH2)nCH3为直链或支链；(CH2)nCOOH，一个脂肪酸；(CH2)nCOOR，一个脂肪酸酯，其中R为烷基；(CH2)nCONH2；R2＝在烷基的4个开环位的任何一个的取代基，磺酰胺，羟基，卤素，乙酰基，氨甲酰基，胺，NO2或其任何组合；R3-H(丝氨酸)或CH3(苏氨酸)可被在可以形成环状噁唑啉结构的β-羟基氨基酸上发现的侧链置换。
R4a和R4b＝H，CH3或其它烷基或取代的烷基；R5a和R5b＝H，CH3或其它烷基或取代的烷基；X＝O，NH，S，CH2；M＝单，二，或三价金属如Pb，Al，Cd，Ni，Ag，Au，As，Mg，Mn，Zn，Cu，Ru，Nb，Zr，Ta，V，Ga，Pt，Cr，Sc，Y，Co，Ti，Na，K；*代表手性中心，可以是R或S；
在螯合金属时涉及的各种羟基(OH)可被各种官能团如H或卤素置换，以改变用于螯合金属的化合物的亲合性，或将分子转化为金属拮抗剂。
尽管本发明已经用某些优选的方案和其应用相当详细地描述过了，但其它方案和应用也是可能的。例如，外螯素可以通过封闭分枝杆菌的铁入口，从体内除去毒性水平的金属，或将需要的金属输送到体内而用于攻击传染性细菌，如结核分枝杆菌。进一步地，修饰过的含金属的外螯素可在体内输送附加的活性药物或化学药物到优先吸收螯合的金属和优选吸收外螯素的位置，而螯合金属可被用作由其它药征，如用于癌细胞低温治疗的微波能，治疗的靶。因此，权利要求的精神和范围不应限于包含于本文中优选方案的叙述。
权利要求书按照条约第19条的修改1、用于保护哺乳动物的活组织不受由于暴露于羟基自由基引起的损伤的组合物，所述自由基在限制血液流向某一身体器官之后，随着重建流体流向该身体器官而形成，所说组合物包括有效量的去铁外螯素，所说的有效量随着流体流向组织的重建而给予活组织。
2、权利要求1的组合物，其中去铁外螯素在流体给药之前施用。
3、如权利要求1的组合物，其中去铁外螯素至少在流体给药开始时施用。
4、如权利要求1的组合物，其中去铁外螯素在流体给药开始约15分钟内施用。
5、如权利要求1的组合物，其中活组织是心肌，而流体选自由再灌注溶液和心脏麻痹溶液组成的一组。
6、如权利要求1的组合物，所说的组合物含有有效量的至少一种去铁外螯素。它具有下式 其中R1选自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3组成的一组，N为1至7，x+y为1至5，而R3选自由H和CH3组成的一组，所说的去铁外螯素具有约716至约826道尔顿的分子量。
7、如权利要求6的组合物，所说的组合物包括具有772和784道尔顿分子量的去铁外螯素的混合物。
8、如权利要求6的组合物，所说的组合物包括特征为N是5至7的整数的相对非极性的去铁外螯素的混合物。
9、如权利要求6的组合物，所说的组合物包括特征为x+y是4或5的相对非极性去铁外螯素的混合物。
10、一种用于防止哺乳动物的活组织由于铁存在介导的羟基形成产生的损伤的组合物，包括有效量的至少一种去铁外螯素，它具有下式 其中R1选自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3组成的一组，N为1至7、x+y为1至5，R3选自由H和CH3组成的一组，所说的去铁外螯素具有约716至约826道尔顿的分子量。
11、一种用于输送有效量的活性化合物到哺乳动物以治疗疾病的组合物，所说的组合物具有下式 其中R1为选自由(CH2)nCH3，(CH2)nCOOH，(CH2)nCOOR组成的小类，其中R为烷基和(CH2)nCONH2组成的一组的化学部分R2为在环的4个开环位置的任何一个取代的化学部分，所说的化学部分选自由烷基，磺酰胺，羟基，卤素，乙酰基，氨基甲酰基，胺和NO2和其组合；R3为选自由在可以形成环状恶唑啉结构的β-羟基氨基酸上发现的侧链组成的一组的化学部分；R4a、R4b、R5a、R5b是选自由H，烷基和取代的烷基组成的一组的化学部分，且*代表可以是R或S的手性中心。
12、如权利要求11的组合物，其中所说的组合物选自由饱和的和不饱和的化合物组成的一组，饱和的化合物具有716，730，744，758，772，786，800，814和828道尔顿的质量，而不饱和的化合物具有742，756，770，784，798，812和826的质量。
13、如权利要求11的组合物，所说的组合物当暴露于金属离子溶液时，形成具有下式的金属螯合物； 其中M选自由铁，铅，铝，镉，镍，银，金，砷，镁，锰，锌，铜，钌，铌，锆，钽，钒，镓，铂，铬，钪，钇，钴，钛，钠和钾组成的一组。
14、如权利要求13的金属螯合物，其中M是铁。
权利要求
1.一种保护哺乳动物活组织不受由于暴露于羟基自由基而引起的损伤的方法，所述自由基由在限制血液流向某一身体器官之后，随着重建流体流向该身体器官而形成，所述方法包括与重建流体流向组织连同对哺乳动物施用含有效量的去铁外螯素的组合物。
2.权利要求1的方法，其中去铁外螯素在流体给药之前施用。
3.权利要求1的方法，其中去铁外螯素至少在流体给药开始时施用。
4.权利要求1的方法，其中去铁外螯素在流体给药开始约15分钟内施用。
5.权利要求1的方法，其中活组织是心肌，而流体选自由再灌注溶液和心脏麻痹溶液组成的一组。
6.权利要求1的方法，其中组合物含有有效量的至少一种去铁外螯素，它具有下式 其中R1选自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3组成的一组，N为1至7，x+y为1至5，而R3选自由H和CH3组成的一组，所说的去铁外螯素具有约716至约826道尔顿的分子量。
7.权利要求6的方法，其中组合物包括具有772和784道尔顿分子量的去铁外螯素的混合物。
8.权利要求6的方法，其中组合物包括特征为N是5至7的整数的相对非极性的去铁外螯素的混合物。
9.权利要求6的方法，其中组合物包括特征为x+y是4或5的相对非极性去铁外螯素的混合物。
10.一种用于防止哺乳动物活组织由于铁存在介导的羟基形成产生的损伤的组合物，包括有效量的至少一种去铁外螯素，它具有下式 其中R1选自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3组成的一组，N为1至7，x+y为1至5，而R3选自由H和CH3组成的一组，所说的去铁外螯素具有约716至约826道尔顿的分子量。
11.一种用于输送有效量的活性化合物到哺乳动物以治疗疾病的组合物，所说的组合物具有下式 其中R1选自由(CH2)nCH3，(CH2)nCOOH，(CH2)nCOOR，其中R为烷基和(CH2)nCONH2组成的一组的化学部分；R2为在环的4个开环位置的任何一个取代的化学部分，所说的化学部分选自由烷基，磺酰胺，羟基，卤素，乙酰基，氨基甲酰基，胺和NO2和其组合；
全文摘要
外螯素可被用于防止由于(·OH)基的形成或存在造成的对活组织的损害。特别地，本发明涉及在再灌注之前或同时对梗塞的心肌施用外螯素以防止由于铁介导的自由基形成引起的心肌损伤。还涉及外螯素和修饰的外螯素的化学结构，以及这些物质在治疗和诊断哺乳动物疾病方面的其它应用。
文档编号A01N1/02GK1145588SQ96190073
公开日1997年3月19日 申请日期1996年1月26日 优先权日1995年2月3日
发明者罗伦斯·霍维茨, 马库斯·A·霍维茨, 布拉德福德·W·吉布森, 约瑟夫·里夫 申请人:加利福尼亚大学董事会