专利名称：一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA干扰技术领域，具体涉及一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。根据GL0B0CAN最新的数据，2008年，全球发现1270万癌症病例，760万例死亡；半数病例发生在中国。目前有大量医疗投入在恶性肿瘤的治疗上，主要的治疗模式为手术、放疗和化疗。但由于三大常规治疗模式的局限性，总体治疗效果和预后均仍不理想。 肿瘤治疗第四种模式的肿瘤生物治疗正显示出越来越好的应用前景，其中基因治疗是最基本也是最主要的治疗手段之一。但是目前针对恶性肿瘤而进行的基因治疗研究部分由于对肿瘤细胞杀伤效率偏低问题而无法进入临床，而低杀伤效率往往由于是肿瘤细胞对治疗用药物的耐受。因此，研究肿瘤细胞对目前肿瘤基因治疗药物耐受的分子机制，对研究开发新的肿瘤基因治疗药物具有十分重要的意义。正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有许多基因表现出过度表达的现象，尤其是一些促进细胞生长、侵袭等恶性表型基因的过量表达。大多数恶性肿瘤细胞中抵抗细胞凋亡因子之一的Bcl2水平显著升高。一些研究表明，降低、阻遏Bcl2的表达，可以使肿瘤细胞发生凋亡，具有一定的抑瘤效果。在抑制基因表达的技术上，自从在许多生物中都发现了普遍存在的基因表达调控
中转录后基因沉默的一种重要方式-RNA干扰(RNA interference, RNAi)后,利用小干
扰RNA(small interfering RNA, siRNA)进行基因表达的抑制已广泛应用于从基因功能的基础性研究到疾病生物治疗药物的应用性研究中。申请号为200610091396. 0的中国发明专利公开了四组siRNA双链序列，它们可抑制bcl-2抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Bcl-2蛋白表达和翻译，从而减少Bcl2蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，是很好的抗白血病和肿瘤细胞耐药性的小分子双链核酸药物。
发明内容
本发明提供了一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链及其应用，在研究肿瘤细胞的基因治疗药物中有重要的意义。一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链，碱基序列如下正义链5'-GCCUUGACAUUGAUGGAAUTT-3'；反义链3'-TTCGGAACUUUGUAACU ACCUUA-5'。本发明依据Ambion 公司的在线设计软件(http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)分析,采用在绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达的抵抗凋亡的Bcl2为靶点，设计靶向Bcl2的siRNA序列，在一些肺癌和宫颈癌细胞内有效抑制Bcl2基因的表达；对不同肿瘤细胞相对存活率的影响不同，在促进肺癌细胞A549凋亡的同时却降低肿瘤细胞Hela凋亡。本发明还提供了所述siRNA双链在制备抗肿瘤核酸药物中的应用。本发明的有益效果利用本发明提供的siRNA双链可以为人们从一个完全不同的新角度对肿瘤细胞凋亡的分子机制展开研究提供一个新的工具，对于基因治疗药物的研究具有重要意义。
、图I为Western blot技术检测siRNA对Hela和A549细胞中Bcl2基因表达的蛋白质表达水平的抑制影响图；图2为MTT检测siRNA对A549细胞相对存活率的影响图；图3为MTT检测siRNA对Hela细胞相对存活率的影响图；图4为流式细胞术检测siRNA对A549细胞早期凋亡率的影响图；图5为流式细胞术检测siRNA对Hela细胞早期凋亡率的影响图。
具体实施例方式实施例I设计siRNA从GenBank检索得到人Bcl2基因的mRNA序列(GenBank登录号NM_000633. I)，利用 Ambion 公司的在线设计软件(http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.html)分析该mRNA序列上合适的位点,确定siRNA的作用祀点,设计序列正义链5'-GCCUUGACAUUGAUGGAAUTT-3' (SEQ ID NO :I);反义链3'-TTCGGAACUUUGUAACUACCUUA-5' (SEQ ID NO :2)。由上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司根据设计的序列合成siRNA。实施例2 siRNA双链对Bcl2基因表达的蛋白质表达水平的抑制试验在6孔细胞培养板中转染对数生长期的人宫颈癌细胞Hela :每孔接种6 X IO4个细胞于 1.5ml 10% BGS 1640, lipofectamine LTX 2000/siRNA 的配比 I. 8ul/24pmol (I. 2ul，20uM siRNA)，于248. 2ul/248. 8ul OPTI-MEM中稀释、混匀，室温下静置30min以上，轻轻加入相应孔内;设立Blank(空白对照)组、Mock(只加转染试剂lipofectamine LTX 2000)组、siRNA control (不靶向任何基因的siRNA)组和siRNA Bcl2组(靶向Bcl2基因)，每组设6孔，收集时合并。转染6h后，移去含转染试剂的培养液，每孔加2mll% BGS 1640。在6孔细胞培养板中转染人肺癌细胞A549 :每孔接种4 X IO5个细胞于I. 5ml 10%BGS 1640, lipofectamine LTX 2000/siRNA 的配比为 12ul/200pmol (IOul 20uM siRNA),于238ul/240 OPTI-MEM中稀释、混匀，室温下静置30min以上，轻轻加入相应孔内；设立 Blank(空白对照)组、Mock(只加转染试剂 lipofectamine LTX 2000)组、siRNAcontrol (不靶向任何基因的siRNA)组和siRNA Bcl2 (靶向Bcl2基因)组，设每组设3孔，收集时合并。转染6h后，每孔加2ml 2% BGS 1640。转染72h后，不吸去培养液，收集细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶，5%浓缩胶)，然后将蛋白转至PVDF膜，封闭后与I : 100稀释的抗Bcl2 的抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.,美国，sc_509)于 4°C结合过夜,用 TBST 洗膜3次，再与I : 5000稀释HR标记的二抗(杭州联科生物技术有限公司)结合，室温2小时后，用TBST洗膜3次，然后用化学发光试剂盒(Millipore公司，美国)显影，在化学发光凝胶成像仪上拍照、分析。图I为Western blot技术检测siRNA对Hela和A549细胞中Bcl2基因表达的蛋白质表达水平的抑制作用，结果显示，靶向Bcl2基因的siRNA双链(siRNA Bcl2)能有效抑制Hela和A549细胞中Bcl2基因表达的蛋白质表达水平，而其它对照组则无此抑制效果。实施例3 siRNA对肿瘤细胞体外生长的作用试验(MTT法)取对数生长期的人肺癌细胞A549和宫颈癌细胞Hela，转染细胞在24孔细胞培养板中，每孔接种 1\104个么549或拖13于400111 10% BGS1640, lipofectamine LTX 2000/siRNA 的配比为 0. 3ul/4pmol (0. 2ul 20uM siRNA)，于 49. 7ul/49. 8ul OPTI-MEM 中稀释、混匀，室温下静置30min以上，轻轻加入相应细胞孔；在每块24孔细胞培养板上设立不加任 何试剂的 Blank 组、只加 lipofectamine LTX 2000 的 Mock 组、siRNA control 组(不革巴向任何基因的siRNA)和siRNABcl2组(靶向Bcl2基因)，每组设5复孔；每株细胞转染10块24孔细胞培养板的细胞；转染6小时后，移去含转染试剂的培养液，每孔加500ul 2% BGS1640于人肺癌细胞A549、500ul I % BGS 1640于宫颈癌细胞Hela ;分别于转染6h、24h、48h、72h、96h后，每株细胞各取I块24孔板，每孔加入0. 5ul、0. 5ul、Iul、2ul、4ul的促凋亡药物放线菌酮CHX (母液2mg/ml),使终浓度分别达到lug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml，用以诱导细胞凋亡；CHX诱导24小时后，取I块经CHX处理24h的24孔板与不含CHX的24孔板，每孔加入50ul 5mg/ml的MTT，继续培养4h ;吸去培养液，每孔加入250ul异丙醇，室温下溶解细胞中紫色结晶大约10 min ;取IOOul溶解的液体加入96孔酶标板中，测OD570(690 reference);于转染72h后，将于转染96h、120h后分析的24孔板中的细胞更换至新鲜2%或者1% BGS1640。图2为MTT检测siRNA对A549细胞相对存活率的影响，结果显示，无论是否经CHX诱导，在A549细胞中，转染了 siRNA Bcl2的A549细胞的相对存活率降低，siRNABcl2沉默Be 12基因的表达后，具有促进A549细胞死亡的作用。图3是MTT检测siRNA对Hela细胞相对存活率的影响，结果显示，在没有CHX诱导的情况下，转染了 siRNA Bcl2的Hela细胞的相对存活率升高，siRNA Bcl2沉默Bcl2基因的表达后，具有保护Hela的作用。实施例4 siRNA对肿瘤细胞体外凋亡的作用试验(流式细胞法)在6孔细胞培养板中转染A549 :每孔4X IO5个细胞，lipofectamine LTX2000/siRNA 的配比为 12ul/200pmol (IOul 20uM siRNA)于 238ul/240ul OPT I-MEM 中稀释、混匀，室温下静置30min以上，轻轻加入相应细胞孔；同实施例3，设立Blank组、Mock组、siRNAcontrol组(不靶向任何基因的siRNA)和siRNA Bcl2组(靶向Bcl2基因)，每组设2孔，收集时合并；转染6小时后，移去含转染试剂的培养液，每孔加2ml 2% BGS 1640。在6孔细胞培养板中转染Hela :每孔6X IO4个细胞，lipofectamine LTX 2000/siRNA 的配比 I. 8ul/24pmol(l. 2ul,20uM siRNA)，于 248. 2ul/248. 8ul OPT I-MEM 中稀释、混匀，室温下静置30min以上，轻轻加入相应孔内；同实施例1，设立Blank组、Mock组、siRNAcontrol组(不靶向任何基因的siRNA)和siRNA Bcl2组(靶向Bcl2基因)，每组设3孔，收集时合并；转染6小时后，移去含转染试剂的培养液，每孔加2mll% BGS 1640。
转染48h时加入10ug/mlCHX，使每孔CHX终浓度为2ug/ml，处理24h后收集细胞，按凋亡检测试剂盒(ANXN V FITC Apoptosis DTEC Kit, BD Pharmingen, #556547)说明书操作，在I小时内完成流式细胞的检测。图4是流式细胞术检测siRNA对A549细胞早期凋亡的作用，结果显示在A549中，未经CHX处理时，转染了 siRNABcl2的细胞的早期凋亡率明显高于转染了无沉默效应的siRNA control的细胞，经t检验，有统计学差异显著Op = 0. 011 < 0. 05, n = 3)；经CHX处理后，转染了 siRNA Bcl2的细胞的早期凋亡率远远高于转染了无沉默效应的siRNAcontrol 的细胞，统计学差异更加显著(**p = 0. 0002 < 0. 001，n = 5)。siRNABc12对Bcl2基因表达的沉默作用与促凋亡药物协同促进细胞亡。图5是流式细胞术检测siRNA对Hela细胞早期凋亡的作用，结果显示，在Hela 中，当不用CHX处理时，转染了 siRNA Bcl2的细胞的早期凋亡率低于转染了无沉默效应的siRNAcontrol的细胞，但经t检验并无统计学差异(p = 0. 093 > 0. 05, n = 3);经CHX处理24h后，转染了 siRNA Bcl2的细胞的早期凋亡率明显低于转染了无沉默效应的siRNAcontrol的细胞,经t检验,差异有统计学意义Op = 0. 014 < 0. 05, n = 3)。
权利要求
1.一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链，其特征在于，碱基序列如下正义链5' -GCCUUGACAUUGAUGGAAUTT-3'；反义链3' -TTC GGAA C UUUGU AACUA CCUUA-5'。
2.如权利要求I所述的siRNA双链在制备抗肿瘤核酸药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制Bcl2基因表达的siRNA双链及其应用，siRNA双链具有如下的核苷酸序列正义链5′-GCCUUGACAUUGAUGGAAUTT-3′；反义链3′-TTCGGAACUUUGUAACU ACCUUA-5′。本发明中依据Ambion公司的在线设计软件分析，采用在绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达的抵抗凋亡的Bcl2为靶点，设计靶向Bcl2的siRNA序列，在一些肺癌和宫颈癌细胞内有效抑制Bcl2基因的表达；对不同肿瘤细胞相对存活率的影响不同，在促进肺癌细胞A549凋亡的同时却降低肿瘤细胞Hela凋亡，对于基因治疗药物的研究具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK102703452SQ20121021350
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者曹江, 贾振宇, 陈翔, 黄晓明 申请人:浙江省医学科学院