专利名称：抑制bc1－2基因表达的siRNA双链及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及siRNA双链序列及其应用，尤其是抑制bcl-2基因表达的siRNA双链及其应用。
背景技术：
RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)，在此情况下启动子是活跃的，靶基因能被转录，但不能正常积累mRNA。各种体内外实验证实21-23个nt的短双链RNA，即siRNA(short interference RNA，siRNA)，可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用。已证明，siRNA技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，如病毒感染、SBMA，还可用于治疗肿瘤。
Bcl-2为一原癌基因，能够抑制细胞凋亡，与肿瘤的发生和耐药性的形成关系密切。基因治疗可以增加耐药细胞对药物的敏感性，并且具有较强的特异性和无毒性，为肿瘤MDR的逆转开辟了崭新的途径，优化了化学治疗，因而具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制bcl-2基因表达的siRNA双链序列，以及进一步提供该siRNA双链在制药中的应用。
为达上述目的，本发明的四对以bcl-2基因为靶标的siRNA的序列分别为siRNA2反义链5’-AAG CCG GCG ACG ACT TCT CCC CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAG GGA GAA GTC GTC GCC GGC CCT GTC TC-3’；
SIRNA3反义链5’-AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT CCT GTC TC-3，正义链5’-AAA GTC ATC CAC AGG GCG ATG CCT GTC TC-3’；SIRNA5反义链5’-AAA GCG TTC ACT CCC AAC CTG CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAC AGG TTG GGA GTG AAC GCT CCT GTC TC-3’；SIRNA6反义链5’-AAG AAT GCA AAG CAC ATC CAA CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAT TGG ATG TGC TTT GCA TTC CCT GTC TC-3’。
上述各对siRNA序列可用于制备治疗肿瘤和白血病的药物。
本发明依据Ambion公司在网上提供有设计工具软件，设计合成以bcl-2基因为靶标的6对siRNA，通过脂质体将合成的siRNA转入U251细胞株，以未转染细胞以及bcl-2的反义药物G3139为对照，经MTT法检测siRNA对细胞生长的抑制以及流式细胞仪检测细胞周期的改变，用RT-PCR和免疫组织化学法检测siRNA对bcl-2表达的抑制作用。结果表明MTT显示各时间点细胞生长以及存活率，在siRNA2、3、5、6与siRNA1、4组以及对照组和脂质体组间均有显著性差异(P＜0.05)。siRNA1、4组与对照组和脂质体组也有差异(P＜0.05)。siRNA1-6组与反义组在24和48小时均有差异(P＜0.05)，在72小时无差异(P＞0.05)。RT-PCR以及免疫组织化学法显示，siRNA2、3、5、6组bcl-2基因表达明显低对照组\脂质体组\反义组以及siRNA1、4间(P＜0.05)。流式细胞仪结果显示，siRNA1-6组以及反义组细胞阻滞于S期。结论体外转录合成的siRNA2、3、5、6可抑制U251细胞bcl-2基因的表达，效率可达50％以上。
RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默，RNAi具有强大的细胞穿透能力，可在不同细胞间长距离传递和维持。21-23个nt的siRNA，可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用，siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂有很重要的药理作用。siRNA结构稳定无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至极低水平甚至完全“敲除”。siRNA主要通过脂质体转染、电穿孔、微注射以及质粒转入。
bcl-2基因的易位和高表达与肿瘤的发生密切相关。现已发现，在血液、淋巴系统的多种恶性肿瘤、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和成神经细胞瘤的发生及不良预后有密切关系。bcl-2等凋亡抑制基因的高表达与肿瘤逃避机体的自稳机制密切相关。bcl-2可抑制多种生理条件下的致凋因素诱导的凋亡，从而为转移后的肿瘤细胞能够继续生存提供了条件。另有研究发现，高表达Bcl-2的瘤细胞对化疗药物耐药性增加。因此，降低或消除Bcl-2基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除Bcl-2对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本发明针对bcl-2基因设计合成6条siRNA，通过脂质体转入神经胶质瘤U-251，与G3139作对照评价其抑制bcl-2的效应。MTT、RT-PCR结果均显示siRNA2、3、5、6有明显的抑制效应，与空白对照组相比bcl-2表达降低50％以上，流式细胞仪结果显示细胞停滞于S期。实验结果提示反义核苷酸对bcl-2的抑制作用多发生在48h以后，而siRNA在用药后12h即有明显抑制效应，但MTT结果提示随着时间延长，抑制效率有所降低。本发明应用近年来基因治疗的崭新手段---siRNA，抑制bcl-2这一抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Bcl-2蛋白表达和翻译，从而减少Bcl2蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，进而把它应用在肿瘤药物的制药中。
图1～图9是用免疫组织化学法检测bcl-2蛋白的表达时显微镜下观察的各组U251细胞bcl-2蛋白表达形态图。
图10是RT-PCR检测各组转染细胞bcl-2mRNA表达水平的电泳图。
图11～图19是流式细胞仪观察的细胞转染后周期变化曲线图。
图20是各组细胞S期细胞百份率对比图。
具体实施例方式
实施例1siRNA的合成。
关于siRNA序列设计，Ambion公司在网上均提供有设计工具软件(参见www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)依据试剂盒(美国Ambion公司)合成如下六对siRNA
表1、依据Ambion公司设计软件设计合成的六对siRNA序列实施例2MTT检测细胞对各对siRNA的敏感性。
取对数生长期U251细胞，配制1.5×105/mL起始浓度细胞悬液加到96孔培养板内(美国Corning公司生产，)，每孔加100μL，设空白对照组、脂质体(美国Invitrogen公司)对照组、反义组(15μmol/L)、以及siRNA1-6组(1μmol/L)。每组5孔，按分组于接种24h后，弃取上清，加siRNA1-6或G3139，置37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中无血清继续培养6h，再各补加无双抗含10％胎牛血清的1640 100μL，分别于24、48、72h加入MTT 20μL，4h后离心弃上清加入DMSO150μL，酶标仪下读出吸光度。细胞存活率＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％。
结果表面，siRNA2、3、5、6与对照组和脂质体组在各时间点均有显著性差异(P＜0.001)；在各时间点siRNA1、4组与siRNA2、3、5、6间有差异(P＜0.05)与对照组和脂质体组也有差异(P＜0.05)。siRNA1-6组与反义组在72小时无差异(P＝0.073，0.133，0.239，0.054，0.225，0.137)，在24和48小时均有差异(P＜0.05)。见表2、表3。
组别24小时48小0时 72小时空白对照组 0.439±0.017 0.651±0.029 0.968±0.072反义组 0.390±0.040★0.609±0.034★0.701±0.064★脂质体对照组0.412±0.039 0.624±0.030 0.928±0.013SiRNA1组0.334±0.031★0.529±0.017★0.751±0.043★SiRNA2组0.148±0.011*0.356±0.033*0.660±0.009*SiRNA3组0.184±0.044*0.371±0.009*0.669±0.030*SiRNA4组0.320±0.033★0.526±0.031★0.755±0.035★*SiRNA5组0.192±0.044*0.380±0.057*0.668±0.040*SiRNA6组0.209±0.026*0.351±0.036*0.660±0.033*※表示各组OD值均为扣除空白培养基本底后的结果★表示与对照组间有差异(P＜0.05) *表示与对间有明显差异(P＜0.001)照组表2、转染siRNA后各时间点MTT法检测细胞增殖活性OD值※组别24小时48小时 72小时空白对照组 100％ 100％100％反义组 88.8％★93.5％★72.4％★脂质体对照组93.8％95.9％ 95.9％SiRNA1组76.1％★81.3％★77.6％★
SiRNA2组33.7％*54.7％*68.2％*SiRNA3组41.9％*56.9％*69.1％*SiRNA4组72.9％★80.7％★78.0％★SiRNA5组43.7％*58.4％*69.1％*SiRNA6组47.6％*53.9％*68.2％*★表示与对照组间有差异(P＜0.05) *表示与对照组间有明显差异(P＜0.01)表3、转染siRNA后各时间点MTT法检测细胞存活率实施例3免疫组织化学法检测bcl-2蛋白(武汉博士得公司生产)的表达。
各组细胞以1.5×105/mL，起始浓度接种于6孔板，内置一1.5×1.5cm的盖玻片，按上述培养方法转染后继续培养48h，弃掉上清。用3∶1甲醇冰醋酸液固定盖玻片15秒，PBS漂洗；4℃1％Tris-Triton 100通透5min，PBS漂洗；过氧化物酶封闭10秒，PBS漂洗；非免疫动物血清封闭10秒，弃去并滴加bcl-2一抗于4℃孵育12h，PBS漂洗；依次加二抗、生物素标记抗体，并PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染核。每一批实验均设有空白对照以PBS代替一抗。
图1～图9是用免疫组织化学法检测bcl-2蛋白的表达，显微镜下观察的各组U251细胞bcl-2蛋白表达形态图。表4显示了各组细胞蛋白表达的差异。
组别阳性率(％)对照组 39.63±7.52反义组 27.14±5.87★脂质体组35.42±8.07SiRNA1组23.26±4.09★SiRNA2组11.32±2.27*SiRNA3组15.44±3.31*SiRNA4组25.61±4.16★
SiRNA5组16.56±1.79*SiRNA6组13.81±2.23*★表示与对照组间有差异(P＜0.05)； *表示与对照组间有明显差异(P＜0.01)表4各组免疫组化bcl-2的蛋白表达实施例4RT-PCR(上海申能博彩公司)检测转染细胞bcl-2mRNA表达水平。
各组细胞以1.5×105/L起始浓度接种于6孔板，按实施例2所述培养方法转染后继续培养12h，胰酶消化离心收集。应用上海申能博彩有限公司细胞总RNA抽提纯化试剂和RT-PCR试剂盒测定bcl-2mRNA的水平bcl-2引物序列如下5`端引物CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC，3`端引物CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC扩增产物为318bp。RNA提取先后用RNA提取液(生命技术公司)、氯仿、异丙醇、75％乙醇，分离沉淀洗涤，具体步骤按其说明书进行。最后RNA沉淀，用适量DEPC处理的无菌去离子水，56℃水浴助溶，取少量RNA测OD值定量(OD260/OD280比值＞1.8)和用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)电泳观察28S和18SrRNA两条清晰带，以确保提取RNA的纯度和完整性。(2)cDNA合成以及PCR扩增，严格按反转录试剂盒说明书进行。以β-actin为内参照，94℃变性30秒；60℃退火1分钟；72℃延伸1分钟。循环30次后，72℃延伸5分钟。电泳产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上观察并照相，于Gel-Doc1000型紫外凝胶图像分析仪上观察、分析，计算Bcl-2与β-actin扩增带的比值，并摄片，见图10。取RT-PCR产物5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳，结果发现空白和脂质体对照组、反义组318bp处见清晰条带，siRNA各组条带均有减弱，以2、3、5、6组明显。各组内对照β-actin条带一致。说明siRNA转染后抑制细胞bcl-2的表达。
实施例5、流式细胞仪观察细胞转染后周期变化各组细胞以1.5×105/L起始浓度接种于25cm2培养瓶，按实施例2所述培养方法转染后继续培养48h，胰酶消化离心收集并悬于PBS中，4℃用70％乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙锭的染色液染色30min，流式细胞仪(EPICS-ELITE-ESP)测定DNA含量的变化，用MULTICYCLE软件处理结果。结果表明，siRNA2、3、5、6组细胞生长阻滞于S期，见图11～图19及图20。
实施例6、siRNA在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明所得siRNA2、siRNA3、siRNA5、siRNA6用于制备治疗肿瘤或白血病的药物。用于人类体内给药，可单独使用或与其它药物联合使用。
抑制bcl-2基因表达的siRNA双链及其应用.ST25SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>抑制bcl-2基因表达的siRNA双链及其应用<130>
<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA1序列的正义链<400>1aacagcttat aatggatgta ccctgtctc 29<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA1序列的反义链<400>2aagtacatcc attataagct gcctgtctc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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抑制bcl-2基因表达的siRNA双链及其应用.ST25<210>5<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA3序列的正义链<400>5aaagtcatcc acagggcgat gcctgtctc 29<210>6<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA5序列的正义链<400>9aacaggttgg gagtgaacgc tcctgtctc 29
抑制bcl-2基因表达的siRNA双链及其应用.ST25<210>10<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA5序列的反义链<400>10aaagcgttca ctcccaacct gcctgtctc 29<210>11<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA6序列的正义链义链<400>11aattggatgt gctttgcatt ccctgtctc 29<210>12<211>29<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据Ambion公司设计软件设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA6序列的反义链<400>12aagaatgcaa agcacatcca acctgtctc 29
权利要求
1.一种抑制bcl-2基因表达的siRNA双链(siRNA2)，其序列为反义链5’-AAG CCG GCG ACG ACT TCT CCC CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAG GGA GAA GTC GTC GCC GGC CCT GTC TC-3’。
2.一种抑制bcl-2基因表达的siRNA双链(siRNA3)，其序列为反义链5’-AAC ATC GCC CTG TGG ATG ACT CCT GTC TC-3，正义链5’-AAA GTC ATC CAC AGG GCG ATG CCT GTC TC-3’。
3.一种抑制bcl-2基因表达的siRNA双链(siRNA5)，其序列为反义链5’-AAA GCG TTC ACT CCC AAC CTG CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAC AGG TTG GGA GTG AAC GCT CCT GTC TC-3’。
4.一种抑制bcl-2基因表达的siRNA双链(siRNA6)，其序列为反义链5’-AAG AAT GCA AAG CAC ATC CAA CCT GTC TC-3’，正义链5’-AAT TGG ATG TGC TTT GCA TTC CCT GTC TC-3’。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的siRNA双链用于制造治疗肿瘤和白血病的药物。
全文摘要
本发明公开了四组siRNA双链序列，它们可抑制bcl－2抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Bcl－2蛋白表达和翻译，从而减少Bcl2蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，是很好的抗白血病和肿瘤细胞耐药性的小分子双链核酸药物。
文档编号C07H21/00GK1587406SQ20041005119
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者张洹, 胡海燕 申请人:暨南大学