一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海洋生物活性多肽的制备方法，尤其涉及一种赤魟软骨多肽类血 管生成抑制因子快速制备方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成，采用抗血管疗法治疗肿瘤具有高 效、低毒、不易产生耐药性的优点。因此，寻找活性显著地血管生成抑制因子成为抗肿瘤药 物的研宄热点。肿瘤血管生成受多种因子影响，而血管内皮生长因子（VEGF)是最重要的 血管生成因子，也是内皮细胞VEGF信号转导的主要执行者，直接参与新生血管形成过程。 研宄表明VEGF必须通过与位于细胞膜上的特异性受体VEGFR-2结合来发挥作用，因而以 VEGFR-2为靶点进行药物筛选成为抗肿瘤血管生成的重要策略。
[0003] 制备和筛选方法在抗肿瘤药物研宄中非常重要，而常规的方法费时长，所得到的 活性物质假阳性率高，而比较理想的制备和筛选方法应是将制备方法和筛选方法有效结 合，最大限度地保证抗肿瘤药物研发的成功率。
[0004] 软骨鱼软骨富含多种抗肿瘤活性物质，主要包括血管生成抑制因子、抗肿瘤因子 和抗入侵因子，但目前尚未得到有效利用。虽已有报道从赤魟、孔鳐等软骨中制备血管生成 抑制因子，但得到的活性物质因为分子量大，含量低，而难以进行药物开发。
[0005] 基于以上现状，本发明以赤魟软骨为材料，采用酶解和细胞膜色谱技术建立了肿 瘤血管生成抑制因子的快速制备方法，并提供一种活性显著的赤魟软骨多肽类血管生成抑 制因子。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的快 速制备方法。
[0007] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种赤魟软骨多肽类血管生成 抑制因子的快速制备方法，其包括以下步骤： 1) 细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体（VEGFR)高表达的、处于对数 生长期的肿瘤细胞，采用MEM培养基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % 0)2培养箱内培养。 当细胞计数达到IO5~IO7时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4°c、1000 r/min离心10~ 15 min，取沉淀用生理盐水清洗2次后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声25~30 min 破碎细胞，将悬液于1000 r/min、4°C条件下离心5~10 min，取上清液于12000 r/min、4°C 条件下离心20~25 min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗2~3次后，加入生理盐水 至膜蛋白含量为2. 0~2. 3 mg/mL，即为细胞膜悬液； 2) 细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温（4°C)反应管中，在振 荡条件下，按照固液比Ig :25~30 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15~20 h，超 声研磨20~25 min后，于4000 r/min离心10~15 min，收集沉淀，用生理盐水洗绦2~ 3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相； 3) 赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比I g:10~15 mL加入 到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提44~48 h后，于4 °C、10000 r/min离心15~ 20 min，取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，用双蒸水于4 °C以下透析22~24 h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比I g :15~20 mL加入到巴 比妥钠-盐酸缓冲液（pH 7. 0)中，按照赤魟软骨蛋白质量的1. 5~2. 5%加入中性蛋白酶 (酶活力彡1.0XlO5 U/g)，酶解温度55~65 °C，酶解3~4 h，将溶液升温至90~95°C， 并于此温度保持10~15 min，温度降至35~40 °C，用NaOH调pH至7. 5~8. 0,按照赤 魟软骨蛋白质量的1.5~2. 5%加入胰蛋白酶(酶活力彡1.9X IO4 U/g)，酶解温度为35~ 40 °C，酶解3~4 h，将溶液升温至90~95°C，并于此温度保持10~15 min，于10000 r/ min、4°C条件下离心15~20 min，取上清液，上清液采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集 分子量小于I kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24 h，冻干，得酶解 物活性组分； 4) 赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成 0. 03~0. 05 mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比I g: IOmL加入到活性组分溶液中， 35~40°C保温孵育2~3 h后，4000 r/min离心10~15 min，留取上清液，沉淀用三蒸 水淋洗8~10次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立 酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异 峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用测定，活性最强峰经蛋白/多肽序 列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)，ESI-MS检测分子 量为 865. 98 Da。
[0008] 优选，所述1)中的肿瘤细胞为肝癌细胞Bel-7402 ; 优选，所述2)中大孔球形硅胶的预处理方法为：将大孔球形硅胶(规格：5 μm，200A) 中加入适量HCl溶液（I mol/L)，超声处理15~20 min，转移至圆底烧瓶瓶中搅拌回流水 解2~3 h后，将硅胶移至烧杯中，加双蒸水洗涤3~5次，每次25~30 min。将洗涤处理 好的大孔球形硅胶减压抽干，于120 °C下活化6~8 h。
[0009] 优选，所述4)中RP-HPLC条件为：进样量为5~10 μ L ;色谱柱为Amethyst C18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);洗脱条件为0~40 min内乙腈浓度由10%勾速升至50%;流 速0· 4 mL/min ;紫外检测波长为215 nm。
[0010] 本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种赤魟软骨多肽类血 管生成抑制因子的应用，其特征在于Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)对鸡胚绒 毛尿囊膜（CAM)血管生成具有显著抑制作用，Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)具 有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进、快速、准确度高，制 得的血管生成抑制因子活性显著，可用于肿瘤疾病的治疗。
[0012]
【附图说明】
[0013] 图1是本发明步骤示意图； 图2是本发明的酶解物活性组分（A)和细胞膜吸附剩余物（B)的RP-HPLC指纹图谱。 [0014]
【具体实施方式】
[0015] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016] 实施例：一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：赤 魟软骨一组织破碎一盐酸胍抽提一超滤一细胞膜固定相吸附一HPLC指纹图谱比较分析一 血管生成抑制因子。
[0017] 1)细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体（VEGFR)高表达的、处于 对数生长期的肝癌细胞Bel-7402,采用MEM培养基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % CO2培养箱内培养，当细胞计数达到IO7时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4°C、1000 r/min 离心10 min，取沉淀用生理盐水清洗2遍后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声30 min破 碎细胞。将悬液于1000 r/min、4°C条件下离心5 min，取上清液于12000 r/min、4°C条件 下离心25 min，得到细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗3次后，加入生理盐水至膜蛋白含 量为2. 2 mg/mL，即为细胞膜悬液； 2)细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温（4°C)反应管中，在振 荡条件下，按照固液比Ig :25 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15 h，超声研磨25 min后，于4000 r/min离心15 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤3次，除去未结合的细胞膜， 得Bel-7402细胞膜固定相。
[0018] 3)赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比I g : 15 mL加 入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提48 h后，于4 °C、10000 r/min离心15 min， 取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，用双蒸水于4 °C以下透析24 h，透析液冷 冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比I