与磷脂酰丝氨酸结合的fc融合构建体及其治疗用途的制作方法

专利名称：：与磷脂酰丝氨酸结合的fc融合构建体及其治疗用途的制作方法与砩脂酰丝氨酸结合的Fc融合构建体及其治疗用途发明背景本申请要求于2005年1月24日提交的共同未决的美国临时申请系列号60/646，333的优先权，该临时申请的公开内容，包括说明书、权利要求、附图和序列，特别引入本文作为参考而并未放弃。1.发明领域本发明涉及磷脂酰丝氨酸生物学领域，以及涉及治疗肿瘤和病毒感染。它提供了不寻常的新构建体、组合物、方法和组合，其用于肺瘤血管靶向和癌症治疗，和用于治疗病毒感染及其他疾病。本发明特别提供了具有不寻常的特性组合的新型结合磷脂酰丝氨酸的构建体，及其诊断和治疗缀合物。所述新型构建体有效地结合磷脂酰丝氨酸疾病靶并增强其破坏，并还可以将治疗剂递送至特定位点，因此提供了一系列用于治疗癌症、病毒感染和其他疾病的方法。2.相关领域的描述肿瘤细胞对化学治疗剂的抗性在临床肿瘤学中是一个重要问题。在肿瘤治疗中要解决的另一主要问题是期望"全部细胞杀死"，即，杀死所有能不受控制地生长并替代通过治疗可去除的任何肿瘤块的所谓"克隆形成性"恶性细胞。尽管在此领域内有了一定的进展，但这仍是为何许多普遍形式的人类癌症依然耐受有效的化学治疗干预的两个主要原因。对于开发接近"全部细胞杀死"的疗法这一目的而言，某些类型的肿瘤比其他类型更易受治疗的影响。例如，软组织肺瘤(例如淋巴瘤)以及血液和造血器官肺瘤(例如白血病)通常比实体瘤(例如癌)对化学疗法更具有反应性。软组织肿瘤和基于血液的肿瘤对于化学疗法的易感性的一个原因是淋巴瘤和白血病细胞对于化学治疗干预的更大的可达性。简而言之，大部分化学治疗剂到达实体瘤块的所有细胞比到达软组织肿瘤和基于血液的肿瘤的所有细胞要难得多，因此完成全部细胞杀死也要困难得多。增加化学治疗剂的剂量在大部分情况下常常会导致毒副作用，这通常限制了常规抗肿瘤剂的效力。另一肿瘤治疗策略是使用"免疫毒素，，，其中用抗肿瘤细胞抗体将毒素递送至胂瘤细胞。不过，和化学治疗方法一样，免疫毒素疗法在应用于实体瘤时也存在着明显的缺点。例如，抗原阴性或抗原缺乏性细胞能存活并再恢复生成肿瘤或导致进一步的转移。实体瘤对基于抗体的疗法有耐受性的另一原因是肿瘤块对于大分子试剂例如抗体和免疫毒素来说通常是不能渗透的。肿瘤内的物理扩散距离和间质压力都是对此类型疗法的重要限制因素。一种经改良的治疗策略是耙向实体瘤的血管结构。靶向肿瘤血管而非肿瘤细胞本身具有一定的优越之处，即不太可能导致抗性肿瘤细胞的形成，而且被靶向的细胞容易接近。此外，血管的破坏导致抗肿瘤效应的扩大，因为许多肿瘤细胞依赖单一血管来提供其氧气和养分。示例性的血管靶向剂(VTAs)在美国专利号5,855,866、5，965，132、6,261,535、6，051，230和6，451，312中得到描述，这些文献描述了将抗细胞剂和毒素靶向递送至肿瘤血管结构的标记物。另一有效的血管靼向方法是将凝血因子耙向在肺瘤血管结构或基质中表达或吸附的标记物(Huang等人，1997;美国专利号6，093，399、6，004,555、5，877，289和6，036，955)。将促凝剂而非毒素递送至肿瘤血管结构具有另外的优越之处，即降低了免疫原性，并甚至减少了产生毒副作用的风险。如美国专利号5,877,289中所公开的，用于此类肿瘤特异性"凝血配体(coaguligand)"中的优选凝血因子是截短形式的人凝血诱导蛋白质，组织因子(TF)，其是血液凝固的主要起始因子。最近，磷脂酰丝氨酸(PS)被鉴别为肿瘤血管结构的特异性标记物(Ran等人，1998)。这引起了对用于递送抗细胞剂、毒素和凝血因子至肿瘤血管的新型抗PS免疫缀合物的开发(美国专利号6，312，694、6，783，760和6，818，213)。此外，还发现未缀合的针对PS的抗体无需与治疗剂附着就可发挥抗癌作用，这已知为用于肿瘤血管靶向和治疗的磷脂酰丝氨酸"棵露抗体"方法(美国专利号6,406,693)。尽管前述方法已促进了肿瘤治疗技术的发展，但仍需要开发另外的治疗和血管靶向剂以扩展治疗选择的数目和功效。重要的进展将是鉴定具有抗癌特性及在其他系统例如在治疗病毒感染中的疗效的一组治疗剂。产生可以由两种人组分制备的新型靶向构建体，特别是不依赖于使用用于靶向的抗体的那些构建体，将是重要的发展，其提供了经改善的安全性。设计和开发增强患者自身针对疾病的应答，即增加宿主效应器功能的新试剂，将在治疗应答最大化中具有重大价值，特别是其中相同机制可以影响癌症及其他疾病例如病毒感染和疾病。发明概述本发明通过提供新型构建体、组合物、方法和组合用于肿瘤血管结构乾向和癌症治疗和用于治疗病毒感染及其他疾病，从而解决了现有技术的前述和其他需要。本发明特别提供了具有不寻常的特性组合的新型结合磷脂酰丝氨酸的构建体，它有效地结合疾病中的磷脂酰丝氨酸靶并增强其破坏，例如通过增加宿主效应器功能。还提供了一系列的缀合物组合物，其中所述新型构建体附着至其他的生物学试剂、诊断剂和治疗剂，它们可以被特异地递送至疾病位点。本发明进一步提供了在肿瘤血管结构靶向、癌症治疗中使用所述新型构建体和缀合物及其组合以及用于治疗病毒感染和其他疾病的有效方法。当用于整个申请文件各处时，术语"a"和"an"用于指"至少一种(个)"、"至少第一种(个)"、"一种(个)或多种(个)，，或"众多"的所提及的组分或步骤，除非在其后特别说明了上限。因此，如本文所使用的，"aconstruct"指"至少第一种构建体"。正如任何单一试剂的量一样，本领域普通技术人员根据本公开内容将了解各组合的可操作限度和参数。受体-抗体(ReceptorBody)和0_抗体(BetaBody):本发明首先提供了一系列结合磷脂酰丝氨酸的构建体组合物，其中所述构建体包含可操作地附着至至少第一种抗体Fc区的至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽或受体。连接磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽或"受体"至"抗体"Fc区产生了术语"受体-抗体"，这在本文中用于指本发明的结合磷脂酰丝氨酸的Fc构建体。本发明构建体或受体-抗体一般包含至少第一种抗体Fc区，其可操作地附着至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽、受体、配体或肽。在本文中简洁地使用的术语"磷脂酰丝氨酸结合蛋白"指所有磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽、受体、配体和肽。在许多实施方案中，"磷脂酰丝氨酸结合蛋白"在附着至抗体Fc区从而形成本发明构建体时将保留磷脂酰丝氨酸结合特性。自然，磷脂酰丝氨酸结合功能的保留在希望用于靶向暴露于疾病位点中的磷脂酰丝氨酸的那些构建体中是重要的。然而，不是本发明的所有实施方案都局限于在附着至抗体Fc区时保留磷脂酰丝氨酸结合特性的磷脂酰丝氨酸结合蛋白。值得注意的是，本发明包括了与"带切口的p2-糖蛋白I"连接的抗体Fc区，其中带切口的P2-糖蛋白I不再结合磷脂酰丝氨酸(参见下文)。因为带切口的P2-糖蛋白I已知是血管发生的抑制剂(美国专利申请公开号US2003/0219406,将其特别引入本文作为参考)，所以本发明的"Fc-带切口的P2"将用作血管发生的抑制剂，并且有着具有延长的半衰期以及必要时具有另外的效应器功能的优点。相应地，术语"磷脂酰丝氨酸结合蛋白"指在本发明构建体中使用的蛋白质、多肽、受体、配体或肽的起源，虽然如上文所阐述的，本发明的某些构建体将不结合磷脂酰丝氨酸并且仍将具有重要的生物学和治疗用途。也就是说，P2-糖蛋白I已知为磷脂酰丝氨酸结合蛋白，而带切口的P2不再结合磷脂酰丝氨酸。在结合磷脂酰丝氨酸的情况下，最初的磷脂酰丝氨酸结合蛋白和所得构建体的磷脂酰丝氨酸结合蛋白将在生物学合适的条件下，优选在生理条件下，结合磷脂酰丝氨酸。这样的磷脂酰丝氨酸结合蛋白在生物学合适的条件下，优选在生理条件下，可以任选地结合其他阴离子磷脂。在某些优选实施方案中，构建体的磷脂酰丝氨酸结合蛋白基本上不结合氨基磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)。在其他优选实施方案中，构建体的磷脂酰丝氨酸结合蛋白不显示可检测的与磷脂酰乙醇胺的结合。一系列磷脂酰丝氨酸结合蛋白可以在本发明构建体中使用。可以使用的某些示例性磷脂酰丝氨酸结合蛋白包括蛋白C、蛋白S、因子n(凝血酶原)、因子v、因子vn、因子ix或因子x。可以使用的其他示例性磷脂酰丝氨酸结合蛋白包括Mer、PS结合性清道夫受体、asP3整联蛋白、CR3补体受体、CR4补体受体和磷脂酰丝氨酸受体即PSr(Balasubramanian和Schroit,2003，将其特别引入本文作为参考，特别参见表2)。在本发明构建体中可以使用的其他示例性磷脂酰丝氨酸结合蛋白是膜联蛋白，优选膜联蛋白V，其被特别考虑在某些实施方案中使用，例如在进一步的缀合物、脂质体等中。然而，在某些实施方案中，本发明提供了包含可操作地附着至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白的抗体Fc区的构建体，其中所述磷脂酰丝氨酸结合蛋白不是膜联蛋白或其磷脂酰丝氨酸结合片段，即，不是膜联蛋白V或其磷脂酰丝氨酸结合片段。在本发明构建体中使用的磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽和肽的优选实例是P2-糖蛋白I(P2-糖蛋白I或P2GPI)蛋白、多肽和肽。将"P"2-糖蛋白I结合蛋白、多肽或肽连接至"抗体"Fc区产生了术语"p-抗体"，这在本文中用于指优选的本发明的Fc-P2GPI构建体。以前被称为载脂蛋白H的02GPI是结合磷脂酰丝氨酸的50kDa血浆糖蛋白。来自各种哺乳动物种类的P2GPI的DNA和氨基酸序列是已知的，包括小鼠、大鼠、狗、牛、黑猩猩和人I32GPI。P2GPI有5个结构域，I、II、III、IV和V，并且结构域结构在哺乳动物之间是保守的，如在图18A和图18B中分别显示的小鼠和人P2GPI的结构域I-V所呈现的。P2GPI通过其C末端结构域即结构域V结合磷脂酰丝氨酸。因为来自P2GPI结构域V的脂质和磷脂酰丝氨酸结合区域是已知的，所以本发明构建体的磷脂酰丝氨酸结合部分只需包含"来自P2GPI结构域V的脂质结合区域"。示例性地参考图18B中显示的在本文中以SEQIDNO:22(登录号1C1ZA)提供的人P2GPI氨基酸序列，和图18A中显示的对应的小鼠P2GPI序列，可看出来自P2GPI结构域V的脂质结合区域包括一串带正电荷的氨基酸(282-287)和保守的疏水区(311-317)，其负责P2GPI与阴离子磷脂的结合(图18B和图18A中带下划线的斜体字和带双下划线的斜体字)因此，在某些实施方案中，本发明构建体的磷脂酰丝氨酸结合部分将包括具有如SEQIDNO:22的氨基酸282-287所示的氨基酸序列的肽、或具有如SEQIDNO:22的氨基酸311-317所示的氨基酸序列的肽。在其他实施方案中，本发明构建体的磷脂酰丝氨酸结合部分将包括跨越这些区域的肽，即具有SEQIDNO:24(人)的氨基酸序列的肽或具有SEQIDNO:20(小鼠)的氨基酸序列的肽。因为前述的较小的肽和多肽可能不是最佳的，所以本发明的其他优选构建体是其中磷脂酰丝氨酸结合部分是包含全部或完整的P2GPI结构域V的P2GPI多肽，包括至少包含结构域V的P2GPI多肽和只包含结构域V的那些。尽管不存在关于本发明方法的安全性的担心，但来自具有抗磷脂综合征或APS的患者的抗体通常识别P2GPI的结构域I(deLaat等人，2005a)。识别P2GPI结构域II的抗体不是致病性的。因此，在某些实施方案中，本发明构建体的磷脂酰丝氨酸结合部分可以包括至少包含来自P2GPI结构域V的脂质结合区域且基本上缺乏p2GPI结构域I的P2GPI多肽。在优选的实施方案中，这些构建体将包括至少包含P2GPI结构域V且基本上缺乏P2GPI结构域I的P2GPI多肽。本文提供了示例性的P2GPIDNA和氨基酸序列，包括图18B中所显示的SEQIDNO:22的人P2GPI氨基酸序列(登录号1C1ZA)，和图18A中所显示的对应的小鼠P2GPI氨基酸序列(SEQIDNO:25中还提供了编码本发明的示例性Fc-p2GPI构建体的表达质粒的序列)。根据这些图、序列和登录号，任选地按照本文的操作实例，本领域技术人员将能够制备并使用一系列至少包含P2GPI结构域V的多肽。如上文所阐述的，某些优选的p2GPI多肽将至少包含P2GPI结构域V且基本上缺乏e2GPI结构域I。与这种描述相一致的P2GPI多肽可以至少包含02GPI的结构域IV和结构域V;至少包含P2GPI的结构域III、结构域IV和结构域V;或包含P2GPI的结构域II、结构域III、结构域IV和结构域V。然而，02GPI结构域I的存在不是本发明用途中的重要缺点，并且可以方便地制备其中P2GPI多肽包含结构域I的构建体，例如为了易于制备和使用。因此，本发明进一步包括其中磷脂酰丝氨酸结合部分是全长P2GPI多肽(即，包含结构域I、结构域II、结构域III、结构域IV和结构域V的P2GPI多肽)的构建体。全长P2GPI多肽可以是包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的人P2GPI多肽。在本发明的某些实施方案中，重要的是在所述至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白附着至Fc区时，所述构建体保留了磷脂酰丝氨酸结合功能，特别是当所述构建体希望用于靶向暴露于疾病位点中的磷脂酰丝氨酸时。磷脂酰丝氨酸结合不是必需的一个实例是将至少第一种带切口的P2GPI多肽附着至抗体Fc区的情况，它将具有作为血管发生抑制剂的用途。"带切口的(nicked)，，P2GPI多肽是指其中P2GPI序列已形成切口的情况，例如通过用纤维蛋白溶酶在Lys317/Thr318切割位点处进行切割。如本文所使用的，包含"带切口的P2GPI多肽"的构建体可以只包含带切口的结构域V。备选地，带切口的p2GPI多肽可以至少包含"带切口的结构域V"，从而使得所述多肽可以包含与结构域IV、III、II和I中任何一个或多个相结合的带切口的结构域V。当在本发明的构建体中需要保留磷脂酰丝氨酸结合时，本发明提供了与附着至Fc区的p2GPI多肽的用途相关的进一步的不寻常和有利的特征。惊奇地发现，当抗体Fc区可操作地附着至两个P2GPI多肽时，P2GPI多肽在所得的Fc-P2GPI构建体中形成了二聚体，并且该二聚构建体有效地结合磷脂酰丝氨酸。因此，本发明的另外的实施方案是其中抗体Fc区可操作地附着至两个^2GPI多肽的情况，优选其中每个(32GPI多肽至少包含P2GPI的结构域V。更优选地，其中抗体Fc区可操作地附着至两个P2GPI多肽(其各至少包含P2GPI的结构域V)，并且其中P2GPI多肽在附着至Fc区时形成二聚体。优选地，其中抗体Fc区可操作地附着至两个P2GPI多肽(其各至少包含P2GPI的结构域V),并且其中P2GPI多肽在附着至Fc区时形成二聚体和其中所得构建体结合磷脂酰丝氨酸，即所述P2GPI多肽在附着至Fc区时形成二聚体并结合磷脂酰丝同样地，优选地，其中抗体Fc区可操作地附着至两个P2GPI多肽；其中所述p2GPI多肽各至少包含p2GPI的结构域V且基本上缺乏P2GPI的结构域I;并且其中P2GPI多肽在附着至Fc区时形成二聚体并结合磷脂酰丝氨酸。此外，优选地，其中第一种和第二种P2GPI多肽(其各至少包含P2GPI的结构域V)可操作地附着至抗体Fc区，从而形成Fc-P2GPI二聚体。然而，即使当在本发明的包含P2GPI的构建体中需要磷脂酰丝氨酸结合时，构建体也不必包含两个P2GPI多肽，在附着至Fc区时任何两个或更多个P2GPI多肽也不必形成二聚体。例如，Fc区可以附着至单个P2GPI多肽、或附着至在被附着时不形成二聚体的两个或更多个I32GPI多肽，并且所得构建体仍可用于结合磷脂酰丝氨酸，例如通过在提供所需的价的支架中的制剂。此类制剂或支架的实例是包含所述构建体的纳米颗粒、脂质体等。对于在人中的使用，任何磷脂酰丝氨酸结合蛋白例如一个或多个卩2GPI多肽应当是人磷脂酰丝氨酸结合蛋白，例如人P2GPI多肽。因为也可使用人Fc区，所以这具有提供完全为人的治疗剂的优点，这可以减少副作用，例如与免疫原性相关的那些。在本发明中使用的Fc区来源于抗体或"免疫球蛋白"，包括多克隆和单克隆抗体。Fc区提供了能够刺激宿主效应器功能的所得构建体，以便增强疾病治疗。尽管优选在人中使用人Fc区，但也可使用来自其他来源例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴子等的Fc区。对于临床前测试，Fc区和磷脂酰丝氨酸结合蛋白均可以选自与在其中将进行临床前测试的动物相同的动物种类，例如小鼠Fc区和小鼠02GPI多肽。在本领域中，抗体一般描述为"Y"形分子，其由4个多肽(2个重链和2个轻链)制成。给予抗体其结合抗原的特异性的抗原结合区或"可变区"位于轻链和重链的末端。用蛋白酶处理抗体可以切开这个区域，产生分开的Fab("抗原结合片段(fragmentantigenbinding)")和Fc(可结晶片段(fragmentcrystal1izable))区域、结构域或片段。因此，术语"Fc"在本领域中用于指"不含抗原结合区域、结构域或片段"的抗体区域、结构域或片段。这是本申请中所希望的含义，从而所述构建体的"Fc区"是"不包含抗原结合区域、结构域或片段"(即不特异性地结合抗原)的抗体区域、结构域或片段。因此，本发明提供了构建体，其具有不会由于靶向组织而复杂化的效应器功能。恒定区决定用于破坏抗原的机制，即包含效应器功能的决定簇。基于其恒定区结构和免疫功能将抗体分为5个主要的类别，IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为iu、y、ct、5和s。这些类别中的几个类别进一步分为亚类或同种型，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构是众所周知的。重链y、a和5的恒定区有3个结构域，而重链ju和s的恒定区有4个结构域。在本发明构建体中，优选使用具有抗体铰链区以及抗体重链恒定结构域CH2和CH3的抗体Fc区。抗体铰链区对于结构方面的考虑例如弹性可能是重要的，这在附着了两个或更多个磷脂酰丝氨酸结合蛋白例如两个或更多个P2GPI多肽时可以促进二聚体的形成。铰链区和铰链连接或低级铰链区还可提供效应器功能。尽管这不是必需的，但构建体的Fc区还可包括抗体重链恒定结构域CU或CH4中的至少一个。按照所提供的效应器功能，例如补体激活(Clq结合)、Fc受体结合、以及有效刺激诸如ADCC和细胞裂解的过程的能力(Bruggemann等人，1987;Riechmann等人，1988;Clark，1997;Padlan，1994;各自特别引入本文作为参考)，一般优选地，所述抗体Fc区是来自人IgGl(Yl)或人IgG3(y3)抗体的Fc区。对于小鼠抗体，所述Fc区优选是来自小鼠IgG2a(y2a)或小鼠IgG2b(y2b)抗体的Fc区。抗体Fc区将通过任何可操作的方法附着、连接或缀合至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白，例如P2GPI多肽。例如，通过直接的共价键，例如经由化学交联剂，或者其中抗体Fc区和磷脂酰丝氨酸结合蛋白通过重组表达为融合蛋白来制备。可以使用间接附着，例如抗生物素蛋白-生物素及其他这样的附着。Fc区和磷脂酰丝氨酸结合蛋白可操作地附着或缀合，从而使得Fc区和磷脂酰丝氨酸结合蛋白在附着或缀合后各自如所希望的那样充分起作用。例如，"可操作地附着"表示，Fc区基本上保留了所希望的效应器功能，并且磷脂酰丝氨酸结合蛋白基本上保留了所希望的特性，特别是在需要时保留磷脂酰丝氨酸结合或抗血管发生活性。在某些实施方案中，"可操作地附着"将包括将磷脂酰丝氨酸结合蛋白以有效允许磷脂酰丝氨酸结合蛋白在被附着时形成二聚体的方式附着至Fc区，特别是当磷脂酰丝氨酸结合蛋白是两个或更多个卩2GPI多肽时。在其他实施方案中，"可操作地附着"将产生磷脂酰丝氨酸结合蛋白的簇集。当所选择的磷脂酰丝氨酸结合蛋白是P2GPI多肽时，和/或当在Fc区上的二聚化作用是特别需要的时候，一般优选使用Fc区作为构建体的N-末端部分并附着磷脂酰丝氨酸结合蛋白或P2GPI多肽以成为构建体的C-末端部分(图16)。然而，也考虑了可操作地附着的其他方案，从而使得磷脂酰丝氨酸结合蛋白或P2GPI多肽成为构建体的C-末端部分，即插入磷脂酰丝氨酸结合蛋白或P2GPI多肽以替代抗原结合区域或替代CJ结构域和抗原结合区域。在此类实施方案中，优选使用为所得构建体提供另外弹性的肽或化学接头，例如具有4个谷氨酰胺残基和1个丝氨酸残基的肽接头(G4S弹性接头)。在可操作地附着两个或更多个组分后，所得构建体将显示所希望的生物学特性。示例性的总体上在构建体中所希望的生物学特性包括结合磷脂酰丝氨酸；刺激宿主的效应器功能；靶向活化的细胞上的磷脂酰丝氨酸，所述活化的细胞例如为活化的、正在分裂的、受损害的或细胞凋亡的内皮细胞、肿瘤细胞或受病毒感染的细胞；定位至靶位点，例如肺瘤血管和肿瘤细胞；和发挥疗效，例如抗癌和/或抗病毒效用。所得构建体的生物学特性还将优选包括希望的安全性特征。例如，构建体将优选不会显著损害休眠细胞，显著抑制体外凝血反应，引起体内显著的血栓形成或具有显著的狼疮抗凝剂活性。因此，本发明提供了在治疗癌症、病毒感染和其他疾病中有效的新型受体-抗体和P-抗体构建体。这些构建体包括有效地结合疾病中的磷脂酰丝氨酸乾并通过增加宿主效应器功能而增强其破坏的那些。另外的缀合物、组合物和试剂盒尽管单独时是高度有效的，但本发明还提供了进一步的缀合物、组合物和相关方法，其中本发明的构建体、受体-抗体和p-抗体进一步附着至另外的生物学试剂、诊断剂和治疗剂。本发明的此类"另外的缀合物"是"三功能试剂"，因为它们具有三种性质结合磷脂酰丝氨酸、刺激宿主效应器功能和将所附着的生物学试剂、诊断剂或治疗剂递送至希望的乾。在根据本发明的缀合物、组合物、药物、组合、混合物(cocktai1)、试剂盒、第一种和第二种医学用途和所有方法的下列描述中，"构建体"包括上述主要发明的所有构建体、受体-抗体和p-抗体。在另外的缀合物实施方案中，本发明还进一步提供了新类别的缀合物、组合物、试剂盒和方法，其中原始构建体、受体-抗体或p-抗体可操作地附着至"另外的"、进一步的或外源性的生物学试剂、诊断剂或治疗剂。"外源性的"生物学试剂、诊断剂或治疗剂是"不同于在原始构建体中已经存在的Fc结构域的试剂"。另外的或外源性的"生物学试剂"不必直接是治疗剂或诊断剂。例如，因为本发明可以与药物前体联合使用，包括ADEPT实施方案，所以生物学试剂可以是切割实质上无活性的药物前体以释放实质上有活性的药物的试剂，优选酶。此类试剂和酶在下文中涉及药物前体和ADEPT方法实施方案时进行描述。关于"诊断剂"，用于附着的优选诊断剂是体内诊断、成像或可检测的试剂。此类诊断缀合物可以用于一系列疾病的凋亡前细胞和凋亡细胞成像中，用于组合的肿瘤成像和治疗中，和用于使用本发明作为替代标记物以监测化学疗法的方法中。优选的诊断剂包括X射线可检测的化合物、放射性离子、核磁自旋共振同位素和CEST或paraCEST试剂。合适的可检测标记包括X射线可检测的化合物，例如铋(III)、金(III)、镧(III)或铅(II);放射性离子，例如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、》典123、不典125、硪131、汞197、汞2。3、铼186、铼188、铷97、铷m、锝，或钇9°;核磁自旋共振同位素，例如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、钆(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或镱(III);或者罗丹明或萤光素。关于"治疗剂"，某些优选的治疗剂是细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗细胞剂和抗癌剂。因此可以将本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体连接至至少笫一种化学治疗剂、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗生素、放射性同位素或促凝剂。在细胞毒性剂中，目前优选的是蓖麻毒素、白树毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌毒素和百曰咳毒素。在细胞因子和趋化因子中，目前优选的试剂是IL-2、IL-12、TNF-oc、干扰素-oc(IFN-a)、IFN-P、IFN-y和LEC(肝表达的趋化因子)。V型ATP酶抑制剂也是目前优选的，例如salicylihalamide、刀球肮霉素或巴弗洛霉素，还优选的是蛋白质合成抑制剂，例如psymberin、青腰虫素、irciniastatinA。红豆杉醇、多西他赛、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、考布他汀、多柔比星和阿霉素是目前优选的抗癌剂。砷放射性同位素目前也优选作为另外的或外源性的试剂。就促凝剂而言，截短的组织因子是目前优选的。本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体还可进一步可操作地附着至抗病毒剂或药物，例如核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂。AZT、西多福韦和利巴韦林目前优选作为外源性的抗病毒剂。再次，在另外的缀合物实施方案中，术语"缀合物"用于定义原始构建体、受体-抗体或P-抗体和另外的试剂的可操作的联接，并且不希望单指任何类型的可操作的联接，并且不特别限于化学"缀合"。还可使用重组融合蛋白。只要磷脂酰丝氨酸结合蛋白、Fc区和另外的所附着的试剂如希望的那样充分起作用，特别是当递送至体内靶位点时，任何形式的附着都是合适的。当P2GPI多肽用作构建体的磷脂酰丝氨酸结合蛋白时，一般优选在P2GPI结构域V中，或至少在结构域V的脂质结合区域中不附着任何另外的试剂。因此为了简单，在某些实施方案中，例如图16中举例说明的那些，优选可操作地将任何另外的试剂附着至构建体的N-末端部分，即朝着铰链区或CH2区。本发明还提供了包含生物学有效量的至少第一种构建体、受体-抗体或P-抗体的组合物。优选的组合物是在药学上可接受的栽体中包含生物学或治疗有效量的至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物的"药物组合物"。这些组合物希望用于药物学、药理学、治疗学、医学和兽医学用途，优选用于治疗癌症和病毒感染。所述药物组合物包括配制用于胃肠外施用的那些，例如用于静脉内施用，或用于作为脂质体或气雾剂进行施用。气雾剂制剂特别适合于治疗病毒感染。药物组合物中的"生物学或治疗有效量"是对于治疗疾病或病症来i兌有效的量，特别是对于治疗癌症或病毒感染来"i兌有效的量。尽管单独使用也是有效的，但本发明的各种构建体、受体-抗体或P-抗体及其缀合物，以及本发明的相关方法，也可有利地用于与其他试剂和疗法相组合以提供本发明的组合的组合物、药物和试剂盒以及相关的组合治疗方法。因此，在进一步的实施方案中，本发明进一步提供了特别的组合的组合物、方法和试剂盒，例如用于癌症和抗病毒治疗，它们已被选择以令人惊讶地好的效果一起工作，如本文更详细地说明的。因此，本发明的方面进一步包括组合物、药物组合物、组合、混合物、药剂和/或试剂的药用混合物，其包括与生物学或治疗有效量的至少第二种生物学试剂相组合的至少第一种本发明的构建体、受体_抗体或p-抗体或者其缀合物。所有此类组合优选包括"组合的生物学或治疗有效量"，例如对于治疗疾病，例如治疗癌症或病毒感染来说有效的组合量。在组合物中，"至少第二种生物学试剂"通常将会是但不必是诊断剂或治疗剂。例如，第二种生物学试剂可以是药物组合物的组分例如分散剂或吸收延迟剂。其他生物学试剂，例如用于制备在药物前体和ADEPT方法中使用的缀合物和药物前体的试剂，和诊断剂，优选保持组合，但与第一种本发明的组合物分开，并因此在下文中关于本发明试剂盒时进行讨论。"组合，但分开"表示一起在紧密的限制中，但不是同一组合物的一部分，例如不是同一溶液或药物组合物的一部分。关于"至少第二种治疗剂"，术语"第二种"是参照作为"第一种，，治疗剂的本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物来说的。当本发明希望用于癌症治疗时，至少第二种治疗剂将优选是"至少笫二种不同的抗癌剂"。用于组合应用的第二种抗癌剂可以是放射治疗剂、化学治疗剂、抗血管发生剂或细胞凋亡诱导剂，细胞因子或抗体或抗体-治疗剂构建体，其结合胂瘤细胞、从坏死的肿瘤细胞中释放的细胞内抗原或肿瘤血管结构的组分(即抗癌免疫毒素或凝血配体)。如本文所使用的，术语"化学治疗剂"包括基因、载体、反义构建体和核酶。用于组合应用的某些优选的第二种抗癌剂是补充或增强第一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物的那些，和/或选择用于特殊的肿瘤类型或患者的那些。"补充或增强疗效的治疗剂"包括放射治疗剂、血管渗透性增强剂、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂、某些细胞因子、抗肿瘤细胞免疫毒素、以及所选择的化学治疗剂。目前优选的"所选择的化学治疗剂，，是具有抗血管发生作用的化学治疗剂，如表E中所示；诱导细胞凋亡的化学治疗剂，如表F中所示；钙流量诱导剂、炎性细胞因子、H202、凝血酶和来自考布他汀家族的抗微管蛋白药物。多柔比星、依托泊苷和放线菌素D是进一步优选的，而多西他赛是最优选的。当本发明希望用于病毒治疗中时，至少第二种治疗剂将优选是"至少第二种不同的抗病毒剂"。用于组合应用的第二种抗病毒剂可以选自在实施本发明时可用的任何抗病毒剂或药物，包括本文描述的用于附着至本发明构建体的一系列抗病毒剂和药物。例如，抗逆转录病毒药物例如NTRIs、非核苷RT抑制剂和蛋白酶抑制剂、表G中所列出的抗病毒剂，并且优选AZT或西多福韦。本发明进一步提供了包含至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物的脂质体、脂质载体、复合物、混合物、超分子结构多分子聚集物或基于脂质的药物递送系统。脂质体或脂质体样组合物可以是单层、双层、多分子聚集物、嚢泡、螺旋、圆盘、管、纤维、环形、六角相、凝胶相、液晶相、液晶多分子聚集物、胶团、反胶团、孩￡乳剂、乳剂、微贮库(microreservoir)、油球、脂肪球、蜡球和/或胶粒的形式。脂质体或脂质体样组合物一般包括"外膜"或大体积(bulk)水相和"中央核"或内部水相。在优选实施方案中，脂质体或脂质体样组合物是隐蔽的脂质体(stealthedliposome)、脂质载体、复合物、混合物、超分子结构多分子聚集物或基于脂质的药物递送系统。"隐蔽的"脂质体和脂质体样组合物包含与外膜可操作地联接的生物学有效量的至少第一种隐蔽剂(stealthingagent)。"隐蔽剂"是在与脂质体或脂质体样组合物的外膜可操作地联接时增加脂质体或脂质体样组合物的生物学半衰期的组分。在"可操作联接"中，脂质体或脂质体样组合物的外膜优选由一种或多种隐蔽剂"包被"。有效的隐蔽剂包括一系列生物相容的亲水聚合物，例如聚胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、多肽和相关材料。优选的隐蔽剂是聚乙二醇(PEG)组分，其中所得的隐蔽的脂质体称为"PEG化的脂质体"。本发明的优选脂质体是隐蔽的或PEG化的脂质体，其中至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物与脂质体的外膜可操作地联接，优选其中脂质体是以其进行"包被的"。特别优选的脂质体是此类"包被的"和隐蔽的或PEG化的脂质体，其中至少第一种治疗剂，例如抗病毒剂或优选抗癌剂，与脂质体可操作地联接或分散在脂质体制剂中。优选地，治疗剂、抗病毒剂或抗癌剂与脂质体的中央核可操作地联接或保持在脂质体的中央核内。示例性的抗癌剂是放射性核素和化学治疗剂，例如抗微管蛋白药物，多西他赛和紫杉醇，多西他赛是优选的。本发明的进一步的实施方案涉及在至少第一种组合物或容器中包括至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物，其与生物学或治疗有效量的至少第二种生物学试剂、组分或系统相组合。"第二种生物学试剂、组分或系统"不限于治疗剂或诊断剂。例如，第二种生物学试剂、组分或系统可以包括用于修饰构建体和/或用于附着其他试剂的组分。某些优选的第二种生物学试剂、组分或系统是药物前体或用于制备和使用药物前体的组分，包括用于制备药物前体本身的组分和用于调节本发明构建体以适合在此类药物前体或ADEPT实施方案中起作用的组分。至少"第二种诊断剂、组分或系统"可以是通过体外诊断测试可直接或间接检测的诊断剂、组分或系统。"可直接检测的体外报告试剂"包括通过免疫荧光和萤光素酶可检测的放射标记、报告试剂。"可间接检测的体外报告试剂"与其他的外源性试剂相结合地起作用，例如与生色底物接触后产生有色产物的可检测的酶。这些包括附着至可直接或间接检测的试剂例如放射标记或酶的"二抗"，以及其中三抗附着至可检测试剂的"二抗和三抗检测系统"。优选的本发明诊断试剂盒是包括通过体内诊断或成像可检测的诊断剂、组分或系统的那些。本发明的成像实施方案的优点是同一构建体可以用于成像和治疗。因此，本发明提供了试剂盒和药物，其包括(a)第一种药物组合物，其包含诊断有效量的可操作地附着至可检测标记或诊断剂的本发明构建体、受体-抗体或P-抗体；和(b)第二种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明构建体、受体-抗体或p-抗体，优选治疗有效量的在笫一种药物组合物中使用的相同构建体、受体-抗体或P-抗体。对于在治疗实施方案中使用，试剂盒将包含"至少第二种治疗剂"。优选地，此类试剂盒包含组合的生物学或治疗有效量的至少两种特定的试剂，例如对于抑制增殖或病毒复制或者对于治疗疾病例如癌症或病毒感染来"i兌有效的组合量。就癌症治疗而言，本发明的试剂盒包含与药物前体和ADEPT组合使用的抗体。在此类组合物中，构建体、受体-抗体或P-抗体"经修饰以提供转化或酶促能力，，。优选地，构建体、受体-抗体或P-抗体与至少第一种能够将至少一种药物前体转化为活性形式的药物的转化剂或酶可操作地联接，优选共价连接或缀合。酶促或酶缀合的构建体、受体-抗体或P-抗体将与最初分开的"药物前体"的制剂相组合。药物前体将是无活性或具有微弱活性的形式的药物，它在接触与本发明构建体、受体-抗体或p-抗体相联接的酶促能力、转化功能或酶后被转化为活性形式的药物。因此，提供了试剂盒，其优选在分开的组合物和/或容器中包含(a)生物学有效量的至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体，其中所述构建体、受体-抗体或p-抗体可操作地联接、共价连接或缀合至至少第一种酶；和(b)生物学有效量的至少第一种实质上无活性的药物前体，它通过与所述构建体、受体-抗体或p-抗体相联接、连接或缀合的酶而被转化为实质上有活性的药物。切割实质上无活性的药物前体以释放实质上有活性的药物的合适的酶包括芳基硫酸酯酶、沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、D-丙氨酰羧肽酶、3-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、p-内酰胺酶、青霉素酰胺酶或胞嗜吱脱氨酶。与药物前体不同，所述至少第二种抗癌剂可以是上文关于本发明的组合抗癌组合物时所描述的第二种抗癌剂中的任何一种。对于治疗病毒感染，所述至少第二种抗病毒剂还可是上文关于本发明的组合抗病毒组合物时所描述的第二种抗病毒剂中的任何一种。然而，"试剂盒，，可以包含"组合但分开"的至少两种所述的试剂，从而在试剂选择中提供更大的灵活性。因此，本发明的试剂盒可以在单个的容器或容器装置中包括组合的生物学或治疗有效量的至少两种特定试剂。试剂盒还可包含关于使用本文中所包括的生物学试剂和治疗剂的说明书。成像组分也可组合地包括在内，但与治疗试剂盒分开。肿瘤治疗和相关方法本发明提供了关于本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物的许多方法和用途。关于所有方法，术语"a"和"an"用于指在所述方法中的"至少一个"、"至少第一个"、"一个或多个"或"众多"步骤，除非特别说明。这与治疗方法中的施用步骤特别相关。因此，本发明不仅可以采用不同的按剂量给药，还可以使用不同次数的按剂量给药，例如注射或吸入，直至且包括多重注射或吸入。提供了具有重要生物学意义的各种有用的体外方法和用途。因此提供了结合磷脂酰丝氨酸的方法和在其中的用途，它一般包括使包含磷脂酰丝氨酸的组合物有效接触至少笫一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物。"接触"在对于允许形成结合的复合物来说有效的条件下进行，并且检测这样形成的任何复合物。检测方法和用途可以与生物样品结合使用，例如，在关于细胞凋亡、肿瘤和受病毒感染的细胞的诊断中，并且还提供了基于其上的诊断试剂盒。这些方法和试剂盒提供了关于本发明的构建体、受体-抗体、p-抗体和缀合物的特定且可靠的用途。例如，膜联蛋白V通常用于检测凋亡细胞的方法和试剂盒中。然而，膜联蛋白V结合磷脂酰乙醇胺以及磷脂酰丝氨酸，然而本发明的构建体、受体-抗体、p-抗体和缀合物结合磷脂酰丝氨酸，而对于磷脂酰乙醇胺没有显著的，或优选没有可检测的结合。因此，本发明的构建体更好地能够在检测方法和诊断测定法中特异性地检测磷脂酰丝氨酸。本发明进一步提供了许多有用的体内方法和用途。例如，基于定位至磷脂酰丝氨酸的用于肿瘤血管靶向、肿瘤成像和治疗的方法，磷脂酰丝氨酸是易接近且稳定的可靶向的肿瘤血管结构标记物。本发明的构建体、受体-抗体和P-抗体及其缀合物，在施用给具有肿瘤的动物后特异地定位至实体瘤的血管结构。因此，磷脂酰丝氨酸转位至肿瘤血管内皮细胞的表面，至少在显著的程度上，不依赖于完全的细胞凋亡和细胞死亡而发生，从而使得磷脂酰丝氨酸暴露于形态上完整的血管内皮细胞上。所述方法和用途可以在体外和体内进行，在后一种情况下，其中组织和细胞位于动物中，并且向动物施用本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或其缀合物。当组织或细胞离体维持时，本发明在药物发现程序中有用。具有可靠的阳性和阴性对照的体外筛选测定法可用作药物开发中的第一个步骤。当组织或细胞位于动物或患者中时，将所述组合物作为一种治疗形式施用给动物。就具有任何疾病或病症或处于形成任何疾病或病症的危险中的动物和患者而言，提供抗血管发生和抗血管疗法，所述疾病或病症的特征为不希望的、不适当的、异常的、过度的和/或病理性的血管发生或血管化作用。本发明的方法和用途特别希望用于具有下列疾病或处于形成下列疾病的危险中的动物和患者任何形式的血管化肿瘤；黄斑变性，包括年龄相关的黄斑变性；关节炎，包括类风湿性关节炎；动脉粥样硬化症和动脉粥样硬化斑块；糖尿病性视网膜病及其他视网膜病；曱状腺增生，包括格雷夫斯氏病；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癣。在某些实施方案中，可操作地附着至P2GPI多肽的Fc区的用途将优选用于抑制血管发生，所述P2GPI多肽包含带切口的结构域V。如在特别引入本文作为参考的美国专利号5,712,291和6，524，583中所公开的，前述治疗组中的每一种决非详尽的待通过本发明进行治疗的病状类型。引入本文作为参考的美国专利号5，712，291和6，524，583用于某些特定目的，包括一旦已公开和要求保护经定义的一类化合物，就可鉴定许多可以有效治疗的其他病状；和显示通过来自仅仅单一模型系统的数据能够治疗其他疾病。除了治疗血管疾病外，本发明的重要和统一的方面是用于治疗癌症的组合物和方法。此类方法包括向具有癌症或处于形成癌症的危险中的动物或患者施用生物学或治疗有效量的至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物。本发明的癌症治疗方法和用途适合于治疗所有形式的癌症，包括具有下列疾病或处于形成下列疾病的危险中的动物和患者血管化的实体瘤、转移性肺瘤或来自原发性肿瘤的转移灶。本发明的癌症治疗方法不仅仅依赖于发挥抗血管作用，例如通过靶向暴露于肿瘤血管内皮细胞的腔表面上的磷脂酰丝氨酸，因为本发明的构建体也可靶向暴露于肿瘤细胞表面上的磷脂酰丝氨酸。本发明方法优选发挥抗癌作用，而不引起显著的血栓形成并发症。原始发明的未缀合的构建体、受体-抗体或P-抗体，或者其另外的缀合物，可以在本发明的癌症治疗方面使用。就免疫缀合物的用途而言，本发明提供了用于将所选择的诊断剂或治疗剂递送至肿瘤的方法。此类实施方案包括向具有肿瘤的动物或患者施用生物学有效量的至少第一种缀合物，其中诊断剂或治疗剂可操作地附着至本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体。本发明还提供了肿瘤诊断、预后、成像及相关方法，其使用本发明构建体、受体-抗体或P-抗体，以检测凋亡前细胞和凋亡细胞。此类方法可以用作替代标记物，以监测其他疗法特别是化学疗法的进展，或在治疗前形成肿瘤的图像。本发明作为替代标记物以监测癌症疗法特别是化学疗法的进展的用途包括(a)对具有肺瘤的动物或患者实施设计为发挥抗肿瘤效应的至少第一种疗法；和(b)随后向同一动物或患者施用诊断有效量的可操作地附着至可检测的标记或诊断剂的至少第一种本发明构建体、受体-抗体或P-抗体，从而形成肿瘤的可检测图像，优选肿瘤内的凋亡前或凋亡肿瘤细胞或者肿瘤血管内皮细胞的图像；和优选地(c)分析肿瘤的可检测图像，优选肿瘤内的凋亡前或凋亡肿瘤细胞或者肿瘤血管内皮细胞的图像，从而评估设计为发挥抗肿瘤效应的至少第一种疗法的进展或功效。组合的成像和癌症治疗方法包括(a)形成肿瘤图像，其通过向具有肿瘤的动物或患者施用诊断上最小量或有效量的可操作地附着至可检测的标记或诊断剂的至少第一种本发明构建体、受体-抗体或P-抗体，从而形成肿瘤的可检测图像；和(b)随后向同一动物或患者施用治疗上优化或有效量的至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体，或者其缀合物，从而引起抗肿瘤效应。在本发明的癌症治疗方法中，本发明进一步提供了药物前体治疗方法，其一般包括(a)向具有肿瘤的动物或患者施用第一种药物组合物，其包含可操作地联接、共价连接或缀合至至少第一种酶的第一种本发明构建体、受体-抗体或p-抗体；其中所述构建体、受体-抗体或P-抗体在施用后定位至肺瘤，和(b)随后在有效时间段后向动物或患者施用至少第二种药物组合物，其包含生物学有效量的至少一种实质上无活性的药物前体；其中所述药物前体通过与定位于肿瘤中的本发明构建体、受体-抗体或P-抗体相联接、连接或缀合的酶而被转化为实质上有活性的药物。本发明进一步提供了一系列组合型癌症治疗方法，包括向具有癌症的动物或患者施用治疗上有效的组合量的至少第一种本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物，和至少第二种不同的治疗剂或抗癌剂。一般而言，所述至少第二种抗癌剂可以在施用本发明构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物之前、期间或之后施用给动物或患者。所述至少第二种抗癌剂可以与本发明构建体、受体-抗体或e-抗体或者其缀合物"基本上同时"施用给动物或患者；例如从单一药物组合物中或从紧接着在一起施用的两种药物组合物中。备选地，可在相继于施用本发明构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物后的时间点将所述至少第二种抗癌剂施用给动物或患者。如本文所使用的，"相继于...后的时间点"指"错开的时间"，从而使得所述至少第二种抗癌剂在与施用本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物不同的时间点施用给动物或患者。在顺次施用中，在有效间隔开的时间点施用所述两种试剂以允许所述两种试剂发挥其分别的疗效，即，它们以"生物学上有效的时间间隔"进行施用。所述至少第二种抗癌剂可以在本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物之前的生物学有效时间点，或者在那种治疗后的生物学有效时间点施用给动物或患者。任何治疗剂或抗癌剂均可在本发明的组合癌症治疗方法中用作第二种治疗剂或抗癌剂，包括上文关于本发明的抗癌组合物和试剂盒时所描述的治疗剂或抗癌剂中的任何一种。优选的试剂是补充或增强本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物的疗效的那些，例如血管渗透性增强剂、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂、钓流量诱导剂、炎性细胞因子、针对肿瘤细胞和坏死的肿瘤细胞的抗体和免疫毒素、来自表E或表F的化学治疗剂、考布他汀、多柔比星、依托泊苷和放线菌素D。多西他赛是在组合疗法中使用的特别优选的试剂。多西他赛可与本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物分开施用，在之前或之后。就同时施用而言，多西他赛可以在分开的或同一制剂中给予，任选在脂质体或隐蔽的脂质体中，并且优选在用本发明构建体、受体-抗体或P-抗体包被的隐蔽的脂质体的核中。治疗病毒感染在另一总的实施方案中，本发明进一步提供了用于抑制病毒复制、感染和传播的重要的且新的一类组合物和方法以在治疗病毒感染和疾病中使用。这些方法基于使用本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体，无论其是否缀合至抗病毒剂。重要地，本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体无需附着至任何另外的试剂即可发挥抗病毒作用。如果希望附着至另外的试剂，那么细胞毒性剂及其他试剂在抗病毒治疗中将与传统的抗病毒剂一样是有效的。因此，此类构建体和缀合物可广泛应用于一系列病毒感染和相关疾病的治疗中。在第一种情况下，本发明的抗病毒方法涉及使包含受病毒感染的细胞的组合物或者包含或怀疑包含受病毒感染的细胞的细胞群或组织与生物学有效量的至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物接触。受病毒感染的细胞优选为真核细胞，例如动物细月包，并优选哺乳动物或人细l包。所述抗病毒方法和用途可以在体外和体内进行。在体外实施方案中，所述方法具有重要的效用。例如，在用于开发抗病毒药物或其组合的药物发现程序中，以及在关于病毒感染、复制和传播的进一步信息的描绘中。体外抗病毒方法还可用于从生物样品例如用于实验室用途的细胞群和组织培养物中，从用于农业用途的样品、组织、种子、才直物部分和植物中，以及从用于治疗用途的血液和组织样品中清除病毒。在体内方法中，当细胞、细胞群或组织定位于动物内时，本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物作为抗病毒疗法施用给动物。本发明的构建体、受体-抗体或抗体或者其缀合物可以结合暴露于受病毒感染的细胞表面上的磷脂酰丝氨酸，或可以结合暴露于病毒颗粒表面上的磷脂酰丝氨酸。在所有情况下，所述组合物、方法和用途抑制对于生产性的或正在进行的病毒感染来说所需的一个或多个步骤或阶段，包括抑制病毒进入。优选地，所述组合物、方法和用途抑制病毒复制和/或传播，例如抑制病毒转录、翻译、装配、包装和/或进入或逸出感染的宿主细胞例如哺乳动物或人细胞中的一个或多个步骤。因此，本发明优选将病毒感染局限或基本上限制于最初受感染的细胞和细胞群中，从而基本上抑制或预防另外的宿主细胞或组织的后续或正在进行的感染。本发明的抗病毒治疗方法优选涉及向具有病毒感染或相关疾病、怀疑具有病毒感染或相关疾病或者处于形成病毒感染或相关疾病的危险中的动物或患者施用生物学有效量的至少笫一种本发明的构建体、受体-抗体或抗体或者其缀合物。所述缀合物可以可操作地附着至V型ATP酶抑制剂，例如salicylihalamide、刀球肮霉素或巴弗洛霉素；蛋白合成4卬制剂，例:i口psymberin、青腰虫素、irciniastatinA;蓖麻毒素、白树毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌毒素或百日咳毒素；或者附着至至少第二种不同的抗病毒剂。用于附着的合适的抗病毒剂包括表G中列出的那些，例如AZT或西多福韦。因为，本发明抑制所有病毒共同的对于生产性的或正在进行的感染所需的一个或多个步骤或阶段，所以本发明的抗病毒方法和用途适合于治疗所有病毒，包括有包膜病毒和无包膜病毒，包括感染植物、动物、脊推动物、哺乳动物和人患者的那些。本发明适合于治疗在本文表H中所列出的感染脊推动物特别是人的所有病毒，并且特别是在动物和人中具有致病性的病毒。可以通过本发明治疗的病毒感染以及相关和所得疾病包括表J中列出的那些病毒和疾病，如治疗CMV、RSV、沙粒病毒和HIV感染以及肝炎、流行性感冒、肺炎、拉沙热和AIDS所例示的。治疗有包膜病毒是特别优选的。本发明的抗病毒治疗方法还可与其他治疗和诊断组合使用。组合型治疗方法包括向具有病毒感染的动物或患者施用治疗上有效的组合量的至少第一种本发明构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物，和至少第二种不同的治疗剂或抗病毒剂。所述至少"第二种不同的"抗病毒剂是参照作为"第一种"抗病毒剂的本发明构建体、受体-抗体或p-抗体或者其缀合物来说的。所述至少第二种抗病毒剂可以在施用所述第一种本发明抗病毒剂期间、或基本上同时施用给动物或患者；或者之前或之后施用给动物或患者，即在相继于施用所述第一种本发明抗病毒剂后施用。任何治疗剂或抗病毒剂可以在本发明的组合型抗病毒治疗方法中用作第二种治疗剂或抗病毒剂，包括上文关于本发明的抗病毒缀合物、组合物和试剂盒时所描述的抗病毒剂中的任何一种。前述癌症和抗病毒治疗方法和用途通常将涉及全身地例如通过经皮、肌内、静脉内注射等向动物或患者施用药学有效组合物。对于治疗病毒感染，特别是呼吸系统病毒感染，递送至肺是另一优选的实施方案，因为可以使用气雾剂来实现。然而，允许治疗剂定位于肿瘤或病毒感染位点的任何施用途径都将是可接受的。因此，其他合适的递送途径包括口服、直肠、鼻、局部和阴道。对于治疗关节炎的用途和方法，可以采用例如滑膜内施用，如美国专利号5，753，230中关于其他免疫试剂所描述的，该文献特别引入本文作为参考。对于与眼相关的病状，考虑了眼制剂和施用。如本文所使用的，"施用"指以对于发挥疗效来说有效的量和时间提供或递送本发明的构建体、受体-抗体或0-抗体或者其缀合物。蛋白质治疗剂的被动施用通常是优选的，部分是因为其简单性和可重复性。然而，术语"施用"在本文中用于指通过其来递送治疗剂的任何和所有方法。因而，"施用"包括以有效方式提供产生本发明构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物的细胞。在此类实施方案中，可能希望在可选择性地渗透的膜、结构或可植入装置(一般是可以取出以停止治疗的装置)中配制或包装细胞。外源性施用一般仍是优选的，因为这代表了允许密切监测并控制剂量的非侵入性性方法。本发明的治疗方法和用途还延伸至以有效产生体内表达的方式提供编码本发明构建体、受体-抗体或0-抗体或者其缀合物的核酸。任何基因疗法技术均可采用，例如棵露DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的离体操作等。可以使用病毒载体，例如包括在重组逆转录病毒、单纯疱渗病毒(HSV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、巨细胞病毒(CMV)等中。脂质体和隐蔽的脂质体对于在某些实施方案中的使用是优选的。本发明的药物组合物和治疗方法釆用"治疗有效量"的本发明构建体、受体-抗体或0-抗体或者其缀合物。"疗效"和随之发生的"治疗有效量，，通过癌症治疗相比于抗病毒治疗中的不同参数来测量。在癌症治疗中，试剂的量对于下列作用来说是有效的杀死或特异性地杀死至少部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞；在至少部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞中诱导细胞凋亡或特异性地诱导细胞凋亡；在至少部分肿瘤或胂瘤内血管中促进凝血或特异性地促进凝血；闭塞或破坏、或者特异性地闭塞或破坏肿瘤的至少部分输送血液的导管；在至少部分肿瘤中诱导坏死或特异性地诱导坏死；和/或在施用给动物或患者后诱导肿瘤消退或緩解。在治疗病毒感染和相关疾病中，试剂的量对于抑制关于正在进行的病毒感染的一个或多个必要条件来说是有效的，例如病毒进入，并且优选地，来自感染的宿主细胞的病毒复制、逸出和传播。所述量还可以以抵抗病毒复制、传播和正在进行的感染的方式杀死或去除至少部分受病毒感染的细胞。总之，试剂的量对于在施用给动物和患者后减少、显著减少或根除病毒感染来说是有效的。如本文所使用的，术语"优先地"和"特异性地"表示本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体或者其缀合物实现基本上限制于疾病位点的抗癌或抗病毒作用，并且在动物或受试者的正常健康组织中基本上不引起凝血、破坏和/或组织坏死。因此，健康细胞和组织的结构和功能基本上维持不受本发明实施的损害。附图简述下列附图形成本说明书的一部分并且包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或多个并结合本文所提供的具体实施方案的详述可以更好地理解本发明。本专利的美国文件包含至少一幅彩图。在请求并支付必需的费用后，带彩图的本专利副本将由专利和商标局提供。图1。在用3G4抗体治疗的小鼠中白细胞浸润肿瘤。具有MDA-MB-231同位(orthotopic)肺瘤的棵鼠用100Mg/剂的3G4抗体或用相同剂量的同种型匹配的对照抗体一周治疗3次。在治疗结束时，对动物进行灌注，并将胂瘤速冻、切割并染色以检测白细胞。该图中显示了浸润肺瘤的白细胞。图2A、图2B、图2C和图2D。3G4抗体和2aG4抗体的互补性决定区(CDR)的DNA和氨基酸序列。提供了3G4抗体的重链(图2A;SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)和轻链(图2B;SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)的DM和氨基酸序列，并显示了DM序列中的限制性位点。将前导序列与成熟蛋白质区分开，成熟蛋白质的起始点在图2A和图2B中的每一幅图中以第一个箭头指示。列出了用人恒定区对每个可变序列进行接枝的示例性方法，其中各自的人恒定区序列(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)的第一部分在图2A和图2B中的每一幅图中以第二个箭头指示。如图2C和图2D中所显示的，SEQIDNO:10和SEQIDNO:11分别表示IgG2a重链和3G4轻链(CK)的氨基酸序列。图3。使用竟争性磷脂脂质体抑制3G4抗体与固定化的PS的结合。用磷脂包被的微量滴定板用在10%牛血清中浓度为0.016-33nM的3G4处理。使用山羊抗小鼠IgG-HRP检测结合的抗体。使用由各种磷脂制备的脂质体的竟争测定法证实，阴离子磷脂可以与3G4(6.7nM)竟争结合PS。柱表示三次重复测量的SD。图4。3G4与磷脂的结合。用磷脂包被的微量滴定板用在10%牛血清中浓度为0.016-33nM的3G4处理。使用山羊抗小鼠IgG-HRP检测结合的抗体。3G4特异性地结合阴离子磷脂，包括PS、PI、PA和CL，但不结合中性脂质，包括PE、PC和SM。图5A、图5B、图5C、图5D和图5E。如FACS(图5A)和免疫组织化学(图5B、图5C、图5D和图5E)所显示的，通过^02处理诱导了3G4与完整的HUVEC和MDA-MB-435细胞的结合。图5A，HUVEC或MDA-MB-435细胞用H202(200juM)于37。C处理1小时。洗涤细胞并用胰蛋白酶从培养皿中分离。细胞用3G4(实线)或对照小鼠IgG3(BBG3)(虚线)染色，并通过细胞荧光测定法使用FACS进行分析。设备对完整细胞(礁化丙锭阴性)是开启的。图5A，左上部，HUVEC;右上部，&02处理的HUVEC;左下部，MDA-MB-435;右下部，仏02处理的MDA-MB-435。图5B、图5C、图5D和图5E,通过下列步骤来测定3G4结合完整的、非渗透化的、经11202处理的HUVEC的形态学如上用[1202处理粘附细胞，洗涤细胞，并用3G4或对照小鼠IgG3(BBG3)，随后用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(绿色)进行染色。细胞随后用低聚甲醛固定并透化。细胞骨架用德克萨斯红标记的鬼笔环肽(红色)染色，并且细胞核用DAPI(蓝色)复染。3G4结合出现膜泡的质膜的分散区域。图5B，用BBG3染色的HUVEC;图5C，用3G4染色的HUVEC;图5D，用BBG3染色的MDA-MB-435细胞；和图5E，用3G4染色的MDA-MB-435细胞。未用&02处理的细胞不用3G4染色。比例尺表示50jum。图6A、图6B、图6C和图6D。针对磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂的抗体导致单核细胞结合至肿瘤血管以及导致巨噬细胞浸润肿瘤。具有同位人乳腺肿瘤的SCID小鼠用100jug对照抗体BBG3(图6A和6C)或3G4抗体(图6B和图6D)经腹膜内途径进行治疗，一周3次共2周。肿瘤是MDA-MB-435(图6A和6B)或MDA-MB-231(图6C和6D)。制备冷冻的肿瘤切片。用大鼠抗小鼠Ml/70(Mac-1)抗体，随后用FITC标记的抗大鼠IgG(绿色)来检测小鼠巨噬细胞和单核细胞。抗F4/80和抗FcyR抗体产生与抗M1/70抗体一致的染色图案。血管用仓鼠抗小鼠CD31，随后用德克萨斯红标记的抗仓鼠IgG来检测(红色)。细胞核用DAPI(蓝色)显现。图6A，来自用对照BBG3处理的小鼠的肿瘤，显示出稀少的巨噬细胞浸润。图6B，来自用3G4处理的小鼠的肿瘤，显示出丰富的巨噬细胞浸润。图6C，来自用BBG3处理的小鼠的对照肿瘤，显示出缺乏附着至血管的单核细胞。图6D，来自用3G4处理的小鼠的肿瘤，显示出附着至肿瘤血管内皮的腔表面上的单核细胞(箭头)。图6A和图6B中的比例尺表示50Mm，并且图6C和图6D中的比例尺表示10jnm。图7。吞噬作用的沉默状态和炎症状态。根据使用3G4抗体的肿瘤治疗研究，提出抗体例如3G4引起从表达PS的肿瘤内皮细胞起的PS信号传导的阻断。通常地，肿瘤内皮细胞上的PS通过结合肿瘤血管和肿瘤细胞的巨噬细胞来抑制炎症应答(沉默状态)。当抗体例如3G4存在时，抗体结合PS，从而使得巨噬细胞上的PS受体不具有结合配偶体。然后，巨噬细胞分泌TNF-oc、IL-1及其他炎性因子，它们直接损害肿瘤内皮并将更多的宿主细胞募集到肿瘤中(炎症状态)。图8。3G4抗体的F(aV)2片段作为抗肿瘤剂与3G4—样有效。在第l天用肿瘤接种小鼠，并在第9天用3G々抗体、3GA抗体的F(ab02片段或同种型匹配的对照抗体(BBG3)治疗。对照动物中的肿瘤继续快速生长(■),而在用3G4抗体()或3G4抗体的F(at/)2片段(T)治疗的小鼠中，肿瘤生长明显减慢，F(ab')2片段至少与3G4—样有效。图9A和图9B。3G4与用PS包被的微量滴定板的结合是血清依赖性的。图9A，从在包含牛血清的培养基(SCM)或无血清培养基(SFM)中生长的细胞纯化出3G4抗体。微量滴定板用PS包被并在1%0VA中封闭。在10%胎牛血清(FBS)或1%来自鸡蛋清的卵清蛋白(0VA)中进行3G4的系列稀释。图9A，微量滴定板用PS包被并在1%0VA中封闭。如所说明的，在10%来自小鼠、大鼠、人和牛这些物种的血清中进行3G4SFM的系列稀释。图10A和图IOB。3G4结合血浆蛋白质P2GPI(图10A)并且在|32GPI结构域II上结合(图10B)。图IOA，微量滴定板用从人血浆中纯化的人02GPI(hp2GPI)包被并在1%0VA中封闭。在1。/。OVA中进行商品化的小鼠抗人e2GPI(抗P2GPI或"a-p2GPI")、3G4SFM和对照小鼠IgG(mlgG)的系列稀释。图IOB，微量滴定板的孔用重组全长h|32GPI肽(结构域I-V)或者缺乏结构域I(II-V)、缺乏结构域I和II(III-V)、缺乏结构域I-III(IV-V)或缺乏结构域I-IV(V)的hp2GPI肽包被。平板在1%OVA中封闭，并且在1%OVA中进行3G4SFM的系列稀释。图11。ch3G4和P2GPI必须同时存在以结合具有暴露的PS的内皮细胞(EC)。ABAE细胞在DMEM+10%正常小鼠血清(MS)中用200HiM溶血磷脂酰胆碱(LPC)孵育30分钟，同时加上(i)纯化的hp2GPI、(ii)ch3G4或(iii)ch3G4+h卩2GPI。然后，洗涤细胞并分别用(i)ch3G4、(ii)hP2GPI、或(iii)DMEM+10%MS孵育30分钟。最后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以检测ch3G4的结合。使用浓度为2jag/ral的ch3G4和hP2GPI。4吏用MetaVue软件定量ch3G4结合的像素面积。值是相对于将在条件(i)下ch3G4的结合设定为1而言的。图12A和图12B。P2GPI的脂质结合区域是介导ch3G4与具有暴露的PS的内皮细胞结合所必需的。图12A,ABAE细胞用ch3G4加上(i)非脂质结合形式的P2GPI(带切口的hP2GPI)或(ii)完整的hp2GPI进行孵育。在DMEM+10%MS中于200jaMLPC存在或不存在下进行30分钟孵育。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以检测ch3G4的结合。使用浓度为2jug/ml的ch3G4、hP2GPI和带切口的hp2GPI。使用MetaVue软件定量ch3G4结合的像素面积。值是相对于将在没有LPC的条件(i)下ch3G4的结合设定为1而言的。图12B,微量滴定板的孔用hP2GPI或带切口的hp2GPI包被，并在1%OVA中封闭。在1%OVA中进行ch3G4或对照mlgG的系列稀释。图13。过量的ch3G4抑制ch3G4/P2GPI复合物与具有暴露的PS的内皮细胞的结合。ABAE细胞在DMEM+10%MS中用200jaMLPC、40nM纯化的hp2GPI以及一系列滴度的ch3G4滴度孵育30分钟。然后，洗涤细胞，固定，并用焚光标记染色以检测ch3G4的结合。使用MetaVue软件定量ch3G4结合的像素面积。值是相对于将320pMch3G4的结合设定为1而言的。图14A、图14B和图14C。ch3G4的二价性是P2GPI介导的与具有暴露的PS的内皮细胞结合所必需的。图14A，ABAE细胞在DMEM+10%FBS中于200juMLPC存在或不存在下用20nM3G4、3G4F(ab')2或3G4Fat/单体孵育30分钟。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以检测3G4或3G4片段的结合。使用MetaVue软件定量抗体结合的像素面积。值是相对于将在LPC不存在下的3G4的结合设定为1而言的。图14B,ABAE细胞在DMEM+10%MS中用200jaMLPC、40nM纯化的hP2GPI以及一系列滴度的3G4Fat/单体孵育30分钟。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以检测3G4FaV的结合。使用MetaVue软件定量3G4Fab'结合的像素面积。值是相对于将2nM3G4Fab'的结合设定为1而言的。图14C,ABAE细胞在DMEM+10%MS中用200iuMLPC、40nM纯化的hP2GPI、20nMch3G4以及一系列滴度的3G4Fab'单体孵育30分钟。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以检测ch3G4的结合。使用MetaVue软件定量ch3G4结合的像素面积。值是相对于将没有竟争性3G4Fab'时的ch3G4的结合设定为100而言的。图15。示意性地图示了3G4抗体和称为"Tarvacin"的人-小鼠嵌合抗体对应物与PS表面的P2GPI依赖性结合。显示出P2GPI具有5个结构域(I、II、III、IV和V)。抗体与PS表面(包括暴露于细胞膜上的PS)的结合由与P2GPI结构域II的结合介导。图16。示意性地图示了示例性的Fc-P2GPI构建体。在这个构建体中，抗体的可变区已去除，但不用P2GPI代替。相反地，将P2GPI附着在Fc区的Ch3結枸域的C-末端。该图显示了二硫键键合的铰链区，来自小鼠IgGh的Fc区的两个CH2和CH3结构域，其可操作地附着至两个小鼠P2GPI蛋白。在对应物人构建体中，来自人IgG,的Fc区可操作地附着至两个人I32GPI蛋白。来自人IgG3的Fc区也将优选与两个人P2GPI蛋白一起使用。在所描述的示例性Fc-P2GPI构建体中，显示出小鼠P2GPI具有所有5个结构域(I-V)，尽管可以容易地制备不含所有5个结构域的其他小鼠或人构建体，只要保留P2GPI结构域V的脂质结合区域。图17。Fc-mP2GPI构建体的质粒图。由下列3个单元产生称为"Fc-mP2GPI"的所制备的第一种Fc-p2GPI构建体(1)通过PCR从2aG4构建体扩增出的3G4轻链的信号序列；(2)通过PCR从2aG4构建体扩增出的包含铰链、CH2、CH3的小鼠IgG2aFc区；和(3)通过RT-PCR从商购获得的小鼠肝RM扩增出的小鼠P2GPI。显示了质粒图。质粒的序列如SEQIDNO:25中所提供的。图18A。Fc-mP2GPI氨基酸序列。被切割的信号肽("mlgGK信号序列")M靈APAQILGFLLLLFPGTRCLR由SEQIDNO:18表示。第1位标明在切除信号肽后成熟Fc-m|32GPI蛋白的起点。成熟Fc-mp2GPI的氨基酸序列是SEQIDNO:19。标明了Fc区的铰链、CH2和CH3结构域，并标明了小鼠02GPI的结构域I、II、III、IV和V。以粗体和阴影显示了参与P2GPI中的结构域内二硫键形成的Cys残基。带下划线的斜体形式的氨基酸是参与阴离子磷脂识别的正电荷区域的一部分。带双下划线的斜体形式的氨基酸是对于与脂质膜结合来说所需的疏水环的一部分。SEQIDNO:20是氨基酸序列，KNKEKKCSYTVEAHCRDGTIEIPSCFKEHSSLAFWK,其以参与阴离子磷脂识别的那些开始，并以作为对于与脂质膜结合来说所需的疏水环的一部分的那些结束。图18B。由于制备人Fc-p2GPI(Fc-hP2GPI)的人重链恒定区和人P2GPI的氨基酸序列。呈现的人IgGi重链恒定区(登录号P01857;SEQIDNO:21)以可以净皮删除的CH1结构域开始。在人Fc-hP2GPI中，在铰链(铰链起点匹配图18A中的第1位)、人Ch2和人Ch3结构域之后为人P2GPI(登录号1C1ZA;SEQIDNO:22)，其被显示出包括结构域I、II、III、IV和V。SEQIDNO:23是Fc-hP2GPI的氨基酸序列。人P2GPI的结构域结构与小鼠P2GPI的结构域结构十分相似(图18A)，包括下列部分的定位参与结构域内二硫键形成的Cys残基(粗体和有阴影的)，作为参与阴离子磷脂识别的正电荷区域的一部分的氨基酸(带下划线的斜体)，以及作为对于与脂质膜结合来说所需的疏水环的一部分的氨基酸(带双下划线的斜体)。SEQIDNO:24是氨基酸序列，KNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWK，其以参与阴离子磷脂识别的那些开始、并以作为对于与脂质膜结合来说所需的疏水环的一部分的那些结束。图19。Fc-m02GPI的表达和通过抗小鼠IgG的捕获。用FuGENE6试剂将Fc-2GPI构建体转染到CHO细胞中。2天后，收集并测定细胞上清液。在表达测定法中，微量滴定板用抗小鼠IgG包被并用1%0VA封闭。在1。/。OVA中进行细胞培养上清液的系列稀释。#8和#18是两种不同的Fc-mP2GPI克隆。用ch3G4和抗人IgG-HRP检测结合。载体是阴性对照，这是基线。图20。Fc-2GPI结合在用PS包被的板上的PS。在这个结合测定法中，微量滴定板用PS包被并用1%OVA封闭。在1%OVA中进行Fc-m^2GPI细胞培养上清液的系列稀释。#8和#18是两种不同的Fc-mp2GPI克隆。用抗小鼠IgG-HRP检测结合。图21。Fc-mP2GPI结合阴离子磷脂。该测定法测量Fc-m02GPI在10%FBS中与磷脂的结合。微量滴定板用所指明的各种脂质包被，并用1%0VA封闭。在1%OVA中进行FciP2GPI细胞培养上清液的系列稀释。用抗小鼠IgG-HRP检测结合。Fc-mp2GPI结合阴离子磷脂PS、PA、PI和PG，但不结合中性脂质PC和SM。图22A、图22B和图22C。Fc-mP2GPI检测暴露于天然凋亡的ABAE细胞上的PS。将2x104ABAE细胞接种到8孔玻璃腔式载玻片上，在DMEM+10%FBS中于37。C过夜。第二天，洗涤细胞，并与2aG4(图22A)、来自经Fc-mP2GPI转染的CHO细胞的上清液(图22B)或来自模拟转染细胞的上清液("对照上清液"，图22C)—起孵育。用经FITC标记的二抗(绿色)检测2aG4和Fc-mP2GPI。细胞骨架和细胞核分别用经德克萨斯红标记的鬼笔环肽和DAPI(蓝色)复染。箭头突出显示凋亡细胞。图23A和图23B。Fc-mP2GPI检测暴露于经LPC处理的ABAE细胞上的PS。将2xl(TABAE细胞接种到8孔玻璃腔式载玻片上，在DMEM+10%FBS中于37。C过夜。第二天，洗涤细胞，并与来自经Fc-mp2GPI转染的CHO细胞的上清液一起孵育。用经FITC标记的二抗(绿色)检测Fc-mP2GPI。细月包骨架和细胞核分别用经德克萨斯红标记的鬼笔环肽和DAPI(蓝色)复染。图23A和图23B各自描述了Fc-mp2GPI的结合，如具有绿色染色的小点所示。图24A、图24B、图24C和图24D。人工二聚p2GPI构建体结合具有暴露的PS的内皮细胞。将ABAE细胞在DMEM+10%FBS中用200juMLPC孵育30分钟，其中加上了纯化的h卩2GPI单体(图24A)、h卩2GPI二聚体(图24B)、或不能结合脂质的突变型h卩2GPI二聚体(图24C)。然后洗涤细胞，并与抗hp2GPI—起孵育以检测h|32GPI单体和二聚体。所述抗P2GPI抗体不识别牛02GPI;因此，10%FBS的存在不抑制h|32GPI单体或hp2GPI二聚体的检测。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色。细胞骨架呈现红色，细胞核呈现蓝色，并且hp2GPI单体和hp2GPI二聚体呈现绿色。图24D，使用MetaVue软件定量hp2GPI单体或hp2GPI二聚体的结合面积。所有值是相对于将2GPI二聚体与未经LPC处理的细胞的结合设定为1而言的。例证性的实施方案的描述实体瘤和癌在人类所有癌症中所占比例超过90%。虽然在淋巴瘤和白血病的治疗中已经研究了单克隆抗体和免疫毒素的应用(Vitetta等人，1991),但是这些药剂在抗癌和其他实体瘤的临床试验中无效的结果令人失望(Abrams和01dham，1985)。基于抗体的治疗无效的首要原因是大分子不容易转运进入实体瘤。甚至一旦进入了肿瘤块内，由于肿瘤细胞间存在紧密连接、纤维基质、间质压力梯度和结合位点屏障，这些分子也不能均匀分布(Denekamp，1990;Dvorak等人，1991)。在开发用于治疗实体瘤的新策略的过程中，涉及靶向肿瘤血管结构而非肿瘤细胞的方法具有明显优势。有效破坏或阻断肿瘤血管，则阻止了经过肺瘤的血流并导致雪崩式的肿瘤细胞死亡。抗体-毒素和抗体-凝血剂构建物，例如选择性破坏和/或堵塞肿瘤血管的VTA，早已有效用于特异性靶向并破坏肿瘤血管结构，导致肿瘤坏死(Burrows等人，1992;Bur雨s和Thorpe，1993;W093/17715;W096/01653;Huang等人，1997;分别引入本文作为作为参考)。VTAs在实体瘤的已有血管上发挥其主要的作用，而不同于阻止新血管形成的抗血管发生剂。VTAs相比于其他癌症治疗剂有许多优越之处。首先，仅仅一条血管为成百上千的肿瘤细胞提供营养并促进代谢废物的去除，只要在某一点被破坏就会阻断上下游的血流。因此VTAs对于已建立的肿瘤尤其有效。其次，无需杀死内皮细胞，尽管这是一个有效的机制。血液凝结的形成或局部引发的变化就足够了。第三，内皮细胞与血流相邻，保证了足够的药物递送。第四，靶目标是不太可能具有造成药物抗性的遗传突变的正常二倍体细胞。第五，生物学活性的代用标记，即血流，是可检测的。第六，对血管功能的短暂影响可能足以产生显著的抗肿瘤效用。研究表明，在局部缺血2小时内体内99%以上的肿瘤细胞能被杀死。最后，与血管发生抑制剂不一样，VTAs只需间歇施用以便协同加强常规疗法的作用，而无需几个月或几年的长期施用。在以下专利中有对细胞毒性VTAs的描述美国专利号5，660，827;5，776,427;5，855，866;5，863，538;5，965,132;6，004，554;6，051，230;6，261，535和6,451，312，分别引入本文作为参考。其中的抗体、生长因子或其他的结合配基用于特异递送凝血剂至胂瘤血管结构，这样的药剂被称为"凝血配体，，。凝血配体VTAs参阅以下专利美国专利号6，093，399;6，004，555;5，877，289和6，036，955,分别引入本文作为参考。目前等人，1997;W096/01653;美国专利号5，877，289)。TF是血液凝结的主要起始因子(Ruf等，1991;Edgington等人，1991)。在损伤位点，血液中的因子VII/VIIa开始接触并结合血管周围组织内细胞上的TF。存在磷脂表面时，TF:VIIa复合物激活因子IX和X。这继而导致凝血酶、纤维蛋白、和最终血块的形成(Ruf和Edgington，1994)。缺失胞质和跨膜结构域的重组、截短形式的组织因子(tTF)是诱发凝血能力比天然TF低约5个数量级的可溶性蛋白质(Stone等，1995;Huang等，1997)。这是因为TF需要联合磷脂与VIIa形成复合物，从而有效激活IXa或Xa。不过，当tTF通过耙向抗体或药剂的方式递送至肿瘤血管内皮时，它重新接近脂质表面并恢复血栓形成活性(Huang等人，1997;美国专利号6，093，399，6,004,555，5，877，289和6，036，955)。由此形成了选择性地在肿瘤血管引起血栓的凝血配体。截短的TF具有几个优势，使其被推荐用于血管靶向凝血配体中人tTF易于获取，且人蛋白质对人体只具有可忽略的或微弱的免疫原性；人tTF在包括小鼠在内的实验动物中是完有功能的；且靶向tTF具有高潜能，因为它可引发凝血蛋白质级联反应的激活，产生大大增强了的效应(美国专利号6,093，399，6,004,555，5，877，289和6，036，955)。已经描述了在胂瘤内皮上可供利用、但在正常内皮上基本上不存在的多种合适的耙分子。例如，可以利用被表达的靶，诸如内皮糖蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、TIE、与LAM-1反应的配体、VEGF/VPF受体、FGF受体、otvp3整联蛋白、多效营养因子、或内皮唾液酸蛋白(美国专利号5，855，866;5，877，289;Burrows等人，1992;Burrows和Thorpe，1993;Huang等人，1997;Liu等人，1997;Ohizumi等人，1997;分别引入本文作为参考)。吸附的靶是另一组合适的靶，诸如VEGF、FGF、TGFP、HGF、PF4、PDGF、TIMP、结合TIE的配体、或肿瘤相关性纤连蛋白异构体(美国专利号5，877，289，5,965,132，6,051，230和6，004，555)。纤连蛋白异构体是可结合受体整联蛋白家族的配体。肿瘤相关性纤连蛋白异构体是肿瘤血管结构和肿瘤基质二者的可靶向成分。单克隆抗体BC-1(Carnemolla等人，1989)特异结合肿瘤相关性纤连蛋白异构体。如美国专利号5，776，427，5，863，538和6，036，955所述，通过天然的肿瘤环境或人为干预后可诱导的其他靶目标也是可靶向的实体。当与正常组织的预先抑制和肿瘤血管诱导结合使用时，也可以采用MHCn类抗原作为靶目标(美国专利号5，776，427，5,863,538，6,004,554和6，036，955)。目前优选用于临床的一个靶目标是血管内皮粘附分子-UVCAM-1)(美国专利号5，855，866，5,877,289，6,051,230，6，004，555和6,093，399)。VCAM-1是由炎性细胞因子IL-1oc、IL-4(Thornhi1l等人，1990)和TNFoc(Munro,1993)谦导的细胞粘附分子，它在体内的作用是向急性发炎部位补充白细胞(BevUacqua，1993)。VCAM-l存在于许多人类恶性肿瘤的血管内皮细胞中，包括成神经细胞瘤(Patey等人，1996)、肾癌(Droz等人，1994)、非小细胞肺癌(Staal-vandenBrekel等人，1996)、淋巴肉芽肺病(何杰金氏病)(Patey等人，1996)和血管肉瘤(Kuzu等人，1993)，还存在于良性肿瘤血管内皮细胞上，诸如痣(Patey等人，1996)和血管瘤(Kuzu等人，1993)。VCAM-1在人体中的组成性表达仅限于曱状腺、胸腺和肾的一些血管(Kuzu等人，1993;Bruijn和Dinklo，1993),而在小鼠内则限于心脏和肺的血管(Fries等人，1993)。本文给出的某些数据甚至进一步补充了美国专利5，855，866,5,877,289，6,051,230，6，004，555和6，093，399中所提供的数据，并证明了抗-VCAM-l.tTF凝血配体的施用选择性地诱导了血栓症和肿瘤梗死。所展示的结果是以带L540人何杰金淋巴瘤的小鼠为材料得到的。当作为异种移植物生长于SCID小鼠中时，就炎性细胞因子的表达以及其血管结构上VCAM-l和其他内皮细胞活化分子的存在而言，该肿瘤显示与人类疾病非常类似(Diehl等人，1985)。利用共价连接的抗-VCAM-l.tTF凝血配体(其中tTF直接与抗-VCAM-l抗体直接连接)，本文显示了凝血配体选择性地定位于肿瘤血管处，诱导那些血管的血栓形成，在携带L540何杰金实体瘤的小鼠中引起了整个肿瘤发生坏死并延緩了肿瘤的生长。肿瘤通常需要直径至少约O.3cm才能对凝血配体产生反应，因为在较小的肿瘤上没有VCAM-1。估计可能是因为在小肿瘤中，肿瘤细胞或浸润肿瘤的宿主细胞分泌的细胞因子水平对于VCAM-1的诱导来说太低了。这与美国专利5，855，866，5,877,289，6,051,230,6，004，555和6，093，399中的研究结果是一致的，其中的发明显示出在较大的实体瘤中最有效。尽管最初更多的是在肿瘤周边观察到VCAM-1染色，凝血配体明显地结合并堵塞输送血液的血管_-因为它能减少所有肿瘤区的血流。此外，有一发明者还考虑到由于最初施加凝血配体所引起的凝血酶的产生有可能导致中枢血管上进一步的VCAM-1诱导作用(Sluiter等人，1993)，从而产生扩大的信号并导致对肿瘤内区域的明显破坏。这种放大在美国专利6，036，955中有所描述。正如本文所显示的，尽管通过施加抗VCAM-l凝血配体观察到其定位于小鼠心脏和肺中表达VCAM-1的血管上，但此构建物并未在这样的非肺瘤部位谦发血栓形成。而且，抗VCAM-1凝血配体对小鼠的毒性并不比具有无关特异性的对照凝血配体更大，再次表明了VCAM-1在心脏和肺血管上的组成性表达不会产生毒性。由于VCAM-1是人类肿瘤血管内皮中天然存在的标记物，此结果对于当前凝血配体疗法的临床进展尤为重要。另一方面，此现象还为发明者提供了独一无二的视野，导致了不同的破坏肿瘤血管结构的方法。A.发现用于肿瘤治疗的棵露的抗磷脂酰丝氨酸抗体发明者试图了解抗VCAM-l凝血配体能结合组成性表达于心脏和肺血管上的VCAM-1却不会在那些血管中引起血栓形成这一现象背后的机制。对于此只凭经验观察到的现象有许多科学的可能性解释，通常与肿瘤环境中的前血栓形成特性以及心脏和肺中任何血纤维蛋白溶解诱因相关。一般而言，在凝血系统(纤维蛋白沉积)和纤溶系统(纤维蛋白被酶降解)之间存在着生物学平衡。不过，在恶性病，尤其是肺瘤中，此平衡被破坏，导致了凝血的异常激活(血凝过快或"前血栓形成状态")。尽管进行了大量的研究，直到最近才了解了肿瘤环境中前血栓形成状态的明确分子机制。在详细分析许多可能后，发明者推断抗VCAM-1凝血配体之所以不会在正常组织血管内引起血栓形成是由于这些血管内腔表面缺乏磷脂酰丝氨酸(PS)。因此，为了证实这一理论，不仅需要证明在这些正常血管上无磷脂酰丝氨酸，还需要证实它们存在于肿瘤相关血管的内腔侧面上。因此，发明者用免疫组织化学染色来确定静脉内注射入患肿瘤小鼠体内的单克隆抗磷脂酰丝氨酸(抗PS)抗体的分布状态。这些研究显示，在心脏和肺中表达VCAM-1的血管缺乏PS,而在肿瘤中表达VCAM-1的血管也表达PS。发明者还发现结合PS的膜联蛋白V在体外和体内均阻断抗-VCAM-l.tTF凝血配体的作用，这进一步证实了在凝血配体的作用中需要表面PS的表达。因此，至少在某种程度上，抗VCAM-1凝血配体在正常心脏和肺血管上无血栓形成作用的原因可以解释为由于缺乏磷脂酰丝氨酸，意味着正常血管上没有凝血复合物组装所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情况下，抗-VCAM-l.tTF与表达VCAM-l的心脏和肺血管结合，但不会诱发血栓形成。相反，在胂瘤中表达VCAM-1的血管显示出同时表达了表面PS。因此，凝血配体与肿瘤血管结合，并局部激活了凝血因子，从而形成了堵塞的血栓。除了描述抗VCAM-1凝血配体的肿瘤特异性血栓形成作用外，在肿瘤血管内腔表面上磷脂酰丝氨酸的特异表达还使发明者能够解释早期研究中观察到却不能理解的前血栓形成表型。PS表达在肺瘤血管结构的前血栓形成状态中起了重要的作用。在他们发现代表性的氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸特异地表达于肿瘤血管内腔表面而不表达于正常血管中后，发明者推断其他的氨基磷脂也具有作为治疗干预靶目标的可能。发明者因此以靶向于磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺(PE)这些氨基磷脂为基础开发了肿瘤血管系统靶向和治疗方法。一旦磷脂酰丝氨酸作为肿瘤血管结构特异标记物的发现得到证实，发明者开始开发一系列靶向磷脂酰丝氨酸的免疫毒素和凝血配体用于肿瘤治疗中。正如美国专利6，406，693中所解释的，当研究在将毒素或凝血剂递送至肿瘤血管结构时利用磷脂酰丝氨酸进行靶向的可能性时，发明者意外的发现在未附加任何效应子的情况下棵露的抗PS抗体对体内肿瘤血管具有破坏作用。抗氨基磷脂抗体既特异定位于肿瘤血管系统又发挥伴随的破坏作用从而导致肿瘤坏死的能力是根本未曾预料到的。这些发现产生使用结合磷脂酰丝氨酸的未缀合的或"棵露的"抗体的肿瘤治疗，如引入本文作为参考的美国专利6,406，6"中描述的。尽管在本领域公认的动物模型中的抗胂瘤效应在美国专利6，406，693中得到了证实，并在本文中进行了扩展，但从美国专利6，406，693之前的研究不能预测氨基磷脂能够充当肿瘤血管系统的安全且有效的可靶向标i己物。B.使用抗磷脂酰丝氨酸抗体的广泛的肿瘤治疗在不同细胞中磷脂酰丝氨酸通常被隔离至质膜双层的内表面(Gaffet等人，1995;Julien等人，1995)，并且这种脂质隔离产生不对称的跨双层(Williamson和Schlegel，1994)。本发明人在较早的时候证实了，PS移位至肺瘤血管内皮细胞表面，并且至少在显著的程度上，这种现象的发生与凋亡或其他细胞死亡机制无关(美国专利6,406,693)。因此，在肿瘤环境中PS的表面表达不是细胞死亡的结果，也不是由它引起了即时的细胞破坏。尽管在各种实体瘤中在完整血管内皮细胞上始终可以检测到PS暴露，胂瘤血管内皮却不是真正凋亡的，而是形态学上完好的(尽管不同于正常组织中的情形)，并且是代谢活跃的。这对于基于PS靶向的治疗方法来说是重要的，这意味着在肺瘤血管内皮细胞中PS向外膜的移位对于PS用作成功治疗(利用棵露的抗体或治疗性缀合物)的可靶向实体来说是足够稳定的。通过开发对不同磷脂具有强特异性的生物学工具，本发明人已确定阴离子磷脂在肿瘤血管内皮细胞上也是上调的。因此，阴离子磷脂是肿瘤血管系统的特异且稳定的标记物，这使得能够利用可与阴离子磷脂结合的棵露抗体和免疫缀合物二者进行治疗干预。在正常条件下，阴离子磷脂在静息哺乳动物细胞表面上基本上是不存在的。磷脂酰丝氨酸是最丰富的质膜阴离子磷脂，其在正常条件下在大部分细胞类型中被紧密隔离于质膜内表面(Williamson和Schlegel，1994;Zwaal和Schroit，1997)。另一种主要的阴离子磷脂，磷脂酰肌醇(PI)，也主要位于质膜的内表面(Calderon和DeVires，1997)。次要的阴离子磷脂，磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)，只在少数细胞类型中检测到，但它们也表现出主要位于质膜的内表面(Hinkovska-Galcheva等人，1989)。另一种阴离子磷脂，心磷脂，存在于线粒体膜上而不存在于质膜上(Daum，1985)。中性磷脂也不对称地分布于质膜内。磷脂酰乙醇胺(PE)这种中性氨基磷脂主要位于内表面。含胆碱的中性磷脂，磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)，主要位于外表面。PS的不对称性通过ATP-依赖性转运蛋白即氨基磷脂移位酶(Mg2+ATP酶)来维持，该酶催化氨基磷脂从质膜外表面向内表面转运(Seigneuret和Devaux，1984)。PS不对称性的丧失或崩溃是由于质膜内的这些磷脂向外运动所造成的，或者是由于对移位酶的抑制(Bitbol等人，1987;Comfurius等人，1990)、PS转运蛋白的激活和/或爬行酶(Zhao等人，1998)或ABC-l翻转酶(floppase)(Hamon等人，2000)的激活所引起的，所述爬行酶和翻转酶是双向转运所有脂质的Ca"依赖性酶。也可激活鞘磷脂酶以产生神经酰胺，其促进跨双层的脂质转位(Contreras等人，2003)。在不同的病理和生理条件下都观察到了PS不对称性的丧失，包括细胞损伤、程序性细胞死亡和凋亡(Blankenberg等人，1998;Bombeli等人，1997)、细胞衰老(Herrmann和Devaux，1990)、血小板活化(Rote等人，1993;Zwaal等人，1989)、损伤(Boyle等人，1996)和恶性转化(Sugimura等人，1994)。PS的暴露还在成肌细胞(Sessions和Horwitz，1981)与营养细胞(Adler等人，1995)的胞间融合、细胞迁移(Vogt等人，1996)和细胞脱粒(Demo等人，1999)中起作用。内皮细胞对由凝血酶(Qu等人，1996)、钙离子载体或佛波酯(Julien等人，1997)、高脂血症(Lupu等人，1993)和非溶胞浓度的补体蛋白质C5b-9(Christiansen等人，1997)所诱导的Ca^流量增加产生应答而将PS外在化。在无外源激活剂或细胞损伤的情况下在恶性细胞内也观察到自发的PS暴露(Utsugi等人，1991)。膜PS暴露后产生几个主要的后果。有吞噬作用的巨噬细胞识别、附着并消灭PS阳性的衰老和凋亡细胞(McEvoy等人，1986;Tait和Smith,1999)。PS还介导T淋巴细胞与凝血酶活化的内皮细胞附着(Qu等人，1996)。补体系统被PS激活并促成PS阳性细胞的裂解(Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通过为凝血复合物的装配和活化提供带负电荷的脂质表面而促使前凝血剂移动至内皮上(Williamson和Schlegel，1994;Bombeli等人，1997)。长期以来已对肿瘤内皮的促血栓形成特征有所认识(Donati和Falanga,2001)。本发明人认识到肿瘤内皮的损伤和活化是由以下物质引起的1)肿瘤来源的细胞因子，例如白介素-l和肿瘤坏死因子，它们激活内皮并诱导细胞粘附分子的表达(Shaughnessy等人,1989;0rr等人，2000);2)由粘附于内皮上的白细胞产生的活性氧类别(ROS)(Orr等人，2000);和3)作为代谢副产物(Shaughnessy等人，1989;Soares等人，1994)或作为暴露于低氧之后又复氧的结果(Zulueta等人，1995)由肿瘤细胞自身产生的ROS。这些观察结果暗示，可能由肿瘤内皮中的这些应激产生Ca"流量，接着通过爬行酶的活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS暴露。为了检测细胞表面阴离子磷脂，本发明人创造了新的单克隆抗体9D2，它与阴离子磷脂而非中性磷脂反应。9D2因此与普通的氨基磷脂结合剂区别开来，因为它与磷脂酰丝氨酸这种阴离子氨基磷脂结合，而不与磷脂酰乙醇胺这种中性氨基磷脂结合。9D2抗体还比天然配体膜联蛋白V更特异于阴离子磷脂，所述膜联蛋白V除了与阴离子磷脂结合外还强烈结合PE(Blankenberg等人，1998)。正如本申请所详述的，本发明人发现9D2和膜联蛋白V在经静脉内注射到带有各种类型实体瘤的小鼠中后特异地定位于肿瘤内皮。这个发现证实了本发明人的假设，即磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂通常在肿瘤血管内皮表面变得暴露，且可用作肿瘤治疗(和成像)的靶分子。从本发明中显现的主要发现之一是磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂暴露在肿瘤内皮的表面上(实施例VI;Ran和Thorpe，2002;Ran等人，2002b)。此现象通过使用下列两种选择性结合阴离子磷脂的独立试剂得到证明单克隆抗体9D2，这是本发明人特别为了证明这点而开发的，以及膜联蛋白V。9D2抗体和膜联蛋白V以高亲和力和特异性结合磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂，它们作为脂质体被吸附至塑料，或者被呈现在体外活化或凋亡内皮细胞的膜表面上。9D2与PS、PA和CL强烈结合，但与PI和PG的结合则弱得多。正如过去所发现的，膜联蛋白V除了结合PS、CL、PA、PI和PG之外,还结合PE(Andree等人，1990;Schlaepfer等人，1987;Boustead等人，1993;Blackwood和Ernst，1990)。9D2抗体对磷月旨酰丝氨酸和阴离子磷脂的识别在血清存在或不存在的情况下都是相同的，这表明结合不需要血清辅因子。9D2与阴离子磷脂的结合不需要Ca"离子，而膜联蛋白V的结合则需要Ca"。在经PS包被的平板上的交叉阻断研究显示，9D2和膜联蛋白V不会相互阻断与PS的结合。这表明所述两种试剂识别PS分子上的不同表位，或更有可能识别不同包装形式的PS。膜联蛋白V被认为结合平坦的PS表面，而抗PS抗体则被认为结合六角形包装的PS(Rauch和Janoff，1990)。两种形式都可能存在于经PS包被的平板上。这些实际的交叉阻断研究(实施例VI)还用于表明，一旦提供参照抗体(例如9D2),就能容易地鉴别出有效地竟争结合阴离子磷脂的抗体，即与参照抗体结合基本上相同表位的抗体。本申请还显示，9D2抗体和膜联蛋白V特异性地定位于肿瘤血管和定位于在体内检测的所有肿瘤的坏死区域内和周围的肿瘤细胞(实施例VI)。肺瘤中15-40%的血管具有磷脂酰丝氨酸阳性内皮。相反，正常组织中没有血管具有可检测的外在化阴离子磷脂。表达PS的肿瘤内皮细胞是有活力的。它们缺乏细胞凋亡标记物(活性胱天蛋白酶-3,TUNEL)，在形态学上是完整的并且是代谢活跃的，并且血管有输送血液和溶解物的功能。9D2对肿瘤血管系统的染色特异性通过以下几点得到证明1)用对照大鼠IgM则无肿瘤血管的染色；2)用由阴离子磷脂制备的脂质体可以阻断体外9D2或膜联蛋白V与经H202处理的内皮细胞的结合，而由中性磷脂制备的脂质体则不能；3)发现用去污剂或有机溶剂从胂瘤切片提取出磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜联蛋白V都不定位于正常器官中的静止内皮上。肺瘤血管系统中由9D2或膜联蛋白V定位的主要阴离子磷脂是磷脂酰丝氨酸，因为它是最丰富的阴离子磷脂，并且它在细胞表面上的暴露受环境变化或损伤的调控。为了检验肿瘤内皮细胞上阴离子磷脂暴露的机制，进行了一系列的研究，其中用已知存在于肿瘤微环境中的各种因子和条件来处理体外的内皮细胞(实施例VII)。低氧后复氧、酸性和凝血酶使PS在活内皮细胞上的暴露提高至当所有细胞均凋亡时所观察到的水平的10-22%。炎性细胞因子(TNFoc和IL-1)也会微弱但明确地诱发PS暴露。这些发现与下列可能性相一致在肿瘤中，低氧/复氧结合炎性细胞因子、凝血酶和酸性会诱导磷脂酰丝氨酸暴露于血管内皮上。尽管对于实施本发明来说并不需要了解确切的机制，但肿瘤细胞可能以作为代谢的副产物或对低氧的响应而产生ROS(Zulueta等人，1995)。肿瘤细胞释放的细胞因子可能诱导了内皮上的白细胞粘附分子，其介导活化的巨噬细胞、多形核细胞和血小板与肺瘤内皮粘附，和进一步的R0S分泌。然后，ROS可能通过含巯基的转运分子的氧化或脂质的过!U匕来i秀导PS详多4立(Herrmann和Devaux，1990)，这可能通过引起0&2+流入或从细胞内贮备中释放Ca"而实现(Wang和Joseph，2000)。事实上，过氧化物已显示可在体外通过涉及谷胱甘肽氧化和/或脂质过氧化而不是细胞凋亡的机制来诱导活内皮细胞上的PS暴露(vanGorp等人，1999)。PS和其他阴离子磷脂的暴露在某种程度上解释了长久以来认识到的肿瘤内皮的促凝血状态(Donati和Falanga，2001)。阴离子磷脂提供了用于凝血因子聚集和装配的表面(Bevers等人，1985;Dachary-Prigent等人，1996)。它还为帮助白细胞浸润入肺瘤中的循环性巨噬细胞(McEvoy等人，1986)、T、淋巴细胞(Qu等人，1996)和多形核细胞提供了附着位点。在本文中所详细描述的进一步研究中，本发明人创造并表征了称为3G4的单克隆抗体，其针对磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂。这种抗体还显示出特异性定位于肿瘤中的血管内皮细胞，减少肿瘤的血管供应(vascularity)和血浆容量并且延緩肺瘤生长。在血清或P2-糖蛋白I存在下，3G4抗体以高亲和力结合吸收在塑料上的阴离子磷脂，以及在激活或凋亡的细胞表面上的阴离子磷脂。细胞上的3G4结合模式与针对阴离子磷脂的膜联蛋白A5或9D2抗体的模式没有区别。所有3种试剂结合类似于膜泡的质膜簇，这与在用11202处理的内皮细胞上的其他观察一致(vanGorp等人，1999)。如同9D2，3G4识别所测试的所有阴离子磷脂，包括对氧化有抗性的具有饱和脂肪酸的合成磷脂，和溶血磷脂。不像9D2，3G4与阴离子磷脂的结合在血清完全不存在下被部分抑制，并且当添加P2-糖蛋白I时恢复。因此，3G4识别脂质-P2-糖蛋白I复合物中的表位。无关地，3G4当施用于动物时显示是安全的，并且与在文献中报道的与抗磷脂综合征(APS)有关的抗体的病理学效应不相关。在注射到带有同位人乳腺MDA-MB-435肿瘤的小鼠中后，3G4特异地定位于肿瘤血管以及定位于在肿瘤坏死区域内和周围的肿瘤细胞。平均40±10。/。的血管被3G4结合。染色模式类似于本文报道的使用9D2和膜联蛋白A5时的那些。正常组织中的血管内皮不被染色。在这点上，3G4与识别肿瘤血管标记物的其他抗体不同。大多数胂瘤血管标记物存在于在卵巢(生理性血管发生的部位)中或在肾和胰岛(其中血管具有高渗透性)中的血管上(Thorpe,20(M)。磷脂酰丝氨酸是主要被3G4检测的阴离子磷脂。PS是最丰富的阴离子磷脂，并且是其暴露最熟知受环境条件或损伤调节的阴离子磷脂(Zwaal和Schroit，1997;Balasubramanian和Schroit，2003)。在体内，肿瘤血管上暴露的PS很可能与血清组分例如P2-糖蛋白I复合，并且3G4很可能结合这些复合物。如本研究自始自终所指明的，在未处理的小鼠中的PS阳性肿瘤血管看起来是完整的并且是有功能的。它们输送血液并且是可灌注的。PS阳性血管的血管内皮不显示晚期凋亡的标记物(活性胱天蛋白酶3，TUNEL)，是形态学完整的，并且是代谢活跃的，如通过快速周转蛋白(rapidlyturnedoverprotein)VCAM-1的共表达所判断的。使用3G4的治疗延緩了各种鼠类模型中的肿瘤生长，包括已建立的(0.6-0.7cm直径)同位人MDA-MB-231和MDA-MB-435乳癌，大的(1cm直径)皮下L540人何杰金氏肿瘤，和小的同系MethA纤维肉瘤。3G4治疗导致这些肿瘤的生长分别延緩75%、65%、50%和90%。在本申请中的其他研究证实，这些肿瘤被具有暴露的阴离子磷脂的血管系统滋养。3G4的抗肿瘤效应至少部分通过损害胂瘤血管系统介导。来自用3G4处理的小鼠的同位MDA-MB-231肿瘤的组织学检查显示，肺瘤的血管密度和血浆含量明显减少。3G4至肺瘤血管的定位在巨噬细胞结合肿瘤血管、血管功能损害和坏死发生之前。血管关闭和坏死模式与该首要效应位于肺瘤血管上相一致。观察到肿瘤中心性坏死，而周围边缘的肿瘤细胞存活。这种模式的肿瘤细胞杀死是VTAs的特征(美国专利5，855，866;Thorpe，2004)。认为VTAs针对肿瘤内部血管是最有效的，因为在这些区域中的高间隙压促使血管崩溃。相反，许多直接作用的肿瘤疗法则针对在富氧的肿瘤外周中快速分裂的胂瘤细胞是最有效的。本发明人因此期望，将3G4与抗增殖的抗肿瘤疗法组合将会产生另外的或甚至协同的抗肿瘤活性，如在实验性实体瘤中用其他VTAs已观察到的(美国专利5，855，866;Burrows和Thorpe，1993;Siemann等人，2002;Sum等人，2004)。如同本文使用的其他抗体一样，3G4疗法在用治疗剂量(在小鼠中4mg/kg,—周3次)重复治疗的带有肿瘤的动物中是良好耐受的。小鼠保留正常的体征、凝血参数、骨髓细胞构成、白细胞计数和组织学。没有观察到APS的表现，这与使用抗心磷脂抗体所观察到的那些相反(Matzinger，1998;Fadok等人，1998;Fadok等人，2001a;b)。尽管高浓度3G4的效应可部分抑制磷脂依赖性凝血途径，但在治疗剂量和延长体内凝血时间的剂量之间存在基本安全范围。本发明人已考虑了关于在非恶性损伤(例如动脉粥样硬化病变、炎症部位)中PS是否会变得暴露在血管内皮上的问题，在所述非恶性损伤中细胞因子、4氐氧和R0S可能诱导PS转位(Moldovan等人，1994)。这发生了，那么这可能可以导致伴随抗PS抗体的某些毒性，从而使得排除具有来自治疗的这些状况的患者是合适的。然而，本发明人的其他研究显示，用嵌合形式的3G4抗体治疗动脉粥样硬化的家兔不会加重主动l^的动乐^粥辨^更4匕病变。采用药物或凝血剂的血管靶向剂已显示高度有效，并且有时治愈具有大实体瘤的小鼠(Huang等人，1997;Nilsson等人，2001;美国专利5，660，827、5,776,427、5,855,866、5,863,538、5,965,132、6，004，554、6，051，230、6，261，535、6，093，399、6，004，555、5，877，289和6，036，955)。本发明人提供了针对磷脂酰丝氨酸的棵露抗体和血管靶向剂以用于在人类癌症的诊断和治疗中靶向肿瘤血管系统。尽管不需要对针对磷脂酰丝氨酸的棵露抗体如何在胂瘤治疗中发挥作用有准确的分子水平的了解以便实践治疗，本发明人还是考虑了可能造成所观察到的内皮细胞杀死现象的几种机制。最可能的机制(尤其是对于本文所述的3G4抗体来说)是Fc结构域介导的免疫效应器功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体介导的吞噬作用。细胞介导的细胞毒性、补体介导的细胞裂解和/或凋亡、抗体诱导的细胞信号传导和/或对细胞骨架的扰乱也可能涉及在内。针对磷脂酰丝氨酸的完整抗体，尤其是3G4，与血管内皮细胞表面的结合意味着抗体的Fc部分突入血管的内腔中。由于抗体Fc片段激活了补体途径，所以观察到的细胞破坏可能是补体指导的细胞裂解的结果。因此抗体结合激活了补体依赖性凝血级联反应，引起多组分复合物进行装配并最终产生能穿透靶细胞的裂解复合物。"补体激活的ADCC，，还可在破坏中起作用，其中补体与被抗体包被的靶细胞结合，并且其中具有补体受体的细胞，如嗜中性粒细胞，会裂解靶细胞。当棵露或未缀合的抗体，包括其抗原结合片段，与在肿瘤血管内皮细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合时，它们将在内腔表面上形成抗体包被层。这可以起到吸引免疫效应细胞例如细胞毒性T细胞和/或天然杀伤(NK)细胞的这样作用，然后免疫效应细胞将在血管内皮细胞上发挥细胞介导的细胞毒性效应。与磷脂酰丝氨酸结合的抗体还可诱导肿瘤血管内皮细胞中的细胞凋亡。尽管尚无关于与PS结合的抗体真正诱导凋亡的已知报道(而非PS是由凋亡产生的标记物)，本发明人仍考虑这可能是所观察到的抗肿瘤效应的另一可能机制。还可能的是，抗体与肿瘤血管内皮细胞表面上的磷脂酰丝氨酸结合可引起细胞的细胞骨架组织紊乱。由于细胞骨架在表面膜的组织中起着重要的作用，且由于抗体结合可能扰乱(或进一步扰乱)膜，所以抗体与磷脂酰丝氨酸的结合可能将变化传递至与双分子层相互作用的细胞骨架蛋白。已知细胞骨架蛋白的空间结构控制膜的稳定性和细胞形状，并且有可能某些细胞骨架平衡状态的扰动可能对细胞的完整性具有深远的影响。本发明另一种作用机制可能是所述抗体与内皮细胞表面上的磷脂酰丝氨酸结合可能通过目前未确定的途径起始信号转导。抗体结合还可能扰乱已知的信号转导途径，例如通过改变膜受体、信号转导蛋白、膜通道等的构象和/或相互作用。关于细胞破坏(凋亡)的信号可能被引发或模拟，和/或保护/内环境稳定的信号可能被抑制。尽管存在科学方面的意义，但实施本发明无需确定针对磷脂酰丝氨酸的棵露抗体所造成的血管破坏的确切性质。既然这些抗体的施用已显示在体内有利地产生了特异性抗肿瘤效应，那么该疗法就能应用，而不管造成此现象的分子机制是什么。因此，结合磷脂酰丝氨酸的棵露抗体的应用代表了肺瘤疗法中的一个重要进展，其在制备和成本上都具有优势。C.3G4抗体的详细分析如本文所示，3G4是有效且良好耐受的抗肿瘤剂，其通过导向肿瘤血管上的磷脂酰丝氨酸并引起宿主细胞介导的抗肿瘤效应起作用。因为PS在人和小鼠中是相同分子，并且在这两个物种中具有相同的细胞分布、调节和通过ROS的诱导(Balasubramanian和Schroit，2003;Whitworth等人，1990)，所以这些研究进一步支持结合磷脂酰丝氨酸的抗体和其他构建体在人类中治疗癌症的用途。实际上，已制备了嵌合和人源化形式的3G4用于这个及其他目的。结合磷脂酰丝氨酸的抗体及其他配体因此可以用于靶向、成像和/或治疗肿瘤血管。由于下列几个原因，磷脂酰丝氨酸作为肿瘤靶血管是吸引人的它是丰富的(PS以3x106分子/细胞的量存在)；它在肿于通过血液中的血管耙向剂的结合来说其是可直接接近的；它在不同实体瘤中在较大百分比的肿瘤内皮细胞上存在；并且它在所有正常组织的内皮上基本上不存在。3G4抗体已显示特异性地定位于肿瘤中的血管内皮细胞，减少肺瘤血管供应和血浆容量，并延緩肿瘤生长(本文的实施例；Ran等人，1998;Ran和Thorpe，2002;Ran等人,2002b;Ran等人，2005;Huang等人，2005)。正在进行的研究已显示，3G4治疗抑制了鼠类肿瘤同种异体移植物和人肺瘤异种移植物的生长(本文的实施例；Ran等人，2005),包括同位人乳腺肿瘤(实施例XX;Huang等人，2005)和同位人胰腺肿瘤(实施例XX;Beck等人，2005)。3G4还抑制这些肺瘤的转移扩散和生长(实施例XX;Huang等人，2005;Beck等人，2005)。当组合使用时，3G4增强了分别用于治疗乳腺肿瘤和胰腺肿瘤的化学治疗药物多西他赛和吉西他滨的治疗效用(实施例XX;Huang等人，2005;Beck等人，2005)。如同本文使用的其他抗体一样，3G4疗法在用治疗剂量(在小鼠中4mg/kg,—周3次)重复治疗的带有肿瘤的动物中是良好耐受的。小鼠保留正常的体征、凝血参数、骨髓细胞构成、白细胞计数和组织学。尽管非常高浓度的3G4的效应可部分抑制磷脂依赖性凝血途径，但在治疗剂量和延长体内凝血时间的剂量之间存在基本安全范围。3G4因此是有效且良好耐受的抗肿瘤剂，其通过导向肿瘤血管上的阴离子磷脂并引起宿主细胞介导的抗肿瘤效应起作用。3G4与在文献中对于与抗磷脂综合征有关的抗体所报道的致病效应没有关联。抗磷脂综合征(APS)与称为"抗心磷脂"抗体和"狼疮抗凝剂抗体，，的自身抗体有关。这些综合征与向着静脉和动脉血栓栓塞、血小板减少症和许多神经学综合征的倾向相关联。这些患者中的抗磷脂抗体因此是"致病抗体"。在人群中此类抗磷脂抗体存在于全身性红斑狼疮中(Branch等人，1987;Staub等人，1989;Drouvalakis和Buchanan,1998;Smirnov等人，1995;Rauch等人，1986;Rauch和Janoff，1990)，并且习惯性自然流产相关(Rote等人，1995;Rote,1996;Vogt等人，1996;1997;Katsuragawa等人，1997)。尽管作为"抗磷脂抗体"和"抗PS抗体"被描述了多年，但此类致病抗体事实上识别结合心磷脂、PS或两者的蛋白质辅因子，而不是磷脂本身(Galli等人，1990;1993;McNeil等人，1990;Rote,1996)。在致病抗体中存在相当大的异质性。已报道某些抗心磷脂抗体识别p2-糖蛋白I上的特定区域，而狼疮抗凝剂抗体识别凝血酶原。类似地，在疾病状态下出现的抗PE抗体结合与蛋白质组合的PE，所迷蛋白质为例如低和高分子量激肽原(HK)、前激肽释放酶和因子XI(Sugi和Mchityre，1995;1996a;1996b)。因此，在选择用于作为治疗剂进行施用的抗体时，认为此类抗体应当基于不结合与蛋白质辅因子组合的磷脂酰丝氨酸来进行鉴定，而应当寻找相当"真正的"抗磷脂酰丝氨酸抗体(W02004/006847)。然而，3G4抗体的进一步体外研究显示，与9D2不同，3G4与磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂的结合在血清完全不存在下被部分抑制。此外，当添加P2-糖蛋白I(p2GPI)时发现结合恢复。这促使本发明人相信，3G4识别脂质-P2GPI复合物中的表位，从而使得3G4和PS之间的相互作用依赖于P2GPI(于2005年1月24日提交的美国临时申请序列号60/646,333;Ran等人，2005)。本发明人推断，在体内肿瘤血管上暴露的PS很可能与血清组分例如P2GPI复合，并且3G4很可能结合这些复合物。304结合？3-P2GPI复合物的潜力是非常惊人的，不是至少因为3G4在众多研究中当施用于动物时已显示是安全的，且在文献中对于与APS有关的抗体所报道的致病效应不相关，那种抗体已知结合磷脂-血清蛋白质复合物，包括PS-02GPI复合物。在任何3G4治疗中没有观察到APS的表现，这与使用针对P2GPI的抗心磷脂抗体所观察到的那些相反(Matzinger，1998;Fadok等人，1998;Fadok等人,2001a;b)。在延长的时期内用高剂量的3G4治疗的小鼠显示凝血能力没有改变，然而当小鼠注射抗心磷脂或狼疮抗凝剂抗体时有APS应答。本发明解决了这个矛盾，阐明了对于结合具有暴露的PS的内皮细胞所需的3G4和p2GPI的相互作用，并解释了3G4如何能够结合PS-p2GPI复合物，而不屈从于与以前已知的致病抗体相关的毒性。如实施例XXX中所示，3G4和PS之间的相互作用依赖于P2GPI。尽管P^PI在生理条件下微弱结合阴离子磷脂，但本发明显示，3G4极大地增强了P2GPI与PS阳性内皮细胞的结合。数据显示，二价3G4/p2GPI复合物是增强结合所需的，因为3G4Fab'片段不结合具有暴露的PS的内皮细胞。还证实了，人工二聚P2GPI构建体无需3G4即可结合具有暴露的PS的内皮细胞。总之，这些数据暗示，通过经由形成二价3G4/p2GPI复合物而增加P2GPI对PS的亲和力，3G4靶向PS阳性细胞，包括肿瘤内皮细胞。实施例XXX还显示，3G4结合P2GPI的结构域I1。这是重要的，因为来自APS患者的识别p2GPI结构域II的抗体不是致病的。相反，一个重要的近期研究证实，从APS患者分离的致病性抗02GPI抗体通常识别p2GPI的结构域I(deLaat等人，2005a)。3G4抗体无需结合P2GPI结构域I而结合PS-P2GPI复合物的能力对于缺乏抗体所显示的毒性方面是重要的。P2GPI还可与载脂蛋白E受体2'(apoER2')相互作用(Lutters等人，2003)。另一项近期研究指出，p2GPI的结构域V与apoER2'相互作用并且涉及血小板的激活，这导致血小板至胶原的沉积增力口(■L画el等人，2005)。因此，通过不结合结构域I或结构域V，3G4抗体可以结合PS-p2GPI复合物，并根据在各种动物模型中进行的广泛毒理学研究仍显示没有毒性。根据这些发现，结合PS-P2GPI复合物的其他抗体现在已制备并在各种病状例如癌症和病毒感染的治疗中安全使用。选择不显著结合P2GPI结构域I的抗体目前是主要需求，并且设想选择不显著结合卩2GPI结构域I或p2GPI结构域V的抗体以提供另外的优点。在回顾中，新研究已表征了3G4抗体及其主要阴离子磷脂靶(磷脂酰丝氨酸)之间的相互作用。数据证实3G4和PS之间的相互作用是血清依赖性的。|32GPI被鉴别为介导3G4-PS相互作用所需的血清因子。3G4最初通过用鼠类内皮细胞免疫小鼠而产生，所述鼠类内皮细胞用H202处理以诱导PS暴露(ExampleIV;Ran等人，2005)。细胞生长在含FBS的培养基中并可能注射少量牛p2GPI,导致产生抗PS/P2GPI抗体。在牛血清存在下就与PS的反应性篩选初始抗体。稍后的筛选在血清不存在下进行，但如本文所指出的，从SCM纯化的抗体与P2GPI抗原一起共纯化。因此，由于存在污染性的牛P2GPI,"纯化的"抗体在血清不存在下可以结合PS。只有当3G4在不含血清的培养基中生长并从中纯化时，才能鉴定出血清依赖性。其他团体已报道了关于荻得不含P2GPI的抗P2GPI抗体制剂的类似关注(Roubey等人，1995)。因此，很可能被报道直接结合磷脂的许多所谓的"抗磷脂抗体"实际上识别对磷脂具有亲和力的血清蛋白质。P2GPI是50-kDa的糖蛋白，其以~200pg/mL(4jaM)的浓度存在于血浆中(Cleve等人，1969)。该蛋白质是补体调控蛋白(CCP)家族的成员(Steinkasserer等人，1991)。P2GPI具有5个CCP重复，其中第l个-第4个结构域是由~60个氨基酸组成的有规律的重复。第5个结构域不同于其他4个结构域，因为它具有82个氨基酸，包括一串带正电荷的氨基酸(282-287)和负责02GPI与阴离子磷脂结合的保守性疏水区(311-317)(Steinkasserer等人，1992;Hunt和Krilis，1994;Sheng等人，1996;Mehdi等人，2000;各自引入本文作为参考)。关于p2GPI的正常生物学功能知之甚少。提出的功能包括促进凋亡细胞清除(Balasubramanian等人，1997b;Balasubramanian等人,2005)、血小板功能的调节(Nimpf等人，1985;Nimpf等人，1987)和凝血的抑制(NUpf等人，1986;Schousboe，1985);然而，在缺乏P2GPI的小鼠或患者中没有观察到确定的表型(Miyakis等人，2004;Yasuda等人，2000)。相反，众所周知P2GPI涉及自身免疫性病症APS，在其中它已被鉴定为对于所谓的抗磷脂(aPL)抗体与阴离子磷脂表面结合所需的血浆辅因子(deLaat等人，2004a;Bevers等人，2004)。抗磷脂抗体已知与各种血清蛋白质相互作用，但识别P2GPI的aPL抗体与APS的临床症状的关联性最强(deLaat等人，2004b)。因此，已广泛研究了j32GPI、抗P2GPI抗体和阴离子磷脂膜表面之间的相互作用(Bevers等人，2004)。本研究还检查了3G4结合经PS包被的微量滴定板和具有暴露的PS的内皮细胞的特征。使用活细胞结合测定法，确定3G4和P2GPI都不结合具有暴露的PS的内皮细胞，除非两种分子同时存在(实施例XXX)。这个观察结果与基于ELISA的发现一致，所述发现证实3G4在结合至阴离子磷脂表面方面依赖于P2GPI。此外，这个观察结果支持了关于卩2GPI在生理条件下对阴离子磷脂膜具有低亲和力的报道(Wi1lems等人，1996;Bevers等人，2004;Bevers等人，2005)，并暗示了3G4的存在极大地增强了亲和力。数据还证实，3G4经由形成二价^2GPI复合物增强了P2GPI对阴离子磷脂表面的亲和力。当P2GPI浓度保持不变并且3G4浓度增加时，3G4/P2GPI与具有暴露的PS的内皮细胞的结合在3G4与P2GPI的比率为2:1时到达峰值。在3G4浓度更高时，结合增加。钟形曲线暗示单价和二价复合物之间有竟争，导致总体3G4/P2GPI复合物结合减少。对于血栓形成模型中的抗P2GPI抗体已报道了钟形曲线关系(Jankowski等人，2003)。在其他研究中，3G4Fab片段在p2GPI存在下不结合具有暴露的PS的内皮细胞，这证实单价3G4/P2GPI复合物不能结合阴离子礴脂表面。还证实了人工二聚p2GPI构建体无需3G4就可结合具有暴露的PS的内皮细胞。因此，抗P2GPI抗体通过交联两个P2GPI分子，形成二价P2GPI复合物，而增加了P2GPI对阴离子磷脂表面的亲和力。重要地，尽管3G4/P2GPI复合物与PS的相互作用很类似来自APS患者的aPL抗体，但3G4在测试的任何动物模型中都不引起APS的临床表现。aPL引起APS的机制大部分仍是未知的。某些研究提出，aPL/p2GPI可以结合并激活静止的内皮细胞(其不暴露PS),导致它们采取更具有血栓形成性的表型(Simantov等人，1995;Pierangeli等人,1999)。更近期的研究证实，p2GPI和aPL/P2GPI复合物不能结合和完全激活内皮细胞除非它们已"预激活，，(Chen等人，2004)。预激活导致内皮细胞暴露PS，从而提供了用于结合aPL/P2GPI复合物的合适的阴离子磷脂表面。在活细胞测定法中3G4不结合静止的ABAE细胞或HUVEC。此外，3G4不激活静止的HUVEC或用低浓度LPS预激活的HUVEC。近期研究报道了识别患者血清中的P2GPI结构域I的aPL抗体存在与APS临床症状之间的高度相关性(deLaat等人，2005),并且构象变化可能是抗体结合所需的(deLaat等人，2005b)。还在患者血清中检测到识别P2GPI的其他结构域的抗体，但其与发病机理无关。重要地，本发明证实了3G4识别P2GPI的结构域n，这可能解释了体外内皮细胞激活的缺乏以及体内毒性的缺乏。小鼠P2GPI的结构域II在60个氨基酸中只有7个不同于大鼠、狗、牛、黑猩猩和人l32GPI的结构域n。因此，3G4不能在小鼠血清存在下结合PS或不能通过免疫印迹检测鼠类P2GPI是出人意料的，尤其是考虑到已证明的3G4在小鼠中的抗肿瘤活性(本文的实施例；Ran等人，2005;Huang等人，2005;Beck等人，2005)。重要地，使用由SCM纯化的3G4进行这些研究。如本文所示，由于牛P2GPI的共纯化，3G4SCM能够结合PS。当3G4SCM在SDS-PAGE凝胶上电泳、转移至膜支持物并就牛P2GPI的存在进行探测时，50kDa的条带是清晰可见的。此外，在注射3G4SCM后从小鼠收集的血清中存在的3G4结合PS。因此，牛P2GPI能够介导3G4与PS在小鼠血浆中的结合并可能促进3G4的抗肿瘤效应。使用3G4在小鼠中进行的所有肿瘤研究应当补充牛或人P2GPI以确保乾向具有暴露的PS的肿瘤内皮细胞。将P2GPI鉴定为3G4和PS之间相互作用所需的重要辅因子极大地增强了这种独特的肿瘤血管靶向剂的了解。通过经由形成二聚P2GPI复合物而增强P2GPI对阴离子磷脂表面的亲和力，3G4靶向具有暴露的PS的肿瘤内皮细胞。除了阐明这些特性外，本研究现在允许开发第三代抗体，其结合在具有血清蛋白质的复合物中的氨基磷脂和阴离子磷脂，而不复制致病抗体的特性。总之，现在可以选择在除P2GPI结构域I内以外的位置处，或者在除P2GPI结构域I或结构域V内以外的位置处结合PS和P2GPI的优选的"第三代"或"非致病性PS-|32GPI抗体，，。根据本文的数据，目前最优选的抗体是在结构域II内结合P2GPI的那些。根据本文描述的方法和篩选技术，例如使用图18A和图18B中的序列信息和实施例XXX中的结合测定法可以制备一系列非致病性PS-P2GPI抗体。此类抗体及其免疫缀合物可以有利地用于病毒感染的安全且有效的治疗以及用于癌症和其他疾病治疗中。D.受体-抗体和p-抗体3G4抗体的前述详细分析以及特别是3G4与p2GPI的相互作用(其与W02004/006847中所阐述的形成对比)还促使本发明人开发出本发明的受体-抗体。重要地，这个发明还提供了称为"受体-抗体"的一系列构建体，其结合磷脂酰丝氨酸并唤起宿主效应器功能。受体-抗体开发的方面在下文描述。本文呈现的数据显示，用针对磷脂酰丝氨酸的抗体靶向肿瘤血管系统在肿瘤治疗中是有效的。针对磷脂酰丝氨酸的抗体也显示出在治疗病毒感染中是有效的。考虑肿瘤研究作为例子，本文显示肿瘤微环境中的应激条件诱导肿瘤血管内皮上的磷脂酰丝氨酸暴露(实施例VII、实施例II、实施例V和实施例VI)。暴露的磷脂酰丝氨酸提供了用于成像和治疗的肿瘤血管系统的选择性标记(实施例IX、实施例X、实施例XI和实施例XX)。与肿瘤治疗相关联，针对磷脂酰丝氨酸的抗体损害肿瘤内的血管并引起白细胞浸润(例如，图l)。此外，此类抗体的施用将巨噬细胞募集到肿瘤内。例如，在使用3G4抗体的肿瘤治疗研究中，可见血液单核细胞与肿瘤血管内皮的广泛结合以及巨噬细胞大量浸润到肿瘤间质中(例如实施例XXVII;图6A、图6B、图"和图60)。巨噬细胞浸润到接受治疗的肿瘤中，以及3G4以Fc依赖性方式使骨髓衍生小鼠巨噬细胞在体外对表达PS的细胞的吞噬速率增加5倍这一发现，是与抗体例如3G4激起巨噬细胞对于肿瘤血管或肿瘤细胞的细胞毒性相一致的。此外，3G4不直接抑制表达PS的内皮细胞或肿瘤细胞增殖，或在体外介导细胞的补体裂解，这暗示该抗体不是直接细胞毒性的。因此，本发明人提出了巨噬细胞介导的对于肿瘤血管或肿瘤细胞的损害的两种可行机制。首先，抗体例如3G4结合肿瘤血管和肿瘤细胞上的阴离子辨脂(主要是磷脂酰丝氨酸)和血清蛋白质的复合物。随后，抗体经由FcY受体刺激单核细胞和巨噬细胞的结合，从而增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性巨噬细胞吞噬作用。激活的巨噬细胞已长久地被认为具有直接的杀肿瘤活性(Whitworth等人，l"0)。在对于这一点的支持方面，Manfredi等人(1998)已才艮道，抗磷脂抗体可以促进具有TNF-a分泌的大量诱导的清道夫巨噬细胞对于表达PS的细胞的调理作用。尽管巨噬细胞具有PS受体并且可以结合和吞食表达PS的细胞(Balasubramanian和Schroit，2003;Utsugi等人，199l;Fadok等人，2001a)，但单独的PS暴露不足以刺激吞食(Devitt等人，2003)。其次，抗体例如3G4可以阻断来自表达PS的肿瘤内皮细胞的由PS介导的"静止期，，信号，这通常将会抑制由结合肿瘤血管和肿瘤细胞的巨噬细胞所作出的炎症应答(图7)。认为类似机制可以解释巨噬细胞语系细胞对凋亡细胞缺乏炎症应答(Henson等人，2001;Matzinger，1998;Gallucci和Matzinger，2001;Fadok等人，2001b)。因此，抗体例如3G4可以通过激起巨噬细胞分泌TNF-ot、IL-l及其他炎性细胞因子来引起肿瘤血管损害，所述细胞因子直接损害肿瘤内皮(图7)并将更多的宿主细胞募集到肿瘤中(Fadok等人，1998)。理想地，上述可能机制中的每一个应当符合于肿瘤相关的巨噬细胞可以诱导肺瘤血管发生这一建议，所述肿瘤血管发生促进肿瘤生长(例如Sunderkotter等人，1994)。因此，本发明人推断，在巨噬细胞的促血管生成效应和其对肿瘤血管和肿瘤细胞的直接细胞毒性效应之间存在平衡，这通过肿瘤微环境中的局部条件(例如低氧，TGF-P)确定(Breier等人，2002)。目前设想，抗体例如3G4以有利于来自巨噬细胞的直接细胞毒性应答的方式改变肿瘤微环境。考虑到磷脂酰丝氨酸的生物学，和任选地根据本文呈现的关于巨噬细胞在肺瘤治疗中的行为的数据，本发明人从而提供了一系列有利的结合磷脂酰丝氨酸并任选结合其他阴离子磷脂的构建体或"受体-抗体"，和相关缀合物以及使用方法。本发明的此类构建体或受体-抗体一般将包括识别并结合磷脂酰丝氨酸并且任选结合其他阴离子磷脂的结合蛋白或多肽、受体、配体或肽，所述结合蛋白或多肽、受体、配体或肽连接至抗体或免疫球蛋白Fc区或结构域。Fc区修饰所述结合蛋白或多肽、受体、配体或肽以增加其生物学半衰期，但更重要的是，提供具有刺激宿主效应器功能的所得构建体以增强疾病治疗。本发明的受体-抗体可以在任何这样的实施方案中使用，在所述实施方案中可以使用针对磷脂酰丝氨酸的抗体。此类受体-抗体因此具有多重应用，包括结合肿瘤血管和肿瘤细胞上的磷脂酰丝氨酸，导致对肿瘤的由宿主细胞介导的抗血管和抗细胞效应，和结合在病毒或受病毒感染的细胞上的磷脂酰丝氨酸，导致动物中的抗病毒效应。本发明的这些方面的一个优点是，所述受体-抗体使用天然的磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽或受体以达到特异性结合。尽管在本文中显示出使用针对磷脂酰丝氨酸的抗体在许多治疗实施方案中是有效的，但受体-抗体可以具有比抗PS抗体更高的亲合力或特异性。通过在Fc免疫球蛋白区域上二聚化磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽(特别是p2GPI),构建体达到更佳的亲合力、稳定性、更长的体内半衰期，并且可能更好地定位于表达磷脂酰丝氨酸的组织，以及刺激体内宿主效应器功能。抗PS抗体在本文中显示出在施用给动物(包括猴子)时是有效且安全的。同样地，包含天然配体的受体-抗体将是有效且安全的，并且不会引起抗磷脂综合征。因此，本发明的受体-抗体是简单的、人的、特异的和安全的治疗剂，其可以用于治疗一系列肿瘤和病毒感染。Dl.磷脂酰丝氨酸结合蛋白受体-抗体中的结合蛋白或多肽、受体、配体或肽可以是几种磷脂酰丝氨酸结合蛋白中的任何一种，包括细胞来源的受体、因子v、凝血酶原(因子II)等等。使用P2-糖蛋白I是更优选的。凝血级联反应中的某些因子也结合磷脂酰丝氨酸并且因此可以用于本发明的受体-抗体中。例如，因子V和凝血酶原(因子II)结合磷脂酰丝氨酸。在凝血酶原酶复合物中，因子Va与阴离子脂质表面的结合促进因子Xa的Ca"依赖性结合，所述因子Xa将凝血酶原转化为凝血酶。在两种复合物中，磷脂酰丝氨酸是最有效的阴离子磷脂。因此可以使用蛋白质C、蛋白质S、因子II/IIa、因子V/Va、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa这些磷脂酰丝氨酸结合蛋白。Fadok等人(2000，特别引入本文作为参考)报道了直接结合凋亡细胞的PS受体的克隆。这种受体表达于许多细胞类型中，包括巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞。使用抗体和PS小泡的研究指明，该受体的确识别细胞表面上的磷脂酰丝氨酸。因此，这是PS特异性受体、"PS受体"或"PSr"(登录号AF304118)。这种受体存在于吞噬细胞例如巨噬细胞上，以及还存在于其他细胞类型上。Fadok等人(2000,特别引入本文作为参考)的PS受体因此可以用于本发明的受体-抗体中。可以用于本发明的受体-抗体中的其他磷脂酰丝氨酸结合蛋白描述在Balasubramanian和Schroit，2003(特别引入本文作为参考)中，特另ij地，参见Balasubramanian和Schroit，2003，表2，以及描述在本文引用的参考文献中，其全部特别引入本文作为参考。这些磷脂酰丝氨酸结合蛋白包括，例如，CD14;整合素，例如a5p3(玻连蛋白，CD51/CD61)和a5P3/CD36;几种清道夫受体，例如SRB(CD36)、SRC(L0X-1、SRCL)、SRD(CD68、巨噬涎蛋白)和PSOX;补体受体，例如CR3(CDllb/CD18)(登录号NM000632)、CR4(CDllc/CD18)(登录号NM000887)和CD93(cClqr，钙网蛋白)/CD91(a2-巨球蛋白受体)；及其他受体，例如对于表达PS的凋亡细胞的Mer/Gas6吞噬细胞识别配偶体(登录号AHOIOOOI)。尽管膜联蛋白例如膜联蛋白V可以用作受体-抗体中的磷脂酰丝氨酸结合蛋白，但其用途不是本发明的通用部分。因此，在某些实施方案中，本发明提供了其中磷脂酰丝氨酸结合蛋白不是膜联蛋白的构建体。但是，提供下列信息用于其中考虑了膜联蛋白的那些实施方案中。此外，在特别引入本文作为参考的膜联蛋白专利文件中的技术信息，例如关于表达和缀合的信息，可以用于支持本发明的其他Fc-磷脂酰丝氨酸结合蛋白构建体。在哺乳动物组织中已鉴定出膜联蛋白家族的至少9个成员(膜联蛋白I至膜联蛋白IX)。在这些之中目前优选的是膜联蛋白V(也称为PAP-I)。关于膜联蛋白的蛋白质和DNA序列是本领域已知的，这促进了容易地生产在本发明这些方面中使用的重组融合蛋白。引入本文作为参考的美国专利5，658，877描述了膜联蛋白I、膜联蛋白I的有效量及其药物组合物。还描述了治疗动物以预防或减轻内毒素在肺中的不利作用的方法，其包括将安全量的33kDa膜联蛋白I片段施用到动物的气道中。膜联蛋白V包含一个游离巯基并且不具有任何附着的糖链。由cDNA序列推导出的膜联蛋白V—级结构显示，膜联蛋白V包括4个内部重复单元(美国专利4，937，324;引入本文作为参考)。美国专利5，296，467和WO91/07187也各自引入本文作为参考，因为它们提供了包含膜联蛋白的药物组合物。WO91/07187提供了膜联蛋白的天然、合成或遗传制备的衍生物和类似物。提供了具有320个氨基酸的特定膜联蛋白，其包含不同氨基酸以及任选地在316-Cys和2-Ala之间包含二硫桥。美国专利5,296，467整体引入本文作为参考，包括所有附图和序列，用于更进一步描述膜联蛋白及其药物组合物的目的。美国专利5,296，467描述了膜联蛋白克隆、重组表达和制备。还公开了两个或更多个膜联蛋白的聚集物，所述膜联蛋白例如通过在各自膜联蛋白上的一个或多个半胱氨酸基团之间的二硫键而连接起来。适合的膜联蛋白起始材料的另一例子由WO95/27903(引入本文作为参考)提供，其提供了用于检测凋亡细胞的膜联蛋白。美国专利6，197，278特别引入本文作为参考，用于下列目的进一步使得能够获得和提供书面描述以支持一般意义上的膜联蛋白、其安全且有效的体内施用和成像实施方案。至它们清楚地描述用于制备本发明构建体的合适膜联蛋白起始材料的程度，美国专利5，627，036;WO95/19791;WO95/27903;WO95/34315;WO96/17618;和WO98/04294的诊断方法中的每一种也特别引入本文作为参考。这些不同文件还涉及有用的重组表达载体。还提供了美国专利5,632,986，用于进一步描述从组织提取物中分离的膜联蛋白(美国专利号4，937，324;同样引入本文作为参考)和通过重组方法生产的膜联蛋白的目的。美国专利号5，632,986的cDM克隆和表达栽体因此各自引入本文作为参考。美国专利5，632，986也特别引入本文作为参考，用于进一步描述膜联蛋白分子的突变体和变体的目的，所述突变体和变体在一个或多个氨基酸残基上再分或改变，只要磷脂结合能力基本上不降低。用于使用的合适膜联蛋白因此可以是截短的，例如，以包括一个或多个结构域或者包含比天然蛋白质更少的氨基酸残基，或者可以包含置换的氨基酸。任何改变都是可接受的，只要突变蛋白或第二代膜联蛋白分子不包含对于氨基磷脂基本上减少的亲和力。相同推论应用于除膜联蛋白外的其他蛋白质。国专利5，632，986中。简单地通过用血栓溶解剂置换本文描述的Fc区，可以调整所有此类技术以适合其用途。因此可以使用脂肪族二胺；琥珀酰亚胺酯；杂双官能偶联剂，例如SPDP;马来酰亚胺化合物；含间隔物的接头，等等。这些试剂还可与除膜联蛋白外的其他蛋白质一起使用。更进一步地，美国专利5，632，986被特别引入本文作为参考，用于描述包含膜联蛋白的缀合物的重组生产的目的。因此，将合适的核酸序列连接以产生嵌合编码序列，其从而产生嵌合蛋白。示例性的表达载体是pKK233-2(大肠杆菌(Aco7/))、DP0T(酵母)和pDSPl.1BGH(哺乳动物)。此类教导通过本文提供的进一步信息得到补充。，783，760和6，818，213各自特别引入本文作为参考，以用于下列目的进一步使得能够获得和提供书面描述以支持一般意义上的磷脂酰丝氨酸结合蛋白及其安全且有效的体内施用。这些专利公开了结合性配体组合物，其中治疗剂可操作地附着至乾向剂，所述靶向剂结合磷脂酰丝氨酸，优选暴露在血管化肺瘤的血管内腔表面上的磷脂酰丝氨酸，以及使用此类结合性配体及其组合的癌症治疗方法。尽管这些专利没有教导或提出连接至Fc区的磷脂酰丝氨酸结合蛋白，但将其涉及磷脂酰丝氨酸结合蛋白、所附着的治疗剂以及安全且有效的体内治疗方法的公开内容特别引入本文作为参考。美国专利6，312，694、6，783，760和6，818，213特别涉及结合性配体，其中治疗剂可操作地附着至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白。尽管这些专利中的蛋白质连接至治疗剂并用于递送不含Fc区的治疗剂至肿瘤血管系统，因而不诱发宿主细胞效应器功能，这些专利特别引入本文作为参考，用于进一步使得能够获得和描述蛋白质缀合物及其安全且有效的体内施用(包括治疗癌症)的目的。使用这些专利中的信息以及本公开内容中的教导，从而可以制备一系列受体-抗体，其中磷脂酰丝氨酸结合蛋白或其磷脂酰丝氨酸结合性片段，现在被连接至Fc区或结构域。P2-糖蛋白I(p2GPl)目前是在本发明的受体-抗体中使用的优选磷脂酰丝氨酸结合蛋白质。P2GP1，也称为载脂蛋白H，是50kDa血浆糖蛋白，其通过其C末端结合带负电荷的磷脂(Wurm，1984，特别引入本文作为参考)。提供下列登录号人BMPI(NP000033，AAP^OH和1C1ZA)和小鼠B2GPI(AAH53338，NP038503，CAA69401，BAB2721)。体外和体内证据表明，|32GPI在表达PS的凋亡细胞的清除中起作用(Chonn等人，1995;Balasubramanian等人，1997;Balasubramanian和Schroit，1998)。p2GPI与吞噬细胞的相互作用在性质上是静电的，并且蛋白质糖基化对于吞噬细胞识别来说不是关键的。因此，对于在受体-抗体中使用的p2GPI的重组生产没有明显障碍。当使用本发明中的P2GPI蛋白质、多肽或肽时，所得到的Fc-P2GPI构建体称为"p-抗体"。如本文图18A和图18B中所示，p-抗体将优选包括来自P2GPI结构域V的脂质结合区。包含整个结构域V的构建体可能是优选的以确保脂质结合。结构域V可以单独使用，或与其他4个结构域中的一个或多个一起使用。尽管使用全长P2GPI蛋白质是方便的，但不包含p2GPI结构域I的p-抗体在某些方面可以是优选的，因为来自APS患者的抗体通常识别P2GPI的结构域I(deLaat等人，2005a)。其他优选的P-抗体是其中两个p2GPI多肽在Fc区上二聚化的那些。此类P-抗体在本文显示出在结合在平板上和暴露在细胞表面上的磷脂酰丝氨酸中是有效的。然而，提供了制备二聚化和多聚化的p-抗体的其他方法，例如纳米颗粒、脂质体及其他分子支架。D2.Fc区Fc区将被附着、连接或缀合至磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽、受体、配体或肽，从而使得所得到的受体-抗体的所需活性基本上不会由于附着Fc区而被破坏。可以釆用本领域已知的任何缀合或接头技术，例如在本文相关部分描述的那些。需要时，可以使用分子生物学技术来制备融合蛋白，其现在对于本领域技术人员来说是标准作业，如本文再次示例的。因此，可以将受体-抗体制备为化学缀合物或融合蛋白。在免疫球蛋白的重链内，氨基末端结构域是可变结构域(VH)。重链和轻链的可变结构域在抗原结合中共同发挥作用。在重链中，可变结构域之后为下列3个恒定结构域CH1、CJ和羧基末端的CH3。在某些抗体中，存在第4个恒定結枸域Ch4。短的伸展部分，转换体(switch)，连接重链可变区和恒定区。铰链连接CH2和CH3(Fc片段)与抗体的其余部分(Fab片段)。恒定区的性质决定了除抗原结合以外的各种作用机制。基于其恒定区结构和免疫功能，抗体分为5个主要类别IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。相应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为H、Y、ot、5和s。考虑到Fc区提供的效应器功能(Bruggemann等人，l";IUechmann等人，1988;Clark,1997;Padlan，1994;各自特别引入本文作为参考)，目前优选的Fc区是用于临床使用的人IgGl(yl)和人IgG3(y3)，以及用于在小鼠中的临床前测试的小鼠IgG2a(y2a)和小鼠IgG2b(y2b)。认为y2是沉默的，因此将不选择来提供效应器功能，尽管它仍是用作二聚化结构域的有用的人蛋白质。尽管是根据效应器功能而被选择出的，但免疫球蛋白的Fc片还有助于延长的半衰期，这可以由抗体在肾内的主动再吸附而产生。尽管Fc区和结合构建体的重组表达是方便的，但此类片段还可以通过完整的免疫球蛋白的蛋白水解而获得，优选通过木瓜蛋白酶这种非特异性巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab片段，，，它们各自具有单个抗原结合部位，以及剩余的"Fc片段，，。木瓜蛋白酶首先应通过还原在含有半胱氨酸、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的活性位点中的巯基来激活。贮存的酶中的重金属应当通过用EDTA(2mM)螯合来去除以确保最大酶活性。酶和底物通常以1:100的重量比混合在一起。孵育后，反应可以通过用碘乙酰胺不可逆地烷基化巯基或简单地通过透析来中止。消化的完全性应当通过SDS-PAGE进行监控，并且各个级分通过A蛋白-Sepharose或离子交换层析进行分离。在某些实施方案中，可以使用两个Fc片段，优选两个人Fc片段。在这样的方面，两个结合蛋白、受体或配体可以与两个Fc片段相组合以制备另一种类型的二价受体-抗体。对于制备用于人施用的受体-抗体来说，人Fc片段将是优选的。事实上，这是本发明的优点，因为产生完全人的治疗性构建体。因此，Fc-P2GPI构建体包括完全人的P-抗体治疗剂。D3.其他构建体和栽体尽管连接Fc区至磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽是所述受体-抗体发明的优选实施方案，但磷脂酰丝氨酸结合蛋白还可连接至惰性载体以将长寿命赋予生物活性分子。像这样，本发明进一步提供了包含可操作地附着至至少第一种惰性载体的至少第一种氨基磷脂结合蛋白(包括P2GPI)的构建体。如本领域已知的，载体蛋白质可以用于增加生物学半衰期，并且示例性蛋白质是白蛋白和球蛋白，例如中性抗生物素蛋白(neutravidin)和链霉抗生物素蛋白。非蛋白质栽体也可用于增加生物学半衰期，例如天然或合成的聚合物，包括多糖和PEG。任何这样的惰性载体可以附着至本文描述的任何磷脂酰丝氨酸结合蛋白。本发明的其他方面涉及通过除使用Fc区以外的方法制备的P2GPI二聚体组合物，以及涉及各种使用方法。本发明特别提供了治疗癌症的方法和治疗病毒感染的方法，包括向有此需要的动物施用治疗有效量的P2GPI二聚体。本发明的再进一步方面是脂质体，其包含P2GPI多肽(无论是否为二聚体形式)，和包含除附着至Fc区的那些以外的其他)32GPI多肽。像这样，本发明涉及包含至少第一种P2GPI多肽的纳米颗粒、脂质体、脂质载体、复合物、混合物、超分子结构、多分子聚集物或基于脂质的药物递送系统。P2GPI多肽可以是二聚体，但不必一定是二聚体。P2GPI多肽可以附着或不附着至另外的治疗剂。此类脂质体将优选是隐蔽的脂质体，并且在脂质体核心中可以包含治疗剂。本发明的再进一步的方面涉及P2GPI多肽(除附着至Fc区的p2GPI多肽以外)的组合物，其中所述^2GPI多肽可操作地附着至至少第一种治疗剂，以及涉及各种使用方法。特别优选的是其中P2GPI多肽可操作地附着至至少第一种细胞因子例如TNFa、IL刁或IFNa的组合物。在某些实施方案中，所述P2GPI多肽将是二聚体，并且二聚的P2GPI多肽将可操作地附着至至少第一种治疗剂，例如细胞因子。特别考虑将任何此类P2GPI细胞因子构建体或缀合物用于治疗疾病，包括病毒感染。因此，本发明进一步提供了治疗癌症的方法和治疗病毒感染的方法，包括向有此需要的动物施用治疗有效量的构建体，所述构建体包含可操作地附着至至少第一种细胞因子优选TNFa、IL-2或IFNa的(HGPI多肽。所述P2GPI多肽可以是二聚的P2GPI多肽。E.另外试剂的缀合物本发明的构建体和受体-抗体还可用于递送附着的治疗剂至特定靶，例如肿瘤和肿瘤内血管系统、肺瘤细胞、受病毒感染的细胞和病毒颗粒。尽管不涉及含有Fc区的构建体，但美国专利6,312,694、6，783，760和6，818，213各自特别引入本文作为参考，以为了获得其关于附着至治疗剂的氨基磷脂结合蛋白的一般教导。因为本发明的构建体和受体-抗体还可在安全且有效的抗病毒疗法中使用，所以这些构建体还可有利地连接至一系列已知的抗病毒剂。在本发明的这些方面，本发明的任何构建体、受体-抗体或P-抗体可以用于制备缀合物。在此类缀合物中使用的试剂优选包括抗细胞剂或细胞毒性剂、细胞因子、趋化因子、V型ATP酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、放射性同位素、凝血剂或抗病毒剂。在抗病毒缀合物中，不需要使用第二种抗病毒剂作为附着的试剂。El.抗细胞剂和细胞毒性剂在某些应用中，治疗剂是细胞毒性剂或药理活性剂，尤其是能杀死细胞(特别是肿瘤内皮细胞、肿瘤细胞或受病毒感染的细胞)或者抑制其生长或分裂的细胞毒性剂、细胞抑制剂、或者抗细胞剂。抗细胞药剂的范例包括化疗剂，以及细胞毒素。可以使用的化疗剂包括激素，诸如类固醇；抗代谢物，诸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、或氨基喋呤；蒽环霉素；丝裂霉素C;长春花生物碱；秋水仙胺；依托泊苷；普卡霉素；抗胂瘤烷化药剂，诸如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。其他实施方案可以包括诸如细胞因子等药剂。基本上可以使用任何抗细胞药剂，条件是它能够以某种方式成功地缀合至构建体从而能够在乾向的细胞(如内皮细胞)位点处向血液成分进行靶向、内在化、释放、和/或呈递。可能会有这样的情况，比如靶抗原没有通过与有毒化合物的有效去毒一致的途径发生内在化，需要靶向化疗剂，诸如抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素、等等。目前多种化疗剂和其他药理活性剂已经成功地缀合，并显示药学功能，包括多柔比星、道诺霉素、氨甲蝶呤、长春花碱、新制癌菌素、大分子霉素、三乙蹄亚胺苯醌、和ot-鹅膏蕈碱。在其他情况中，可以通过使用DNA合成抑制剂来消除来自基于细胞毒素疗法的任何潜在副作用，诸如道诺霉素、多柔比星、阿霉素等等。因此这些药剂是用于本发明某些方面的抗细胞药剂的优选范例。至于抑制细胞的药剂，这些化合物通常扰乱耙细胞的正常细胞周期，优选使得细胞退出细胞周期。已知多种细胞毒性剂可以缀合。范例包括大量有用的植物、真菌、或细菌衍生毒素，例如包括各种A链毒素，特别是蓖麻毒蛋白A链；核糖体灭活蛋白，诸如皂草素或白树毒蛋白；ct-帚曲菌素；曲霉素；局限曲霉菌素；核糖核酸酶，诸如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素；和假单胞菌外毒素等等。在此特别地引入众所周知的由ArthurE.Frankel所编的1992毒素书籍"GeneticallyEngineeredToxins"(包括附录)作为参考以进一步描述或使得能够在目的构建体中使用毒素，所述书籍包括大量毒素的一级氨基酸序列。在毒素中，优选使用白树毒蛋白和蓖麻毒蛋白A链。利用白树毒蛋白作为可与标记结合的免疫缀合物的效应物或毒素部分在美国专利6，051，230(特别引入本文作为参考)以及美国专利6，451，312(它特别涉及与作为靶向剂的VEGF连接的白树毒蛋白)中有描述，其中所述标记是血管化肿瘤的肿瘤内血管中表达的，或易于接近而结合它，吸附或定位在其上。对于篦麻毒素A链来说，更优选的毒素部分常常是经处理而修饰或除去碳水化合物残基的蓖麻毒蛋白A链，即所谓的"脱糖基A链"(dgA)。脱糖基蓖麻毒蛋白A链是优选的，因为它极有效力、半衰期较长，而且进行临床等级和规模的制造在经济上是可行的。从制药学的立场出发，可能希望采用尽可能小的分子而又提供适当的生物学应答。由此可能希望采用提供适当的抗细胞应答的较小A链肽。为了这个目标，已经发现蓖麻毒蛋白A链可以通过Nagarase(Sigama)除去30个N末端氨基酸而"截短"，但仍保留适当的毒素活性。建议需要时可以将这种截短的A链用于本发明的缀合物中。或者，可发现对毒素A链部分应用重组DM技术可以提供本发明的额外好处。实现了有生物学活性的荒麻毒蛋白A链的克隆和表达后，现在有可能鉴定并制备仍展示适当毒素活性的更小的肽或变体肽。此外，蓖麻毒蛋白A链已被克隆的事实使得能够应用定点诱变，由此容易的制备并筛选A链衍生肽，获得可用于本发明的其他有用部分。E2.细胞因子细胞因子和趋化因子是可与本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体连接的药剂的特定实例。可以使用一系列的细胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-ll、IL-13、TGF-(3、M-CSF、G-CSF、TNFP、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、IFN-oc、INF-P。更优选的细月包因子包括IL-1ct、IL-1p、IL-2、IL-6、IL-IO、GM-CSF、IFN-y、单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)和C-反应蛋白(CRP)等等。尤其优选的例子是TNFa、TNFoc诱导物、IL-2、IL-12、IFN-oc、INF-0、IFN-y和LEC。TNFa增加了血管的通透性。此药剂预计可用于附着本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体，尤其是在所产生的缀合物用于治疗癌症的组合疗法中时。所迷构建体将递送附着的TNFoc至肿瘤环境中，且在肿瘤中引起的血管通透性的增强将促进第二种抗癌剂渗透入肿瘤中，因此扩大了全面的抗胂瘤效果。例如，IL-12可与构建体、受体-抗体或p-抗体连接并用于重新指导宿主防御系统，从而攻击肿瘤血管。趋化因子LEC(肝脏表达的趋化因子，也称为NCC-4、HCC-4或LMC)是另一种优选的组分(Giovarelli等人，2000)。LEC对于树突细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞是趋化性的，因此能增强宿主介导的抗肿瘤反应。E3.凝血因子本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体可与能直接或间接刺激凝血的组分连接形成凝血配体。为了进一步描述凝血剂的操作性附着形成凝血配体，将美国专利6，093，399、6,004,555、5，877，289和6，036，955特别引入本文作为参考。本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体可以直接连接凝血剂或凝血因子，或者可以连接可结合而后释放凝血剂或凝血因子的第二种结合区。如本文所用，术语"凝血剂，，和"凝血因子，，都用于指在适当条件下，优选当到达特定体内环境(诸如肿瘤血管系统)时，能够直接或间接刺激凝血的成分。优选的凝血因子是组织因子组合物，诸如截短的TF(tTF)、二聚体、多聚体、和突变TF分子。"截短的TF"(tTF)指通过除去足够多的实现膜结合特性改变的氨基酸序列从而变成膜结合缺陷型的TF构建物。本文中的"足量"指最初足以使TF分子进入膜或介导TF蛋白质的功能性膜结合的跨膜氨基酸序列的量。通过除去"足够量的跨膜序列"产生了截短的组织因子蛋白质或多肽，其结合磷脂膜的能力是缺陷的，使得该蛋白质是不显著结合磷脂膜的基本上可溶的蛋白质。因此，截短的TF在标准TF测定法中基本上不能够将因子Vn转变成因子VIIa，但是仍然保留所谓的催化活性，包括在存在因子VIIa时激活因子X。美国专利5，504，067、6，156，321、6，132，729和6，132，730(特别引入本文作为参考)进一步描述了这些截短的组织因子蛋白质。优选(第220-263位氨基酸)。但是，也不;要将截短的TF分子局限于长度恰好是219个氨基酸的分子。二聚体的组织因子组合物也是有用的。可以以二聚体的形式制备任何截短的、突变的、或其他组织因子构建物以用于本发明。本领域普通技术人员可以理解，通过分子生物学和重组表达的标准技术，在同一读码框中制备两个编码区并由表达载体进行表达，可以制备这些TF二聚体。同样，可以将各种化学缀合技术用于制备TF二聚体。可以在缀合前对各TF单体进行衍生化。本领域技术人员清楚的知道所有这些技术。如果需要，可以经生物学可释放键连接组织因子二聚体或多聚体，诸如可选择性切割的接头或氨基酸序列。例如，可使用包含酶切割位点的肽接头，所述酶优先定位于肿瘤环境或在肿瘤环境内有活性。这些肽接头的例示性形式是供尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如胶原酶、明胶酶、或溶基质素)切割的肽接头。在某些实施方案中，组织因子二聚体还可以包含受阻的疏水性膜插入部分，以便日后促进组织因子与磷脂酶的功能性联合，但是这只发生于某些特定条件下。正如关于截短的组织因子的内容中所述，疏水性膜联合序列通常是由于其疏水本质可驱动与磷脂环境的联合的氨基酸段。同样，脂肪酸可以用于提供潜在的膜插入部分。这些膜插入序列可以位于TF分子的N末端或C末端，或者通常附着于该分子的任何其他位点，只要它们的附着不阻碍TF构建物的功能特性即可。受阻插入部分的意图是在TF构建物定位于肿瘤环境前保持无功能，并使得疏水性附着物能够接近并进一步促进与膜的物理学联合。此外，预计生物学可释放键和可选择性切割序列在这方面特别有用，其中所述键或序列只在定位于肿瘤环境内并暴露于特定酶或其他生物活性分子时才受到切割或修饰。在其他实施方案中，tTF构建物可以是多聚体。在此内容中，"多聚体构建物"包含3个或更多组织因子构建物。"多聚体TF构建物"指包含第一TF分子或衍生物可操作附着至少第二和第三TF分子或衍生物的构建物。多聚体可以包含大约3个-大约20个TF分子。多聚体中的各TF单元也可以通过可选择性切割的肽接头或其他生物学可释放键相连。此外，正如上文就TF二聚体所述，可以使用重组操作和表达或使用标准合成化学来生成构建物。可用于本发明的其他TF构建物是激活因子VII的能力缺陷的突变体。本文通常将这些"因子VII激活突变体"定义为可结合功能性因子VlI/VIIa，通过蛋白水解激活因子X，但是基本上不能通过蛋白水解激活因子VII的TF突变体。因此，这些构建物是缺乏因子VII激活活性的TF突变体。这些因子VII激活突变体促进肿瘤特异性凝血的能力基于的是它们对肿瘤血管系统的特异性递送和血浆中低水平存在的因子VIIa。在施用了这些因子VII激活突变体缀合物后，突变体将定位于血管化肿瘤的血管系统内。在定位前，由于TF突变体不能将因子VII转变成因子VIIa，因此它通常不能够在任何其他身体部位启动凝血。但是，在定位于胂瘤区并积累后，突变体将遭遇来自血浆的足够因子VIIa，从而起始外在凝血途径，导致肿瘤特异性血栓症。也可以对患者施用外源因子VIIa。可以制备多种组织因子VII激活突变体中的一种或多种，并用于本发明。现在有了关于TF上因子VII/VIIa识别位点的充足科技知识。由此可以理解，因子Vn活化区通常位于TF分子的大约第157位-大约第167位氨基酸之间。但是，预计该区域外的残基也可能与因子VII激活活性有关，由此可考虑在TF序列大约第106位-大约第"9位氨基酸之间的任何一个或多个残基处导入突变(WO94/07515;WO94/28017;引入本文作为参考)。如美国专利6，093，399、6,004,555、5，877，289和6,036，955中所述的，多种其他凝血因子可以用于本发明，例示性药剂见下文。凝血酶、因子V/Va及其衍生物、因子VIII/Vnia及其衍生物、因子IX/IXa及其衍生物、因子X/Xa及其衍生物、因子XI/XIa及其衍生物、因子XlI/XIIa及其衍生物、因子Xin/XIIIa及其衍生物、因子X激活剂、和因子V激活剂可用于本发明。Russell煃蛇毒因子X激活剂预计可用于本发明。已生成了对Russell煃蛇毒液中存在的因子X激活剂具有特异性的单克隆抗体，并可作为双特异性结合性配体的一部分用于特异性递送药剂。血栓烷A是由内过氧化物通过血小板微粒体中的环加氧酶和血栓烷合成酶的依次反应形成的。血栓烷A2是由血小板产生的，而且由于其能够引起血小板聚集，它还是有效的血管收缩剂。血栓烷A2及其活性类似物预计可用于本发明。血松烷合酶和合成激活血小板的前列腺素的其他酶也可在本文中作为"凝血剂"使用。针对血栓烷合酶的单克隆抗体和血栓烷合酶的免疫亲和纯化是已知的，人血栓烷合酶的cDNA也是已知的。oc2-抗纤溶酶或oc2-纤溶酶抑制剂是人血浆中天然存在的蛋白酶抑制剂，能够有效抑制由纤溶酶原激活剂诱导的纤维蛋白凝块的裂解。ct广抗纤溶酶是特别有效的抑制剂，预计可用于本发明。由于可以获得ot2-抗纤溶酶的cDNA序列，因此优选重组表达和/或融合蛋白质。还可以获得针对ot2-抗纤溶酶的单克隆抗体，可用于本发明的双特异性结合性配体实施方案。这些抗体可用于将外源oc广抗纤溶酶递送至靶位点或储存内源otf抗纤溶酶，并使其集中在乾区内。E4.抗^:管蛋白药物一系列药物可经干扰微管蛋白活性来展现其效果。由于微管蛋白的功能是有丝分裂和细胞生存所必需的，所以某些"抗微管蛋白药物"是强有力的化疗剂。如本文中所使用的，"抗微管蛋白药物"指任何这样的药剂、药物、药物前体或其组合，其抑制细胞有丝分裂，优选地通过直接或间接抑制细胞有丝分裂所需的微管蛋白活性，优选微管蛋白聚合化或去聚合化。目前了解得更清楚也更优选用于本发明的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱；紫杉烷类，诸如红豆杉醇；长春花生物碱，诸如长春花碱、长春花新碱、和长春碱酰胺；和考布他汀。其他合适的抗微管蛋白药物是细胞松弛素(包括B、J、E)、多拉司他汀、auristatinPE、紫杉醇、ustiloxinD、根霉素、1069C85、秋水仙胺、阿苯达唑、阿扎毒素和诺考达唑。如美国专利5，892，069、5，504，074和5，661，143(本文特别引入作为参考)中所述，考布他汀是通常抑制细胞有丝分裂的雌二醇衍生物。可用于本发明的例示性考布他汀包括基于考布他汀A、B、和/或D的那些和美国专利5，892，069、5，504，074、和5，661，143中所述的那些。考布他汀A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-l、B-2、B-3和B-4是上述类型的范例。美国专利5，569，786和5，409，953(引入本文作为参考)描述了考布他汀A-1、A-2、A-3、B-l、B-2、B-3和B-4的分离、结构表征、和合成，以及使用这些考布他汀来治疗肿瘤生长的制剂和方法。这些考布他汀中的一种或多种都可用于本发明。如美国专利5，892，069、5,504,074、5，661，143和4，996，237(本特别引入文作为参考)中所述，考布他汀A-4也可用于本文。美国专利5,561,122(引入本文作为参考)进一步描述了合适的考布他汀A-4前药，预计可与本发明联合使用。美国专利4，940，726(特别引入本文作为参考)特别描述了命名为考布他汀D-1和考布他D-2的大环内酯，可与本发明的组合物和方法联合使用。美国专利5，430，062(特别引入本文作为参考)涉及具有抗癌活性、可与本发明联合使用的芪衍生物和考布他汀类似物。E5.抗血管发生剂抗血管发生剂可用于附着至本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体。许多抗癌剂作用机制的一部分是具有抗血管发生效用。针对联合疗法所述的任何一种或多种这样的药剂，包括表E中的药剂，都还可以按本文所述与本发明的构建体、受体-抗体或卩-抗体缀合。已发现、设计或选择了某些其他药剂，它们的主要作用机制是具有抗血管发生效用。所说药剂的实例描述如下，其中的任一种都还可以用于制备缀合物或分别用于本发明的联合疗法中。现在已知大量的酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗在多种疾病状态中出现的血管发生，包括例如美国专利5，639，757(特别引入本文作为参考)描述的4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，它也可以与本发明联合使用。能够调节经VEGFR2受体的酪氨酸激酶信号转导的有机分子的其他范例是美国专利5，792,771的查唑啉化合物和组合物，这项专利在此特别引入，以便描述可以与本发明联合用于治疗血管发生性疾病的其他组合。其他化学类化合物也已经显示可抑制血管发生，而且可用于与本发明的联合。例如，联合疗法中可以采用类固醇，诸如美国专利5,972，922(特别引入本文作为参考)中描述的抑血管的4，9(11)-类固醇和C21-氧合类固醇。美国专利5，712,291和5，593，990(特别引入本文作为参考)描迷了沙利度胺及相关化合物、前体、类似物、代谢物和水解产物，它们也可以与本发明联合用于抑制血管发生。美国专利5,丌2,291和5，"3，990中的化合物可以口服施用。表B列出了可用于联合疗法的其他例示性抗血管发生剂，其中列出的每一种药剂都只是例示而绝非限制。表B.血管发生的抑制剂和负调控剂<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>韩国槲寄生提取物(〃sc"迈a/6"迈co/o_rafw迈)Yoon等人，1995视黄醇(醛、酸)类0ikawa等人，1989;Ungen等人，1996;Majewski等人，1996CM101Hellerqvist等人，1993;Quinn等人，1995;Wamil等人，1997;DeVore等人，1997地塞米松Hori等人，1996;Wolff等人，1997白血病抑制因子(LIF)Pepper等人，1995某些优选用于抑制血管发生的成分是血管生长抑素、抑内皮素、抑血管素(vasculostatin)、制霉菌素(canstatin)和乳腺丝抑蛋白。美国专利5，776，704、5,639,725、和5，733，876(引入本文作为参考)描述了被称为"血管生长抑素，，的蛋白质。血管生长抑素是分子量在大约38kDa-大约45kDa之间(通过还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)的蛋白质，大致包含纤溶酶原分子的第1-4个Kringle区。血管生长抑素的氨基酸序列通常与完整鼠纤溶酶原分子自第98位氨基酸开始的片段基本上相似。血管生长抑素的氨基酸序列在物种间略有变化。例如，在人的血管生长抑素中，氨基酸序列与上述鼠纤溶酶原片段的序列基本上相似，但是有活性的人血管生长抑素序列可以自完整人纤溶酶原氨基酸序列的第97位或第99位氨基酸开始。而且，人纤溶酶原在小鼠肿瘤模型中具有相似的抗血管发生活性，因而可以使用。某些抗血管发生治疗剂已显示出造成肿瘤的消退，而血管生长抑素就是这样的一种药剂。抑内皮素、胶原蛋白XVIII的20kDaCOOH-末端片段、细菌多糖CM101和抗体LM609也具有抑制血管生长的活性。另一方面，根据它们的其他特性，它们被称为抗血管治疗剂或肿瘤血管毒素，因为它们不仅抑制血管发生，还通过几乎尚未明确的机制起始对肿瘤血管的破坏。由于血管生长抑素和抑内皮素是最早在小鼠中证明不仅能够抑制肿瘤生长而且能够引起肿瘤退化的血管发生抑制剂，因此它们已经成为深入研究的焦点。已经显示多种蛋白酶可由纤溶酶原产生血管生长抑素，包括弹性蛋白酶、巨噬细胞金属弹性蛋白酶(醒E)、基质溶素(MMP-7)、和92kDa的明胶酶B/IV类胶原酶(MMP-9)。匪E能够在肿瘤中由纤溶酶原产生血管生长抑素，而粒细胞-巨嗟细胞集落刺激因子(GMCSF)通过上调巨噬细胞的匪E表达而诱导血管生长抑素生成。醒E在血管生长抑素生成中的作用得到固E确实在来自患者的肝细胞癌临床样品中表达这一发现的支持。认为能够产生血管生长抑素的另一种蛋白酶是溶基质素-1(MMP-3)。MMP-3显示在体外可由纤溶酶原产生血管生长抑素样片段。血管生长抑素的作用机制目前还不清楚，猜测它结合内皮细胞上尚未鉴定的细胞表面受体，诱导内皮细胞经历程序化细胞死亡或有丝分裂阻滞。抑内皮素似乎是甚至更强有力的抗血管发生和抗肿瘤药剂，尽管它的生物学特性尚不是很清楚。抑内皮素在大量的小鼠肿瘤模型中能够有效引起退化。肿瘤没有形成针对抑内皮素的抗性，而且胂瘤在多个治疗周期后进入体积不再增加的休眠阶段。在此休眠阶段，经历凋亡的胂瘤细胞百分比上升，产生基本上保持相同大小的群体。抑内皮素被认为与介导其作用的尚未鉴定的内皮细胞表面受体结合。授予Folkman和O'Rei1ly的美国专利5，854,205(特别引入本文作为参考)涉及抑内皮素及其作为内皮细胞增殖和血管发生抑制剂的应用。抑内皮素蛋白质对应于XVIII型胶原的C末端片段，而且可以由多种来源分离该白质。美国专利5，854，205还教导抑内皮素具有XVIII型胶原、XV型胶原、或BOVMPE1pregastric酯酶片段的氨基酸序列。美国专利5，854，205还描述了抑内皮素与其他抗血管发生蛋白质(特别是血管生长抑素)的联合，这些联合的组合物能够有效的使依赖血管发生的肿瘤块消退。CM101是已经详细鉴定为能够在肿瘤中诱导新血管炎症的细菌多糖。CM101结合并交联去分化内皮上表达的受体，刺激补体系统的激活。它还启动由细胞因子驱动的、选择性靶向肿瘤的炎症应答。它是下调VEGF及其受体的表达的唯一抗病理性血管发生药剂。CM101目前作为抗癌剂正在进行临床试验，而且可用于与本文的联合。血小板反应蛋白(TSP-1)和血小板因子4(PF4)也可用于与本发明中。它们都是与肝素有关的血管发生抑制剂，是在血小板Ct颗粒中发现的。TSP-1是细胞外基质成分，一种450kDa的大型多结构域糖蛋白。TSP-1结合在细胞外基质中发现的许多蛋白聚糖分子，包括HSPG、纤连蛋白、层粘连蛋白、和不同类型的胶原。TSP-1抑制体外内皮细胞迁移和增殖以及体内血管发生。TSP-1还抑制经转化的内皮细胞的恶性表型和肿瘤发生。肿瘤抑制基因p53显示直接调控TSP-l的表达，p53活性的丧失将引起TSP-1生成显著降低，伴随着由肿瘤起始的血管发生增加。PF4是含70个氨基酸的蛋白质，它是CXCELR趋化因子家族的成员，能够在体外有效抑制内皮细胞增殖，在体内有效抑制血管发生。肿瘤内施用或通过腺病毒载体递送的PF4能够引起对肺瘤生长的抑制。干扰素和金属蛋白酶抑制剂是能够按照本发明被递送的另外两类天然存在的血管发生抑制剂。20世纪80年代早期就已经知道干扰素的抗内皮活性，但是抑制机制仍然不清楚。已知它们能够抑制内皮细胞迁移，而且它们在体内确实具有一些抗血管发生活性，这可能是由抑制肿瘤细胞产生血管发生促进剂的能力介导的。特别是血管肿瘤对干扰素较敏感，例如用IFNot可以成功的治疗增殖的血管瘤。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是天然存在的基质金属蛋白酶(画P)抑制剂家族，它们也能够抑制血管发生，可用于本发明的治疗方案中。固P在血管发生过程中具有重要作用，因为它们降解内皮细胞和成纤维细胞在延伸或改造血管网络时迁移经过的基质。事实上，MMP的一个成员MMP-2显示与推测为此目的经整联蛋白otvP3激活的内皮有关。若这种相互作用被醒P-2片段破坏，则血管发生下调，肿瘤生长受抑制。存在大量抑制血管发生的药理学活性剂，其中任何一种或多种都可用作本发明的一部分。这包括AGM-1470/TNP-470、沙利度胺和羧基酰胺三唑(CAI)。1990年发现烟曲霉素是血管发生的有效抑制剂，从此开发了烟曲霉素的合成类似物AGM-1470和TNP-470。这两种药物可抑制体外内皮细胞增殖和体内血管发生。在人临床试验中对TNPM70进行了广泛研究，结果表明进行长期给药是最佳的。沙利度胺最初作为镇静剂使用，但是发现是很强的致畸剂，因而停用。1994年发现沙利度胺是血管发生抑制剂。沙利度胺目前作为抗癌剂和血管性眼疾病的治疗正在进行临床试验。CAI是小分子量的血管发生合成抑制剂，作为钓通道阻断剂防止肌动蛋白再组.织、内皮细胞迁移、和在胶原IV上的展开而起作用。CAI在生理学可达到浓度抑制新血管形成，而且癌症患者口服后耐受较好。CAI的临床试验在49。/。的治疗前患有进行性疾病的癌症患者中稳定了疾病。在存在肝素或肝素片段时，可的松在小鼠中显示通过阻断内皮细胞增殖来抑制肿瘤生长。类固醇和肝素的加成性抑制效果所涉及的机制尚不清楚，但是认为肝素可能增加内皮细胞对类固醇的摄取。该混和物显示可增加新形成的毛细血管下基底膜的解体，这也是加成性血管抑制性效果的一种可能解释。肝素-可的松缀合物在体内还具有有效的血管抑制性和抗肿瘤效果活性。预计其他特异性血管发生抑制剂也可利用本发明的肿瘤靶向方法递送至肿瘤。这些包括(但不限于)抗侵入因子、视黄酸和紫杉醇(美国专利5，716，981，引入本文作为参考)、AGM-1470(Ingber等人，1990;引入本文作为参考)、鲨鱼软骨提取物(美国专利5，618，925，引入本文作为参考)、阴离子聚酰胺或聚脲寡聚物(美国专利5，593，664，引入本文作为参考)、羟吲哚衍生物(美国专利5，"6，330，引入本文作为参考)、雌二醇衍生物(美国专利5，504，074，引入本文作为参考)和噻唑并嘧啶衍生物(美国专利5，599，813,引入本文作为参考)。包含ouP3整联蛋白拮抗剂的组合物也可以与本发明联合用于抑制血管发生。正如美国专利5，766，591(引入本文作为参考)所公开的，含RGD的多肽及其盐，包括环状多肽，是otvP3整联蛋白拮抗剂的合适范例。因为血管生成素是Tie2的配体，所以基于改变通过Tie2受体的信号传导的其他治疗性干预方法也可在本文中联合使用。例如，可以应用能阻断Tie2受体活化的可溶性Tie2受体(Lin等人，1998a)。用重组腺病毒基因疗法递送这样的构建体已显示对于治疗癌症和减少转移是有效的(Lin等人，1998a)。血管生成素，与VEGF家族成员一样，是血管内皮的特异性生长因子(Davis和Yancopoulos，1999;Holash等人，1999;引入本文作为参考)。首先被描述的血管生成素是天然存在的受体激活剂或激动剂--血管生成素-l(Ang-l)，和天然存在的受体拮抗剂--血管生成素-2(Ang-2)，二者都是通过内皮细胞酪氨酸激酶受体Tie2来发挥作用的。两种新的血管生成素--血管生成素-3(小鼠)和血管生成素-4(人)也已经得到鉴定(Valenzuela等人，1999)。血管生成素-3似乎作为拮抗剂(像Ang-2)发挥作用，而血管生成素-4似乎作为激动剂(像Ang-l)发挥作用(Valenzuela等人，1999)。还由人的心脏克隆了称为血管生成素-3的蛋白质，而且据报导对内皮细胞没有促有丝分裂的效果(Kim等人，1999)。VEGF是血管发育早期所必需的，而血管生成素-l是血管化晚期通常需要的。由此，VEGF促进内皮细胞分化、增殖、和原始血管形成。血管生成素-l经Tie2受体促进成熟血管的维持和稳定。因此，血管生成素-l是成熟或稳定因子，认为它通过促进内皮细胞与周围支持细胞之间的相互作用而将未成熟血管转变成未成熟血管(Holash等人，1999)。E6.诱导凋亡的药剂本发明还可用于递送在任何细胞(包括肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞和受病毒感染的细胞)中诱导凋亡的药剂。许多抗癌药剂可能具有诱导凋亡的效果，这是其作用机制的一部分。按本文所述，针对联合疗法所述的任何一种或多种这样的药剂，包括表F中的那些药剂，也可与本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体缀合。已发现、设计或选择出了具有诱导凋亡的作用作为主要机制的某些其他药剂。这些药剂的例子描述如下，其中任何一种都可以用于制备缀合物或分别用于与本发明联合的治疗方法中。据报导，许多形式的癌症在肿瘤抑制基因中包含突变，诸如p53。p53的灭活导致不能促进凋亡。由于这一失败，癌细胞进行肿瘤发生，而非注定的细胞死亡。本发明因此还涵盖通过递送肿瘤抑制基因来刺激细胞死亡。例示性的肿瘤抑制基因包括(但不限于)p53、成视网膜细胞瘤基因(Rb)、Wilm氏肿瘤(WT1)、baxoc、白介素-ip-转换酶及其家族、MEN-1基因、l型神经纤维瘤(NF1)、cdk抑制剂p16、结肠直肠癌基因(DCC)、家族性多发性腺癌基因(FAP)、多瘤抑制基因(MTS-1)、BRCA1和BRCA2。优选使用的是p53(美国专利5，747，469、5，677，178和5，756，455，引入本文作为参考)、成视网膜细胞瘤、BRCA1(美国专利5，750，400、5,654,155、5,710,001、5,756,294、5,709,999、5,693，473、5,753,441、5，622，829和5，747，282,引入本文作为参考)、MEN-1(GenBank编号U93236)和腺病毒E1A(美国专利5，776，743，引入本文作为参考)基因。抑制凋亡或程序性细胞死亡的其他癌基因包括，但不局限于，bcr-abl、bcl-2(不同于bcl-l，细胞周期蛋白D1;GenBank登记号M14745、X06487;美国专利号5，650，491;和5，539，094;分别引入本文作为参考)和包括Bcl-xl、Mcl-l、Bak、Al、AW在内的家族成员。Bcl-2的过表达首先在T细胞淋巴瘤中发现。Bcl^通过与凋亡途径中的一种蛋白质Bax结合并使其失活而发挥癌基因的功能。Bcl-2功能的抑制防止了Bax的失活，并使得凋亡途径能继续进行。因此，对此类癌基因的抑制，如利用反义核苷酸序列进行抑制，预计可用于本发明期望增强凋亡的有关方面(美国专利5，650，491;5，539，094;和5，583，034;分别引入本文作为参考)。可以由本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体递送的其他组合物包括肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(称为TRAIL)的编码基因及TRAIL多肽(美国专利5,763，223，引入本文作为参考)；24kD凋亡相关蛋白酶(美国专利5，605,826，引入本文作为参考)；Fas相关因子l(FAF1)(美国专利5，750，653，引入本文作为参考)。本发明的这些方面还包括提供白介素-lP-转换酶及其家族成员，据报导，它们也刺激凋亡。还可以使用诸如2-羟基喹衍生物(美国专利5，672，603和5,464,833，引入本文作为参考)、branchedapogenicpeptide(美国专利5,591，717，引入本文作为参考)、磷酸酪氨酸抑制剂及不可水解的磷酸酪氨酸类似物(美国专利5,565，491和5，693，627，引入本文作为参考)、RXR类视色素受体激动剂(美国专利5，399，586，引入本文作为参考)和甚至抗氧化剂(美国专利5，571，523，引入本文作为参考)等化合物。还可以将酪氨酸激酶抑制剂(诸如金雀异黄素)连接至本发明的抗体(正如美国专利5，587，459所支持的，引入本文作为参考)。E7.抗病毒剂因为PS和阴离子磷脂在受病毒感染的细胞上变得暴露，所以本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体也可连接任何一种或多种抗病毒剂。用于连接至构建体、受体-抗体或P-抗体的示例性抗病毒剂包括表G中的那些。这样的抗病毒剂还可分开地用于本发明的联合抗病毒疗法中。除了所谓的典型抗病毒剂外，也可以附着其他DNA/RNA抑制剂以形成抗病毒治疗剂。示例性的抗病毒剂列在表G中，可以附着它们中的任何一种或多种以制备本发明的抗病毒缀合物，或者可以将它们分开地用于本发明的抗病毒联合疗法中。表G<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>在抗病毒剂和药物的范围内，目前优选AZT和西多福韦。无论所选择的抗病毒药物是什么，抗病毒缀合物都将与肺中的巨噬细胞结合，与受病毒感染的细胞结合，并且还可能结合病毒颗粒。取决于所用的接头或缀合技术，抗病毒药物可以在靶细胞表面释放，然后被摄取入细胞中。优选地，缀合物本身被摄取入细胞，例如巨噬细胞或受病毒感染的细胞。摄取可以是自然发生的或可以是病毒介导的。一旦进入细胞内，如同用抗体缀合物一样，接头的水解将会释放出活性抗病毒剂。可以使用含生物学不稳定键的其他连接，诸如二硫键、酸不稳定键、酶促可裂解键或可水解键。因此，被描述用于连接治疗剂的任何生物学可释放或可选择性水解的键都可以与本发明的抗病毒药物相关地使用。F.生物学功能等同物现在可以生成构建体、受体-抗体或p-抗体的等同物或甚至改良物，通常是使用上文提供的材料作为起点。可以对这种构建体、受体-抗体或P-抗体的结构进行修饰和改变，但是仍然能够获得具有类似或所需特征的分子。例如，可以用某些氨基酸替代蛋白质结构中的其他氨基酸，而在相互作用性结合能力方面没有明显损失。这些考虑也可应用于毒素、抗血管发生剂、凋亡诱导剂、凝血剂、等等。由于蛋白质相互作用能力和本质确定了该蛋白质的生物学功能活氨基酸序;'j替代，从而得到:^类二(激动剂、;特性的蛋白质:因此，预计可在以抗体或治疗剂的序列(或相应的DNA序列)中进行多种改变，而不会使其生物学效用或活性明显损失。可以根据本文表A提供的密码子信息和关于定点诱变的支持性技术细节，通过突变相应的DNA序列而产生生物学功能等同物。表A絲酸密码子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU组氨酸HisHCACCAU异亮氨酸HeIAUAAUCAUU赖氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuUUAUUGCUACUCCUGCUD甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AshNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGecu谷氨酰胺GinQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU丝氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU苏氨酸ThrTACAACCACGACU缬氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU本领域技术人员也深入领会到，"生物学功能等同的"蛋白质或肽这一定义的内在含义是，在分子的确定部分内可以进行的、仍然导致分子具有可接受水平的等同生物活性的改变数目存在限制。因此，本文将生物学功能等同的蛋白质和肽定义为某些而非大多数或所有氨基酸可被替代的蛋白质和肽。当然，根据本发明可以容易的制备和使用具有不同替代的多种不同的蛋白质/肽。氨基酸替代通常基于的是氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。对氨基酸侧链取代基大小、形状、和类型的分析揭示了精氨酸、赖氨酸、和组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸、和丝氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸都具有基本上相似的形状。因此，根据这些考虑，本文将精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸、和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸确定为生物学功能等同物。在进行更多的量变时，可以考虑氨基酸的水性指数(hydropathicindex)。根据其疏水性和带电特性确定了各种氨基酸的水性指数，即异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-O.4);苏氨酸(-O.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。本领域技术人员通常都理解氨基酸水性指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，引入本文作为参考)。已知某些氨基酸可以被具有相似水性指数或评分的其他氨基酸替代，而仍保留相似的生物学活性。在根据水性指数进行改变时，优选水性指数为土2之间的氨基酸替代，特别优选水性指数为土l之间的氨基酸替代，甚至更特别优选水性指数为土O.5之间的氨基酸替代。因此，可以理解，氨基酸可以用具有相似亲水性值的另一种氨基酸取代，而仍得到生物学等同的蛋白质。如美国专利4，554，101(引入本文作为参考)中所述，已经为氨基酸残基指定了下列亲水性值精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0土1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-O.4);脯氨酸(-0.5士1);丙氨酸(-O.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);曱硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在根据亲水性值进行改变时，优选亲水性值为±2之间的氨基酸替代，特别优选亲水性值为土l之间的氨基酸替代，甚至更特别优选亲水性值为士O.5之间的氨基酸替代。G.缀合作用将抗体Fc区与至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白可操作地附着、联接或缀合，从而提供本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体。这样的构建体、受体-抗体或|3-抗体可以进一步缀合或联接至例如抗细胞和细胞毒性剂、凝血剂和抗病毒剂。尽管优选共价连接，其他的可操作附着方式也可以使用。例如，可以用抗生物素蛋白生物素桥产生任何连接的构建体。为了更进一步地描述并使抗生物素蛋白生物素能用于靶向剂与生物学试剂和治疗剂的可操作性连接中，除了本领域普通技术人员已知的知识外，还将共同拥有的美国专利6，093，399特别引入本文作为参考。任何两种或三种药剂可用笫二种结合区，优选其抗体或抗原结合区连接。这可以通过凝血配体作为实例说明，其中的靶向剂与凝血剂通过第二种结合区连接(美国专利6，093，399、6,004,555、5，877，289和6，036，955，分别引入本文作为参考)，它已制备并成功用于癌症治疗中。本领域普遍知晓免疫缀合物技术。但是，通过在其制备和纯化以供随后临床施用的过程中使用某些优选的技术可获得某些好处。另夕卜，尽管已知多种类型的含二硫键的接头可以成功用于缀合，但是基于不同的药理学特征和能力，某些接头通常优于其他接头。例如，含有空间上"受阻"的二硫键的接头可能是优选的，因为这种接头在体内更加稳定，从而防止在结合至作用位点之前被释放。交联剂的类型，以及如何进行交联将会改变所得缀合物的药效学。可能会希望获得这样的缀合物，它在除了预定作用位点以外的所有其他身体部位中的条件下都能够保持完整，而在所述预定作用位点处具有良好的"释放"特性。因此，具体交联方案，特别包括所用的具体交联剂和被交联的结构，具有一定的意义。取决于所缀合的具体药剂，可能会需要或希望提供可操作地附着所述药剂的肽间隔区。某些肽间隔区能折叠成以二硫键键合的环结构。然后，环内的蛋白水解切割会产生异二聚体多肽，其中所述药剂仅通过单个二硫键连接。这种毒素的范例是蓖麻毒蛋白A链毒素。当利用其他一些毒素化合物时，可以提供不能被切割的肽间隔区，以可操作地附着融合蛋白质中的毒素化合物。可以与不能被切割的肽间隔区结合使用的毒素是自身可通过蛋白水解切割而转变成毒害细胞的二硫键键合形式的毒素。这种毒素化合物的范例是假单胞菌外毒素化合物。目前多种化疗剂和其他药理活性剂已经成功地进行了缀合，并显示药学功能。已经研究过的例示性抗肿瘤药剂包括多柔比星、道诺霉素、氨甲蝶呤、长春碱、和其他多种药剂。此外，已经描述了诸如新制癌菌素、大分子霉素、三乙烯亚胺苯醌、和oc-鵝膏蕈碱等其他药剂的附着。可对这些附着方法作些改动以用于本发明中。任何共价连接都应当理想地在不同于功能性位点的位点处进行。组合物由此以任何可操作方式"连接"，使得每个部分都能够发挥预定功能而无显著削弱，具体而言，就是使产生的构建体仍然结合预定PS,并使附着的药剂在从构建体中释放时基本上保持生物学活性并/或恢复生物学活性。还考虑了通过在Fc区上的糖部分来附着生物学试剂。在抗体中天然地发生(0联和N联)糖基化。如果需要，可以修饰重组抗体以重新形成或形成另外的糖基化位点，这可以简单地通过将合适的氨基酸序列(例如Asn-X-Ser、Asn-X-Thr、Ser或Thr)改造入抗体的一级序列中来实现。Gl.生化交联剂除了本文提供的一般信息，可以使用某些优选的生化交联剂。交联剂用于形成将两种不同分子的官能团维系在一起的分子桥接。为了以分步方式连接两种不同的蛋白质，可以使用杂双功能交联剂来消除不需要的均多聚体形成。例示性的杂双功能交联剂可以参考表C。表C.杂双功能交联剂<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>杂双功能交联剂包含两个反应基团一个通常与伯胺基团发生反应(如N-幾基琥珀酰亚胺)，而另一个通常与硫醇基发生反应(如吡啶二硫化物(pyridyldisulfide)、马来酰亚胺、卤素、等等)。交联剂通过伯胺反应基团与一种蛋白质的赖氨酸残基发生反应，而通过硫醇反应基团，已经与第一种蛋白质连接的交联剂与另一种蛋白质的半胱氨酸残基(游离的巯基)发生反应。由此，组合物通常具有或经衍生具有可用于交联目的的官能基。这一要求不应视作限制性的，因为多种基团可用于这种方式。例如，伯胺或仲胺基、酰肼或肼、羧基醇、磷酸酯、氨基曱酸酯或烷化基团可用于结合或交联。交联剂的两种反应基团之间的间隔臂可以具有不同的长度和化学组成。较长的间隔臂能够使缀合物成分获得较好的柔性，而桥接中的有些特定成分(如苯基)可以给反应基团带来额外的稳定性或使化学连接对各方面作用的抗性增加(如二疏键对还原剂的抗性)。还包括使用诸如L-Leu-L-A1a-L-Leu-L-A1a等肽间隔物。优选采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知大量类型的含二硫键接头能够成功的用于缀合中。可以证明含空间受阻的二硫键的接头能够带来较好的体内稳定性，防止药剂在结合作用位点前释放。这些接头因而成为一组优选的连接剂。最优选的交联剂之一是SMPT,这是一种含二硫键的双功能交联剂，二碌u键因邻近的苯环和甲基而"空间受阻"。认为该二硫键的空间位阻有助于保护该键免受硫醇阴离子(诸如组织和血液中可能存在的谷胱甘肽)的攻击，由此有助于防止在缀合物将附着的药剂递送至肿瘤位点前发生脱偶联。预计SMPT剂也可用于本发明的缀合物方面。与许多其他已知的交联剂一样，SMPT交联剂提供了交联官能基(诸如半胱氨酸的SH或伯胺如赖氨酸的s-氨基)的能力。另一种可能类型的交联剂包括含可切割二硫键的杂双功能光反应性叠氮基苯，诸如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨基酰氨)-l，3'-二疏代丙酸乙酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基团与伯胺基团发生反应，而叠氮基苯(在光分解作用后)无选择性的与任何氨基酸残基发生反应。除了受阻的交联剂，本文还可以采用不受阻的接头。认为不含或不产生受保护二硫键的其他有用交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫杂环戊环(2-iminothiolane)。本领域完全理解这些交联剂的应用。一旦完成缀合，将缀合物与未缀合的试剂以及与其他污染物分开。有大量的纯化技术可用于提供足够纯的缀合物，从而能够用于临床。使用最多的通常是基于大小分离的纯化方法，诸如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相层析。也可以使用其他层析技术，诸如Blue-Sepharose分离。G2.生物学可释放接头虽然任何连接部分优选具有合理的血液稳定性以防止在靶向到疾病(如肿瘤位点)前显著释放附着的治疗剂，但是在某些方面，也可以使用生物学可释放键和/或可选择性切割间隔物或接头。"生物学可释放键"和"可选择性切割的间隔物或接头"仍然具有合理的循环稳定性。本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体由此可以经生物学可释放键连接一种或多种治疗剂或另一种药剂。"生物学可释放键"或"可选择性水解键"包括只有或优先在某些条件下可释放的、可切割的、或可水解的所有连键。这包括二硫键和三硫键和酸不稳定键，正如美国专利5，474，765和5，762，918(引入本文作为参考)所述。特别涵盖使用对酸敏感的间隔物将治疗剂附着于本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体上。在这些实施方案中，治疗剂在细胞的酸性区室内释放。预计使酸敏感性释放发生于细胞外，但是是在特异性靶向(优选)肿瘤位点或病毒感染性细胞之后。目前优选的某些范例包括经酸敏感间隔物连接了秋水仙碱或多柔比星的抗体。还涵盖经抗体的碳水化合物部分进行附着。在这些实施方案中，治疗剂在细胞的酸性区室内释放。构建体、受体-抗体或P-抗体还可以经衍生而导入能够经生物学可释放键附着治疗剂的官能基。构建体、受体-抗体或P-抗体由此可以经衍生而导入以酰肼、肼、伯胺、或仲胺基终止的側链。治疗剂可以经Schiff碱连接、腙或酰腙键、或酰肼接头而进行缀合(美国专利5，474，765和5，762,918，特别引入本文作为参考)。同样如美国专利5，474，765和5，762，918(特别引入本文作为参考)所述，构建体、受体-抗体或P-抗体可以经一种或多种对酶敏感的生物学可释放键可操作地附着治疗剂，包括肽键、酯键、酰胺键、磷酸二酯键和糖苷键。本发明的某些方面涉及包含肽酶和/或蛋白酶的至少第一种切割位点的肽接头的使用，而所述肽酶和/或蛋白酶优先定位于疾病位点，特别是肿瘤环境内。由所附着的治疗剂的递送导致疾病位点或肿瘤环境内的特异性切割，继而导致活性治疗剂的特异性释放。某些肽接头包含由改造中涉及的一种或多种酶可识别的切割位点。特别优选包含尿激酶、尿激酶原、纤溶酶、纤溶酶原、TGF0、链激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)的切割位点的肽接头。本文特别引入美国专利6,004,555、美国专利5，877，289和美国专利6，093，399作为参考，以进一步描述和教导如何产生并使用包含生物学可释放键和可选择性切割接头和肽的免疫缀合物。本文特别引入美国专利5，877，289作为参考，以进一步描述和教导如何产生并使用包舍可在肿瘤环境内尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金属蛋白酶(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)切割的可选择性切割肽接头的免疫缀合物。目前优选的可选择性切割肽接头是包含纤溶酶或金属蛋白酶(也称为"基质金属蛋白酶"或"MMP")(诸如间质胶原酶、明胶酶、或溶基质素)的切割位点的肽接头。可有利地用于本发明的其他肽接头包括，例如，纤溶酶可切割序列，诸如用尿激酶原、TGFp、纤溶酶原和链激酶可切割的序列；因子Xa可切割序列；MMP可切割序列，诸如明胶酶A可切割序列；胶原酶可切割序列，诸如小牛皮肤胶原(cc1(I)链)、小牛皮肤胶原(a2(I)链)、牛软骨胶原(al(II)链)、人肝胶原(al(in)链)、人a2M、人PZP、大鼠alM、大鼠a2M、大鼠alI3(2J)、大鼠otlI3(27J)、人成纤维细胞胶原酶自溶切割位点。为了更进一步进行描述并教导这些可切割序列的使用，除了本领域普通技术人员已知的知识外，还将共同拥有的美国专利6，342，219、6，524，583、6，342，221和6，416，758的内容和其中的表2所列序列特别引入本文作为参考。G3.融合蛋白和重组表达可将构建体、受体-抗体或P-抗体通过使用分子生物学技术制备成融合蛋白。使用本文公开的和本领域技术人员知道的任何构建体、受体-抗体或P-抗体和第二种治疗剂，可以设计并产生任何融合蛋白。融合蛋白技术可以容易的应用于制备具有其他修饰的融合蛋白，例如通过可选择性切割的肽序列连接两个部分，等等。使用重组DNA技术来实现这些目标现在对于本领域技术人员而言已是标准实践。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。还可以使用自动合成仪来进行DNA和RNA合成(参阅例如Sambrook等人描述的技术，1989，引入本文作为参考)。这种融合蛋白的制备通常必需制备第一个和第二个DNA编码区，并在同一读码框中功能性连接这些区从而产生编码所需融合蛋白的单个编码区。一旦产生了所需编码区，就可产生表达载体。表达载体在插入的DM区上游包含一种或多种启动子，该启动子启动DNA的转录并由此启动所编码的重组蛋白质的表达。这就是"重组表达"。为了获得构建体、受体-抗体或P-抗体的所谓的"重组"形式，将载体在重组细胞中进行表达。可以通过重组表达领域技术人员通常知道的技术对用于在原核或真核系统中表达的DNA片段进行改造。我们认为事实上可以采用任何表达系统来表达。本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体可以在真核表达系统中成功的表达，如CH0细胞，但是预计细菌表达系统(诸如大肠杆菌pQE-60)对于构建体的大量制备及随后纯化将是特别有用的。cDM也可以在细菌系统中进行表达，所编码的蛋白质表达为与P-半乳糖苷酶、泛素、日本裂体吸虫(5^力2'^OSO迈a力/70/2/c"/Z7)谷胱甘肽S转移酶等等的融合形式。我们认为细菌表达系统相对于真核表达系统在使用简便性和由此获得的物质的量方面具有优势。关于微生物表达，美国专利5，583，013、5,221,619、4,785,420、4，704，362和4，366，246(引入本文作为参考)进一步补充了本公开书关于重组宿主细胞中基因表达的内容。可以纯化重组产生的构建体、受体-抗体或P-抗体，并加以配制以施用于人。或者，可以经基因疗法递送编码构建体、受体-抗体或P-抗体的核酸。虽然可以釆用棵露的重组DNA或质粒，但是优选使用脂质体或载体。某些病毒经受体介导的内吞作用进入细胞的能力，和整合到宿主细胞基因组并稳定的、有效的表达病毒基因的能力，使得它们成为将外来基因转移至哺乳动物细胞内的引人注目的候选者。用于本发明的优选基因治疗载体通常是病毒载体。逆转录病毒有希望作为基因递送载体，因为它们能够将它们的基因整合宿主基因组中，从而转移大量的外来遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，且在特定细胞系中包装。其他病毒，诸如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)和腺伴随病毒(AAV),诸如美国专利5，139，941(引入本文作为参考)中描述的病毒，也可加以改造而作为基因转移的载体。虽然有些能够接受外来遗传物质的病毒所能够容纳的核苷酸的量受到限制，且它们感染的细胞范围也受到限制，但是这些病毒已经证明能够成功的实现基因表达。然而，腺病毒不将其遗传物质整合到宿主基因组中，因而基因表达不需要宿主复制，这使得它们特别适用于快速、有效的异源基因表达。本领域众所周知用于制备复制缺陷的感染性病毒的技术。在其他实施方案中，基因治疗载体是HSV。使HSV成为引人注目的载体的一个因素是基因组的大小和组织。因为HSV比较大，所以与其他较小的病毒系统相比，掺入多个基因或表达盒不太会成问题。另外，与其他系统相比，具有不同性能(如时间、强度)的不同病毒控制序列的可用性使得它有可能更大程度的控制表达。病毒具有相对较少的剪接信息，进一步简化基因操作，这也是优点。HSV还相对易于操作，而且可以生长至高滴度。当然，在使用病毒递送系统时，可能期望充分纯化病毒粒子，使它基本上不含不需要的污染物，诸如缺陷型感染性病毒颗粒或热原，由此不会在接受载体构建物的细胞、动物、或个体中引起任何不恰当的反应。纯化载体的优选方法包括使用浮力密度梯度，诸如氯化铯梯度离心。H.药物组合物本发明的治疗剂将通常被制备成药物组合物。药物组合物将包含生物学或治疗有效量的至少第一种本发明的治疗剂，它们溶解或分散于制药学可接受的载体或水性介质中。还包括联合治疗剂，而相同类型的相应药物组合物可用于单一和联合药物。术语"制药学或药理学可接受的"指当适当施用于动物或人后不会产生不利的、过敏的、或其他不良反应的分子实体和组合物。本发明同样包括兽医应用，且"制药学可接受的"制剂包括可用于临床和/或兽医应用的制剂。如本文所用，"制药学可接受的载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等。本领域众所周知这些介质和试剂对制药学活性物质的应用。在此范围内，除了活性成分与任何常规介质或试剂不相容，否则，预计它们能用于治疗组合物中。为了施用于人，制剂应当达到FDA局生物药剂标准要求的无菌、热原性、全面安全性、和纯度标准。组合物中还可以掺入补充的活性成分。"单位剂量"制剂是包含所施用成分适用于特定定时递送的一份剂量或亚剂量的类型。例如，例示性的"单位剂量"制剂包含每日剂量或单位或每日亚剂量、每周剂量或单位或每周亚剂量等等。Hl.可注射制剂本发明的治疗剂常常被配制成供肠胃外施用，尤其是对于肿瘤治疗来说，例如经配制供静脉内、肌肉内、皮下、经皮或其他这种途径的注射，包括蠕动施用和直接滴注至肿瘤或疾病位点(腔内施用)。本领域技术人员参照本公开书将知道含有抗体或免疫缀合物或肽缀合物作为活性成分的水性组合物的制备。这些组合物通常被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成适用于在注射前通过加入液体而制成溶液或悬浮液的固体形式；而且制品也可进行乳化。适于注射使用的制药学形式包括无菌水溶液或分散液；包括麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况下都必须是无菌形式，并且流动程度必须易于注射。制剂在制备和储存条件下必须很稳定，而且必须能够防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。治疗剂可配制成中性或盐形式的无菌水性组合物。可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或制药学可接受盐形式的治疗剂的溶液。制药学可接受的盐包括酸加成的盐(与蛋白质的游离氨基形成)，以及与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、三氯乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基基团形成的盐也可衍生自无机碱(诸如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)和有机碱(诸如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸，普鲁卡因、等等)。合适的载体包括含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇、等等)、其适当混和物、和植物油的溶剂和分散介质。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用包衣，诸如卵磷脂，在分散剂的情况中通过维持所需颗粒大小，和/或通过使用表面活性剂，可以维持适当流动性。在普通的储存和使用条件下，所有这些制剂应当包含防腐剂以防止微生物的生长。通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等，可以防止微生物的作用。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。在配制之前或之后，治疗剂应当彻底透析以除去不需要的小分子量分子，和/或适当时冻干，从而更易于配制到所需载体中。通过将所需量的溶于适当溶剂的活性剂与各种上述其他成分混和，随后过滤除菌，由此制备无菌的可注射溶液。通常，通过将各种无菌的活性成分掺入含基本分散介质和所需的上述其他成分的无菌栽体来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空千燥和冻干技术，由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。本发明的合适药物组合物通常包含与可接受的制药学稀释剂或赋形剂(诸如无菌水溶液)混合以达到所需终浓度范围(取决于预定用途)的一定量的治疗剂。本领域通常众所周知制备技术，例如可参阅《雷明顿制药科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)，第16版，Mack出版公司，1980(引入本文作为参考)。为了施用于人，制剂应当符合FDA局生物制剂标准要求的无菌、致热性、全面安全性、和纯度标准。配制后，以与剂型相容的方式，以治疗有效量施用治疗剂。H2.緩释制剂可以多种剂型容易地施用制剂，诸如上述可注射溶液的形式，但还包括其他制药学可接受形式，如片剂、丸剂、胶嚢或用于口服的其他固体、栓剂、阴道栓剂、滴鼻液或喷雾剂、气雾剂、吸入剂、局部制剂、脂质体形式等等。施用形式的类型应与治疗的疾病或紊乱匹配。可以使用制药学"慢释"胶嚢或"緩释"组合物或制剂。慢释制剂通常被设计成在较长的一段时间内维持恒定的药物水平，并可用于递送本发明的治疗剂。通常将慢释制剂植入疾病位点(例如肿瘤位点或病毒感染位点)附近。緩释制剂的合适范例包括含治疗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质为有形物品的形式，如薄膜或微嚢。緩释基质的范例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(如美国专利3，773，919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸y-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LupronDepot,由乳酸-乙醇酸共聚物与乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球体)和聚D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够在长达100天的时间里释放分子时，而某些水凝胶释放蛋白质的时间要短一些。当包嚢的抗体在体内维持了较长时间后，它们可能因暴露于37X:的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性降低和/或免疫原性改变。根据涉及的机制，可采用合理的策略来进行稳定。例如，若聚集机制涉及经疏-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制水气含量、使用适当添加剂、开发特异性聚合物基质组合物等等来实现稳定。H3.脂质体和納米颗粒(nanoparticle)在某些实施方案中，可以将脂质体和/或纳米颗粒用于治疗剂。本领域技术人员通常知道脂质体的制备和使用，见下文概述。本发明提供了抗体、脂质体和化疗剂的特别组合，见下文所述。此外，脂质体制剂还可用作本发明全部治疗剂中任一种的常规组分。由分散于水性介质并自发形成多层同心双层嚢泡(也称为多层嚢泡，MLV)的裤脂可形成脂质体。MLV的直径通常为25nm-4iam。对MLV的超声波处理导致形成小型单层嚢泡(SUV)，直径为200-500A,其核心含有水性溶液。当分散于水中时，根据脂质与水的摩尔比，磷脂还能够形成除脂质体以外的多种结构。在低比率，脂质体是优选结构。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体能够对离子性和极性物质显示低通透性，但是当温度升高时发生相变，显著改变其通透性。相变涉及由紧密的有序结构(称为凝胶态)向松散的无序结构(称为流体态)的改变。这发生于特征性相变温度，并导致对离子、糖和药物的通透性增加。脂质体经四种不同的机制与细胞发生相互作用网状内皮系统吞噬细胞的内吞作用，诸如巨噬细胞和嗜中性细胞；细胞表面的吸附，这通过非特异性弱疏水作用或静电作用来实现，或者通过与细胞表面成分的特异性相互作用；脂质体的脂双层通过嵌入原生质膜而与细胞膜的融合，同时将脂质体内容物释放进入细胞质；和脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或反向转移，无脂质体内容物的任何结合。改变脂质体制剂能够改变起作用机制，但是可能同时有超过一种机制起作用。纳米颗粒通常能够以稳定且可重现的方式俘获化合物。为了避免因细胞内聚合物过多引起的副作用，应当使用体内可降解的聚合物来设计这些超微颗粒(大小为大约O.1pm)。预计符合这些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，而且这些颗粒易于制备。H4.眼科制剂许多眼科疾病，尤其是具有血管发生成分眼科疾病都可以用本发明治疗。例如，如下所述，眼新血管疾病、与年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新血管性青光眼、晶体后纤维增生症和其他与角膜新血管生成或视网膜/脉络膜新血管生成相关的疾病。本发明的治疗剂由此可以有利的用于制备适合作为眼科用液使用的药物组合物，包括玻璃体内和/或眼房内(intracameral)施用的眼科用液。为了治疗任何上述或其他疾病，以按照传统制药学实践(参阅例如《雷明顿制药科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)，第15版，第1488-1501页(Mack出版公司，Easton，PA))制成的眼科制剂形式将治疗剂施用于需要治疗的个体的眼部。眼科制剂在制药学可接受的溶液、悬浮液或油膏中含有治疗剂，其浓度为大约O.01-大约l%(重量百分比)，优选大约O.05-大约O.5%。根据采用的具体化合物、待治疗个体的状况诸如此类，可能需要改变浓度。负责治疗的人员将为该个体确定最适浓度。眼科制剂通常优选无菌水性溶液的形式，如果需要，还可以包含额外成分，例如防腐剂、緩冲液、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型湿润剂或澄清剂、增稠剂等等。适用于这种溶液的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞等等。合适的緩沖液包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、醋酸钠、磷酸氢钠、等等，其量足以将pH维持在大约pH6-pH8，优选大约pH7-pH7.5。合适的张力剂是右旋糖酐40、右旋糖酐70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠、等等，使得眼科用液的氯化钠当量为O.9±0.2%。合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等等。合适的湿润剂和澄清剂包括聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊。合适的增稠剂包括右旋糖酐40、右旋糖酐70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、曱基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等等。眼科制剂将通过传统方法局部施用于需要治疗的个体的眼部，例如以滴液的形式或以眼科用液洗眼。H5.局部制剂在最广的意义上，局部施用制剂包括用于经口(口腔)和经皮肤递送的制剂。"局部递送系统"还包括含待施用成分的透皮贴剂。如果需要，还可以通过离子电渗或电转移来实现经皮肤的递送。适用于口局部施用的制剂包括在调味基质(通常是蔗糖与阿拉伯胶或黄荒胶)中包含活性成分的锭剂、在惰性基质(诸如明胶与甘油或蔗糖与阿拉伯胶)中包含活性成分的软锭剂、和在合适液态载体中包含待施用成分的漱口剂。适用于皮肤局部施用的皮肤包括在制药学可接受载体中包含待施用成分的油膏、乳膏、凝胶和糊剂。正如本领域众所周知的，用于局部施用的治疗剂的制剂，诸如乳膏、油膏和凝胶，包括油质或水溶性油膏基底的制剂。例如，这些组合物可以包含才直物油、动物脂肪、和更优选的得自石油的半固体碳氢化合物。所用具体成分可以包括白色油膏、黄色油膏、十六烷基酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、凡士林、白色凡士林、鲸蜡、甘油淀粉、白蜡、黄蜡、羊毛脂、无水羊毛脂和甘油单硬脂酸酯。还可以使用各种水溶性油膏基底，包括乙二醇醚及其衍生物、聚乙二醇、硬脂酸40聚烃氧基酯和聚山梨酯。用于直肠施用的制剂可以是在合适基底中包含例如可可脂或水杨酸酯的栓剂。适用于阴道施用的制剂可以是除了活性成分之外还包含本领域已知的适当载体的阴道栓剂、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂。H6.鼻科制剂经鼻和呼吸路径的局部递送可用于治疗各种状况，尤其是用于本发明的抗病毒治疗法中。这些递送路径还适用于将药剂递送到系统循环中。本发明因此包括在适用于鼻施用的载体中包含活性成分的制剂，例如鼻科用液、喷雾剂、气雾剂和吸入剂。当载体是固体时，制剂包括具有20-500微米颗粒大小的粗粉，当施用时，将装有粉末的容器置于鼻下由鼻孔快速吸入。载体是液体的合适制剂可用于鼻施用。鼻科用液常常是设计并制备成滴液或喷雾剂、经鼻孔施用的水性溶液，它们在许多方面与鼻分泌物相似，使得能够维持正常的纤毛作用。由此，水性鼻科用液通常是等渗并略有緩冲的，维持于pH5.5-6.5。另外，如果需要，制剂中剂。已知多种商品化的鼻科制剂，包括例如抗生素和抗组胺剂，并用于预防哮喘。吸入剂是设计用于将药物或化合物递送至患者呼吸树的药物制剂。施用水汽或水雾并使之到达受疾病侵袭区域。此路径还可用于将药剂递送至系统循环中。可以通过鼻或口呼吸路径施用吸入剂。只有当小液滴足够细小且大小均一从而水雾能够到达细支气管时，吸入液的施用才会有效。同样称为吸入剂、有时称为吹入剂的另一组产品包含精细粉状或液体药物，它由特殊递送系统(诸如在液化气体推进剂中包含药物溶液或悬浮液的药物气雾剂)携带进入呼吸通路。当经合适阀门和口接管释放时，将计量剂量的吸入剂推进到患者呼吸道中。颗粒大小在这种类型制剂的施用中特别重要。据报导，渗透进入肺腔的最佳颗粒大小范围为O.5-7|im。通过对气雾剂增压而产生精细水雾，由此使其应用具有上述优点。I.结合、功能和筛选测定法本发明不但在动物和人的治疗方案中具有显著效用，而且它还具有许多其他特殊和可靠的用途，包括在许多体外方案中的实际应用。某些应用涉及构建体、受体-抗体或P-抗体的特异性结合特性。由于本发明的所有构建体都包含至少一种可结合PS或阴离子磷脂的蛋白质或肽成分，因此事实上它们可用于多种结合方案中，包括有用的结合测定法。尽管相关时存在的Fc区或所附着的试剂提供了有益特性，但是不否定第一种区域在任何结合测定法中的效用。因此，适用的结合测定法包括常常被本领域所釆用的方法，诸如免疫印迹、Western印迹、点印迹、RIA、ELISA、免疫组织化学、荧光激活细胞分拣术(FACS)、免疫沉淀、亲和层析、等等，本文对此有进一步描述。某些标准结合测定法将抗原固定在固体支持物基质，如硝酸纤维素、尼龙或其组合上，诸如免疫印迹、Western印迹、ELISA和相关测定法。其他的重要检测法是那些利用细胞的检测法，其中本发明的组分可用于检测在细胞表面具有PS或阴离子磷脂的细胞。这些测定法可用于临床前检测，如，关于药物的设计、检测作用机制和/或选择联合使用的治疗剂。其他的体外检测法可用于诊断与异常细胞活化和/或凋亡相关的疾病，其中检测PS或阴离子磷脂在细胞表面的存在尤其有用。本发明的构建体还可在免疫组织化学中与新鲜冷冻的和福尔马林固定、石蜡包埋的组织块相结合使用；用于荧光激活的细胞分拣术、流式细胞计或流式显微荧光测定法中。本发明的构建体还可进一步用于免疫沉淀，用于抗原纯化实施方案，例如亲和层析，和用于本领域技术人员根据本文提供的信息将了解的其他结合测定法。本发明的其他实际用途是在功能测定法中作为对照，包括许多体外和离体测定法和系统。按本文所^^布的，由于本发明构建体、受体-抗体或p-抗体的结合和功能特性特别有特异性，因此这种"对照"用途事实上极有价值。受益于本发明的这种实际用途的测定法包括例如关注于检测在细胞表面的PS或阴离子磷脂的测定法。这些测定系统还可以发展成体外或离体药物筛选测定法，其中本发明提供的具有详细描述特性的生物学物质特别重要。例如，在药物筛选和开发中，利用本发明的构建体作为阳性对照选择具有类似、同等或改良结合特性的小分子。本发明的结合测定法和系统还可以发展成体外或离体药物篩选测定法，其中本发明提供的具有详细描述特性的生物学物质特别重要。例如，在药物篩选和开发中，利用本发明的构建体作为阳性对照选择具有类似、同等或改良结合特性的小分子。J.诊断和治疗药剂盒本发明还提供了包含至少第一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体的诊断和治疗药剂盒，可用于治疗方法、组合型治疗方法和/或用于成像和治疗实施方案中。这些药剂盒通常在至少第一种合适的容器(或容器装置)中包含至少一种本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体的制药学可接受制剂。药剂盒还包含书面或电子版的说明书，用于如临床前、临床和/或畜兽医实施方案中。制药学可接受制剂和第二生物学和治疗剂。例如，这些药剂盒可以包含任何一种或多种化疗或放疗药物、抗血管发生剂、抗肿瘤细胞抗体、抗肿瘤血管系统或抗肿瘤基质的抗体、免疫毒素或凝血配体、抗病毒剂和/或诊断性组分或药剂。还可包括用于組合疗法和/或诊断和成像的书面或电子版说明书。药剂盒中可以只有单一容器(容器装置)，其中装有所述第一种构建体、受体-抗体或p-抗体，含或不含其他成分；或者，药剂盒中可以有不同容器，其中各装有所需药剂。当提供联合治疗剂时，可以以等摩尔或一种成分过量的联合方式预先混和单一溶液；或者，可以在施用于患者前，在不同容器中分开保存药剂盒中本发明的主要治疗剂和第二种生物活性剂或治疗剂，诸如第二抗癌剂或抗病毒剂。诊断组分最通常保存于至少第二种容器中，其区别于含所述一种或多种治疗剂的其他容器或第一种容器。诊断药剂盒可以包含可结合PS的经标记的抗体或肽，或适于诊断待治疗疾病的任何其他试剂。药剂盒中可包括体内或体外使用的诊断剂，或者二者兼之。药剂盒可包括书面或电子版的说明书，用于如临床前、临床和/或兽医诊断实施方案中。为了进行体外免疫检测，构建体、受体-抗体或p-抗体也可以与诸如微量滴定板的孔等的固体支持物结合。免疫检测药剂盒优选包含至少第一种免疫检测剂。药剂盒的免疫检测剂可以采取多种形式中的任一种，包括那些与给定抗体相关或连接的可检测标记，诸如体内使用的标记。还包括与第二种结合性配体联接或附着的可检测标记。典型的第二种配体是那些与第一种抗体具有结合亲和力的二抗。另外合适的用于本发明药剂盒的免疫检测剂包括含有与第一种抗体具有结合亲和力的二抗以及与第二种抗体具有结合亲和力的第三种抗体的双组分试剂，第三种抗体与可检测标记连接。许多典型的标记是本领域已知的且可与本发明联合应用。这些药剂盒可以包含完全缀合形式、中间态形式或作为分离部分由药剂盒使用者缀合的抗体-标记缀合物。成像药剂盒优选包含已与体内可检测标记附着的靶向剂或抗体。不过，标记和附着方式可以分开应用。任一种形式的诊断药剂盒都可进一步包含对照药剂，诸如适当分装的生物学组合物，无论是标记的还是未标记的，如在制作检测试验的标准曲线即会用到。药剂盒的组分可以以水溶液或冻干形式包装。当以一种或多种液态溶液提供药剂盒成分时，液态溶液优选水性溶液，特别优选无菌水性溶液。但是，也可以以干粉形式提供药剂盒成分。当以干粉形式提供药剂或成分时，可以通过向干粉中加入合适溶剂来进行重建。还可以在药剂盒内的其他容器中提供溶剂。诊断和治疗药剂盒的容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、玻璃瓶、注射器或其他容器或容器装置，其中装有治疗剂和任何其他所需试剂，且优选适当分装。当优选至少两种分离的组分时，药剂盒将优选包括至少两个这样的容器。药剂盒还可以包含第三种/第四种容器装置，用来包装制药学可接受的无菌緩沖液或其他稀释剂。药剂盒还可以包含对动物或患者施用治疗剂的装置，如一套或多套针头或注射器、眼滴瓶、取液器或其他这类装置，由此将制剂注射到动物体内或应用于体内患病区域。本发明的药剂盒通常还包含装这些小瓶等和其他成分以供出售的密封装置，例如注射或吹制成型的塑料容器，其中装有所需小瓶和其他装置。K.免疫检测和成像本发明还提供了供体外和体内使用的诊断和成像方法。这些方法可用于获得诊断、预后和/或成像信息，例如与血管发生疾病和病毒感染相关的信息，优选与肿瘤治疗和成像方法相关的信息。本发明的方法包括体外诊断试验，如在可以非侵入方式获得样品并优选在高通量测定法中进行检验时，和/或临床诊断不明且需要确认时即如此。在体内诊断和成像领域内，本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体与一种或多种可检测药剂连接并用于形成血管发生位点或肿瘤的图像，任选这作为治疗前的第一步进行。Kl.免疫检测方法和药剂盒本发明因此涉及用于结合、纯化、定量或一般性检测PS和阴离子磷脂的免疫检测方法，如用于诊断活化的和凋亡的细胞以及相关疾病。本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体可用于在体内、在分离的组织样品、活组织样品或拭子中和/或在匀浆組织样品中检测PS和阴离子磷脂(见下文)。这些免疫检测方法具有明显的诊断效用，而且还可用于非临床样品，例如抗原样品的滴定等。诸如Nakamura等人(1987，特别引入本文作为参考)等科学文献已经描述了各种有用的免疫检测方法的步骤。免疫结合方法通常包括获得怀疑含有PS或阴离子磷脂的样品，优选怀疑在细胞表面有PS的细胞，并在能够有效形成免疫复合物的条件下使样品接触本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体。然后检测在结合作用期间形成的任何免疫复合物并优选进行定量。被分析的样品可以是细胞样品，例如在实验室中暴露于一定检测条件下的细胞。样品还可以是来自动物或患者，如怀疑患有与一种或多种细胞类型的活化或凋亡相关的疾病的动物或患者的生物学样品。这些样品可以是组织切片或标本、活检组织样品、待测样品式子或涂片、匀浆组织提取物或者其分离的或纯化的形式。在能够形成免疫复合物(初级免疫复合物)的有效条件和足够时间下使选定的生物学样品接触构建体、受体-抗体或p-抗体，通常也就是简单地向样品中加入构建体、受体-抗体或P-抗体，并且将混合物孵育足够长的时间以使所述构建体、受体-抗体或^-抗体能够形成免疫复合物(即结合存在的任何PS或阴离子磷脂)。而此后，通常清洗样品组合物，诸如组织切片或ELISA板，从而除去任何非特异性结合的种类，使得只能检测到初级免疫复合物中特异性结合的那些。本领域众所周知免疫复合物形成的检测，而且可以通过多种方法来实现。这些方法通常基于标志或标记物的检测，诸如本领域已知的放射性、荧光、生物学或酶学标签或标记。涉及这些标记物应用的美国专利包括3，817，837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4，277，437、4，275，149和4，366，241(引入本文作为参考)。通常优选使用在接触显色底物后产生有色产物的酶。正如本领域知道的，也可以使用第二种结合性配体，诸如二抗或生物素/抗生物素蛋白配体结合组。在检测中采用的构建体、受体-抗体或P-抗体自身可以连接可检测标记物，然后可以通过简单的检测这种标记物来测定组合物中初级免疫复合物的量。优选通过使用对本发明构建体、受体-抗体或P-抗体具有结合亲和力的第二种结合性配体的方法来检测初级免疫复合物。在这些情况中，第二种结合性配体可以连接可检测标记物。第二种结合性配体自身常常是抗体，因此可以称为"二抗，，。在能够形成次级免疫复合物的有效条件和足够时间下，使初级免疫复合物接触经标记的第二种结合性配体或抗体。然后通常清洗次级免疫复合物以除去任何非特异性结合的经标记的第二种抗体或配体，并检测次级免疫复合物中的剩余标记。其他方法包括通过两步法来检测初级免疫复合物。如上所述，使用对一抗具有结合亲和力的第二种结合性配体(诸如抗体)来形成次级免疫复合物。清洗后，再次在能够形成免疫复合物(三级免疫复合物)的有效条件和足够时间下，使次级免疫复合物接触对二抗具有结合亲和力的第三种结合性配体或抗体。第三种配体或抗体连接了可检测标记物，能够检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要，该系统可以提供信号放大。临床诊断或监测可用于患各种疾病的患者，尤其是与细胞表面上PS或阴离子磷脂暴露增加相关的疾病。PS或阴离子磷脂的检测，或与来自正常受试者的相应生物学样品中的水平相比较而言的PS或阴离子磷脂水平的增加，是患所述疾病的患者的指标。但是，正如本领域技术人员所知道的，不能孤立的根据这种方法来进行临床诊断。本领域技术人员非常熟悉任何区分代表阳性鉴定的生物标记的显著表达与生物标记的低水平或背景表达。事实上，常常将背景表达水平作为"临界点"(cut-off)，比它更多的染色将评为显著或阳性。K2.体内成像本发明提供了各种体内诊断和成像的实施方案。本发明的某些方面涉及用于体内诊断和成像的新的和出乎意料地有效的组合物。例如，本发明的构建体、受体-抗体或0-抗体可以与体内可检测试剂连接而形成本发明的免疫诊断缀合物。所产生的免疫诊断剂现在可用于前述的与PS或阴离子磷脂检测相关的诊断或成像实施方案中。在这点上，含本发明构建体、受体-抗体或抗体的免疫诊断剂可用于血管血栓形成的成像，尤其是在心脏内或心脏附近，诸如深静脉血栓症、肺栓塞、心肌梗死、心房颤动、与修复性心血管材料有关的问题、中风，等等。本发明的这些组合物还可用于活化血小板的成像，如在诸如脓肿、再狭窄、关节发炎和止血失调，例如动脉、冠脉、静脉和脑血栓症等等。本发明的免疫诊断组合物还可用于检测凋亡细胞中，正如可用于其中增加了凋亡或发生了不适当凋亡的各种疾病的诊断和成像中一样。本发明的体内成像组合物和方法可用于成像本身，或在体内对位点预成像以便在治疗前形成可靠的图像。优选成像是肿瘤成像。这些组合物和方法还可应用于与PS和阴离子磷脂相关的其他疾病或病症的成像和判断，这样的病症涉及细胞活化和/或凋亡，包括血管发生疾病、动脉硬化症、病毒感染和为诊断或预后目的或者为了设计治疗而期望获得内部影像的其他这样的状况。在这些实施方案中，将本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体可操作性地附着、连接或缀合至可检测标记。"可检测标记"指能够根据其特定功能特性或化学特征而进行检测的化合物或元素，利用它能够检测出所附着的成分，如果需要，还可以进一步量化。在用于体内诊断方案或"成像方法，，的缀合物中，可以使用非侵入式方法来检测所述标记。本领域知道许多适当的成像剂，以及将它们附着于结合性配体的方法(参阅如美国专利5，021，236和4，472，509，引入本文作为参考)。某些附着方法涉及使用金属螯合复合物，其中将例如有机螯合剂(诸如DTPA)附着于抗体上(美国专利4，472，509)。在存在偶联剂(诸如戊二醛或高碘酸盐)时，也可以使单克隆抗体与酶发生反应。在存在这些偶联剂时，或者通过与异硫氰酸酯的反应，可以制备包含荧光素标记物的缀合物。可检测标记物的范例是顺磁离子。在这种情况中，合适的离子包括铬(ni)、锰(n)、铁(ni)、铁(n)、钴(n)、镍(n)、铜(n)、钕(ni)、彩(ni)、镱(ni)、钆(in)、钒(n)、铽(iii)、镝(in)、钬(in)和铒(in)，特别优选的是钆。可用于其他情况(诸如x射线成像)的离子包括(但不限于)镧(ni)、金(in)、铅(n)，特别是铋(in)。荧光标记包括罗丹明、荧光素和renographin。常常经异硫氰酸酯中间介质来连接罗丹明和荧光素。在用于诊断性应用的放射性同位素的情况中，合适的范例包括"碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152铕、镓67、3氬、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、"硒、35硫、锝，和钇9。。1251常常优选用于某些实施方案，而锝""和锢m因它们的低能量和适于长期检测也常常是优选的。可以参照本领域众所周知的方法产生用于本发明的经放射性标记的构建体、受体-抗体或p-抗体。例如，常用于使放射性同位素金属离子结合在抗体上的中介官能基是二乙撑三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。也可以通过接触碘化钠或碘化钾与化学氧化剂(诸如次氯酸钠)或酶氧化剂(诸如乳过氧化物酶)使构建体、受体-抗体或P-抗体碘化。可以通过配体交换方法用锝"标记本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体，例如，通过用亚锡溶液还原过锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体应用于该柱直接标记纟支术也是合适的，如将过锝酸盐、还原剂(例如SNC1J、緩冲液(诸如邻苯二甲酸钠钾溶液)与抗体一起孵育。任何前述类型的经可检测地标记的结合性配体都可用于本发明的成像方面，其或者仅仅用于成像或者用于在治疗前形成疾病位点或肿瘤的图像。无论走任一途径，所述的方法通常包括对动物或患者施用诊断有效量的与以非侵入方法可检测的标记物相缀合的构建体、受体-抗体或p-抗体。允许所述结合性配体-标记物缀合物有足够时间定位并结合于发病部位(诸如肿瘤或肿瘤血管)中表达PS或阴离子磷脂的细胞。然后将患者暴露于检测装置中以鉴别可检测标记，由此形成发病部位或肿瘤的图像。用核磁成像装置检测诸如钆等核磁共振同位素；用y闪烁相机或检测仪检测诸如锝，或铟m等放射性物质。为了提供更多的有关可检测标记构建体安全有效进入受试者血液的指导以及用例如Y闪烁相机或磁共振检测法体外测定可检测标记的药剂分布的方法，我们将美国专利5，627，Q36也特别引入本文作为参考。用于成像实施方案的剂量通常小于治疗的剂量，但也取决于患者的年龄和体重。每个患者一次剂量为约O.1mg、0.5mg或约lmg到约9mg或10mg，更优选在约lmg到约5-10mg之间的抗体或结合性配体缀合物被认为是有用的。K3.用于癌症治疗的替代标记物关于体内诊断和成像，本发明进一步提供了用作癌症治疗替代标记的组合物和使用方法。这样的实施方案涉及使用与体内可检测试剂连接的本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体。目前使用的许多抗癌疗法诱发了凋亡和坏死。阴离子磷脂，尤其是PS,是凋亡前和凋亡细胞的标志物。因此，利用合适的构建体、受体-抗体或p-抗体进行成像可以用来鉴定凋亡前和凋亡细胞并由此提供有关治疗进展的信息。用于本文时，这是"用于癌症治疗的替代标记物"的含义。利用本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体作为替代标记物对于癌症治疗尤其有利。例如，鉴定凋亡前细胞的能力尤其有好处。该特异性还将为内科医师提供更有意义的图像数据。此外，该安全特性是令人印象深刻的且优越于膜联蛋白，例如，膜联蛋白具有与凝血有关的缺点。因此，上述任何体内诊断和成像方法都可能适于作为替代标记物用于癌症治疗的预后中，仅仅施用于接受癌症治疗的患者中即可。L.胂瘤治疗本发明的重要方面涉及恶性肿瘤、肿瘤和血管化肿瘤的治疗。这包括血管发生有或多或少重要性的肿瘤和具有前血栓性血管的肿瘤。良性肿瘤的治疗也包括于本发明中，诸如听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼、化脓性肉芽肿和BPH。血液肿瘤的治疗也涵盖在内，诸如白血病和各种急性或慢性骨髓瘤疾病。本发明可广泛的用于治疗任何恶性肺瘤，无论该肺瘤是否具有血管组分。可治疗的肿瘤包括实体瘤，尤其是癌，它需要血管成分来提供氧气和营养。典型的可用本发明治疗的实体瘤包括，但不局限于，肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、腺癌、小细胞癌、恶性黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤等等。本发明被包括用于治疗任何患实体瘤的患者。一般而言，本发明可用于治疗所有尺寸的肿瘤，包括约O.3-0.5cm和更大的肿瘤以及大于O.5cm的肿瘤，所患肿瘤在约l.0和约2.0cm大小之间的患者，也可以治疗人体中已发现的最大的肿瘤。尽管本发明通常并不意图用作防护性的或预防性的疗法，但本发明的使用当然不局限于治疗患中等大小或大肿瘤的患者。造成本发明的这些方面是有许多原因的。例如，呈现中等大小或更大原发肿瘤的患者还可能具有被认为小尺寸或甚至在转移性肿瘤萌芽早期的各种转移性肿瘤。既然本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体通常施用入患者的全身循环中，它们将自然对次级的、较小的和转移性肿瘤具有效用，尽管这可能不是治疗的最初目的。此外，即使在肿瘤块整体是一单一的小肿瘤的情况下，使用本发明的疗法也将产生某些有利的抗肿瘤效果。本文提供的关于使用本发明治疗更合适的患者的指导意欲指出，某些患者特征可能有助于选择可用本发明治疗的患者。预先选择某些患者，或将患者分类，并不否定本发明可用于治疗患癌症的所有患者。进一步考虑的事实是本发明抗体疗法对肿瘤的攻击可能使肿瘤易于接受进一步的治疗，从而使随后的治疗导致全面协同效果或甚至导致完全消除或治愈。不认为任何特定类型的胂瘤应当排除在本发明治疗以外。但是，肿瘤细胞的类型可能与本发明与其他治疗剂、特别是化疗剂和抗肿瘤细胞免疫毒素的联合使用有关。由于本发明在其作用模式内包括肿瘤血管系统的靶向和破坏，并且所有实体瘤中的血管系统基本上或完全相同，所以可以理解，本发明方法学广泛或完全适用于治疗所有实体瘤，无论肿瘤细胞自身是哪种特定的表型或基因型。本文所呈现的结果是引人注目的，由于它在多种不同肿瘤模型中都显示了不寻常的结果。使用来自动物模型的资料，如本文详细显示的研究，以及一系列治疗剂的临床使用资料，可以容易的确定治疗有效剂量。在转换成临床环境之前，常常用携有实体瘤的实验动物来优化合适的治疗剂量。已知这些模型能够很可靠的预测有效的抗癌策略。例如，携有实体瘤的小鼠(例如实施例中使用的)被广泛用于临床前检验。发明人已经使用了这样的本领域认可的小鼠模型来确定治疗剂给出有益抗肿瘤效果而毒性最低的工作范围。就肿瘤疗法而言，在考虑到与本发明整体有关的使用安全优势之时，也可以参考关于成功使用其他抗血管疗法的科学和专利文献。作为例示，美国专利5，855，866、5，877，289、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,776,427、6,004,554、6，036，955和6，093，399在此引入作为参考，以便进一步描述所说治疗剂也可如同本发明中的其他药剂一样应用。美国专利6，312,694、6,783,760、6，818，213和6，406，693也特别引入本文作为参考，以指导用未缀合的抗PS抗体及相关免疫缀合物进行治疗的方法和剂量。正如本领域知道的，有一些现时目标可以作为进行临床治疗前的临床前检验中的指导方针。然而，由于在已认可模型中已证明的安全性，本发明的临床前试验将更倾向于最优化，而不仅仅是证实效力。因此，临床前检验可用于选择最有利的抗体、剂量或组合。导致任何一致性可检测抗肿瘤效果，包括可检测的肿瘤血管退化、肿瘤血栓症和/或破坏和肿瘤坏死的任何制剂、组合方法或药物都将成为有用的发明。退化、血栓、破坏和坏死效果优选应在约10%到约40-50o/。之间的肿瘤血管和肺瘤组织中观察到，甚至在多达约50%-约99%的肿瘤血管和肿瘤组织中可观察到所说的效果。本发明还对肿瘤下游的脉管有效，即靶向至少一类引流脉管，特别是当由胂瘤释放的细胞因子作用于这些脉管，改变它们的抗原特性时。还可以理解的是，甚至在治疗的抗肿瘤效果为预定治疗范围低端值的情况下，与特定肿瘤靶有关的其他已知疗法相比，这种疗法仍然可能同样甚至更加有效。不幸的是，临床医生知道某些肿瘤不能在中期或长期中获得有效治疗，但是这并不否定本发明疗法的有效性，当它与通常建议的其他策略至少大致一样有效时尤其如此。在为治疗血管化肿瘤设计构建体、受体-抗体或p-抗体的适当剂量时，可以容易的由本文所述动物研究进行外推，从而获得临床施用的适当剂量。为了实现这一转变，需要考虑对单位质量的实验动物所施用的药剂量，优选考虑实验动物与人患者之间的体表面积差异。所有这些计算对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，而且是常规的。例如，采用小鼠研究中治疗剂的成功剂量，并通过应用基于质量和表面积的标准计算，将得出活性剂用于人患者的有效剂量是每个患者大约lmg-大约500mg抗体，优选大约IOmg-大约100mg抗体。由此，根据这一信息，发明人预计施用于人的有用低剂量将是大约l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30mg/个患者；施用于人的有用高剂量将是每个患者大约250、27、300、325、350、3W、400、425、450、475或约500mg左右。施用于人的有用中间剂量4皮i人为是每个患者大约35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或大约225mg左右。一般而言，优选剂量范围是每个患者约5-100mg、约10-80mg、约20-70mg、约25-60mg或约30-50mg。不过，也可以考虑使用任何前述示范性剂量的任何特殊剂量范围或在特别提及的范围间的任何有效中间剂量。无所谓提及的范围，应当理解，根据给定的参数和本文所提出的详细指导，活性或最佳范围内进一步的变化都将涵盖于本发明内。因此，可以理解，较低剂量更适于与其他药剂联合，高剂量仍然可以耐受，由于本发明构建体的安全性获得增强，因此更是如此。人构建体以及人效应物的应用使得本发明在临床应用中甚至更安全，可进一步降低在健康组织中产生显著毒性或副作用的机会。本发明治疗方案的目的通常是产生显著的抗肿瘤效果，同时将剂量维持在与不可接受的毒性相关的水平以下。除了改变剂量本身以外，还可以改变施用方案以优化治疗策略。目前优选的治疗策略是施用约1-500mg,优选约10-100mg的抗体或含有它们的治疗剂混合物，在约7天期间施用约3次。例如，可以在约第l天、第3或4天和第6或7天给药。在施用特定剂量本身时，优选给患者全身性提供制药学可接受的组合物(符合FDA关于无菌、致热性、纯度和全面安全性的标准)。通常优选静脉内注射，最优选在大约l或2小时左右的时间内进行连续灌注。尽管在使用本发明进行治疗前不需要测定所说的参数，应当提及本文所详述的这些研究在注射约12-24小时内在实体瘤血管内特异观察到了至少一些血栓形成，且肿瘤细胞本身在约24-72小时内开始死亡。在紧接着的约48-96小时内通常观察到普遍的肿瘤坏死，观察到多达60%、甚至多于60。/。的肿瘤坏死。自然，在广泛应用前需要进行临床试验。本领域技术人员参照本公开书将知道进行临床试验的多种要素。提供下列资料作为建立这些试验的一般性指导。选择用于第一种治疗研究的患者应是对至少一个疗程的常规疗法没有应答，而且通过体格检查、实验室技术和/或放射显影方法测定出该患者患有客观的可测量疾病。在开始研究前2周应当停止任何化疗。当使用鼠单克隆抗体或抗体部分时，患者应当对小鼠免疫球蛋白没有变态反应史。发现使用具有三联腔门的内置式中枢静脉导管具有某些优点。应当使用例如0.22|im的滤器过滤治疗剂，并用诸如生理盐水适当稀释至终体积IOOml。使用前，也应当以相似方式过滤待测样品，过滤之前和之后通过测定A浏评估其浓度。预计回收率应当在87%-99%范围内，然后可以根据蛋白质的损失进行调整。构建体可以在大约4-24小时的时间内施用，每个患者以2-7天的间隔接受2-4次输注。也可以在7天的时间内以稳定的输液速率施用。输液的剂量水平应当取决于是否观察到任何毒性。因此，如果任何单次输液后或稳定速率输液的特定时间点达到II级毒性，那么应当停止进一步的给药或停止稳定速率输液，直至毒性改善为止。应当将增加的剂量施用于患者组直至任一组中大约60%的患者显示不可接受的ni级或IV级毒性。将该值2/3的剂量确定为安全剂量。当然，治疗之前和治疗后每隔不超过l个月应当进行体格检查、肿瘤测量和实验室检验。实验室检验应当包括全血计数、血清肌酸肝、肌酸激酶、电解质、脲、氮、SG0T、胆红素、白蛋白和总血清蛋白。应当通过放射免疫测定法评价治疗后长达60天取的血清样品中所施用的构建体和针对其任何部分的抗体的存在情况。使用任何标准测定法(例如ELISA或RIA)对血清进行的免疫学分析，能够评价治疗剂的药代动力学和清除情况。为了评价抗肿瘤应答，应当在最后一次输注后48小时-l周内和第30天检查患者。当存在可触知的疾病时，应当在治疗过程中的每一天、治疗完成后的1周内和第30天测定所有肿瘤块的两个正交直径。为了测量不可触知的疾病，应当在48小时-l周内和第30天，遍及胸、腹和骨盆以lcm为间隔进行系列CT扫描。还应当使用疾病位点活组织切片或适当时使用血液或流体样品，在组织学上和/或通过流式细胞术评价组织样品。可以通过可接受的测量来确定临床应答。例如，治疗后l个月所有可测量肿瘤消失可以确定为完全应答。而治疗后l个月所有可评估的肿瘤结的正交直径乘积的总和降低50%或更多，并且无肿瘤位点显示增大，可以确定为部分应答。相似的，治疗后l个月所有可测量病变的正交直径乘积减少50%或更多，并且一个或多个位点发生恶化，可以确定为混合应答。根据来自临床试验的结果(诸如上文所述)，可以设计甚至更精确的治疗方案。虽然如此，根据治疗个体的状况，后来可能必须对剂量做一些改变。负责施用的医师参照本公开书将能够为各个受试者确定适当剂量。这些优化和调整在本领域是常规的，绝非反映需要过多实验。M.组合肿瘤疗法本发明的治疗方法可以与常用于治疗患者展示的特定肿瘤、疾病或紊乱的任何其他方法结合使用。只要知道特定的治疗方法自身对患者状况无害，且不显著抵消本发明的治疗，那么就可以与本发明联合使用。也考虑组合疗法用于非恶性疾病的治疗。具体的例子是良性前列腺肥大(BPH)，它可以用本领域目前实施的其他疗法联合治疗。例如，将免疫毒素靶向于BPH内定位的标记物，诸如PSA。对于实体瘤的治疗，本发明可以联合经典方法，诸如手术、放疗、化疗、细胞因子疗法、抗血管形成等等。本发明由此提供了联合疗法，即在手术或放疗之前、之时或之后使用构建体、受体-抗体或P-抗体；或者，在传统的化疗、放疗剂、细胞因子、抗血管发生剂、凋亡诱导剂、靶向性免疫毒素或凝血配体等之前、之时或之后对患者进行施用。上文针对本发明缀合物方面描述了合适治疗剂的许多实例。在本发明的組合疗法中，开始被描述用作治疗缀合物一部分的任何药剂也可以分开使用。至于手术，任何手术干预都可以与本发明联合实施。至于放疗，包括用于在肺瘤细胞内局部诱导DM损伤的任何机制，诸如Y照射、X射线、UV照射、微波和甚至电子发射等。也包括将放射性同位素靶向递送至肿瘤细胞，这可以与靶向抗体或其他靶向方法联合使用。众所周知物质联合在癌症治疗中的一般性应用。例如，美国专利5,710,134(引入本文作为参考)公开了与无毒物质或"药物前体"联合时在肿瘤中诱导坏死的成分。由坏死过程释放的酶切割无毒的"药物前体，，变成有毒的"药物，，，从而导致肿瘤细胞死亡。同样，美国专利5，747,469(引入本文作为参考)公开了编码p53的病毒载体与DNA破坏剂的联合应用。任何这些相似方法都可用于本发明。当一种或多种药剂与本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体联合使用时，不要求联合结果是分开进行每种治疗时观察到的效果的加和。虽然通常希望获得至少加和的效果，但是抗肿瘤效果相对于一种单一疗法有任何增长也是有益的。同样，没有特别要求联合治疗展示协同效果，尽管这当然是可能的且有益的。Ml.第二抗癌剂的选择本发明的"主要治疗剂"在用于本文中时，是构建体、受体-抗体或p-抗体或其缀合物。"第二治疗剂，，在用于本文时，是另一种不同的治疗剂或抗癌剂，即，"除了"主要治疗剂之外的治疗剂或抗癌剂。任何第二治疗剂都可与本发明的治疗剂联合使用。此外，按照下述说明，可以从达到加和、大于加和和潜在的协同效果的出发点选择第二治疗剂或"第二抗癌剂"。为了实施组合的抗肿瘤治疗，可以只是简单的将本发明的构建体、受体-抗体或)3-抗体与其他，即另一种不同的抗癌剂以在动物或患者内有效产生其联合抗肿瘤作用的方式联合施用于动物或患者。因此，可以有效地导致其联合存在于肿瘤或肿瘤血管系统中以及它们在肿瘤环境中的联合作用的量和时间提供所说的药剂。为了达到此目的，可以基本上同时施用本发明的主要治疗剂和不同的第二抗癌剂，它们或者在单一的组合物中，或者作为两种不同的組合物通过不同的途径施用。或者，可在该不同的第二抗癌剂之前或之后施用本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体，如间隔数分钟到数周。在本发明的主要治疗剂和该不同的第二抗癌剂分別施用于动物的某些实施方案中，应保证在各递送的时间之间不花费太多时间，从而使各药剂仍然能够发挥其在肿瘤上的优越组合效果。在这些情况下，预计可以相互间间隔约5分钟到约l周内用两种药剂接触肿瘤，更优选，相互间间隔约12-72小时内，最优选的延迟时间是只有约12-48小时。可基于一定的标准，包括那些下述的标准，选择用于分别定时的组合疗法的第二治疗剂。不过，优选一种或多种不同的第二抗癌剂用于在先或后续给药并不排除在需要时将它们基本上在同一时间施用。选择在本发明主要治疗剂施用"之前"施加且设计成达到增大和潜在协同效应的不同的第二抗癌剂包括在肿瘤血管系统中诱导氨基磷脂或阴离子磷脂表达的活性剂。例如，刺激定位钙产生、激活转移PS和其他磷脂至质膜外表面的膜转运蛋白、损伤肺瘤内皮、在肿瘤内皮中引起凋亡前变化和/或诱导凋亡的药剂通常将导致氨基磷脂和阴离子磷脂表达增加。这些药剂的例子是多西他赛和紫杉醇。然后可用本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体靶向氨基磷脂和阴离子磷脂，由此扩大了整体治疗效果，还通过宿主效应器(补体、ADCC、抗体介导的吞噬作用、CDC)提高了攻击性。对血管发生、重新塑造或活化的内皮细胞具有选择性的药物，诸如存在于肿瘤血管中，但不存在于正常静息血管中的药物，也可用于选择性的引起PS和其他磷脂暴露于肿瘤内皮细胞的表面。这些药剂的例子是考布他汀和多西他赛。这将再次导致增加抗体的结合并增强宿主效应器才几制的启动。选择在本发明主要治疗剂施用"之后"给药且设计成达到增大和潜在地协同的效应的不同的第二抗癌剂包括在主要治疗剂效果中受益的药剂。本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体将引起肿瘤破坏。因此，随后施用的有效第二独特抗癌剂包括抗血管发生剂，它抑制转移；靶向于坏死肿瘤细胞的药剂，例如特异于体内恶性细胞上变得易接近的细胞内抗原的抗体(美国专利5，019，368、4，861，581和5，882，626，分别引入本文作为参考)；化疗剂和抗肿瘤细胞免疫缀合物，它们攻击可存活于外围的任何肿瘤细胞。在有些情况中，当相应施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至几月(1、2、3、4、5、6、7或8)时，可能需要显著延长治疗时间。这对于其中一种治疗(诸如施用本发明的主要治疗剂)意欲充分破坏肿瘤而另一种治疗(例如施用抗血管发生剂)意欲防止微转移或肿瘤再生长的情况也是有益的。应当注意在手术后一段安全时间施用抗血管发生剂以确保有效的创伤愈合。然后可以在患者的一生中施用抗血管发生剂。也可以预计可不止一次的施用主要治疗剂或该第二独特抗癌剂。主要治疗剂或第二独特抗癌剂可以在不同的日子或星期交替施用；或者先进行一系列的某种药剂的治疗，随后再进行一系列的另一种治疗。在任一种情况下，为了实现肿瘤退化而使用联合疗法的任何情况中，只需要以有效展现抗肿瘤效果的联合量递送两种药剂，而不用管施用的次数。无论是基本上同时施用还是顺序施用，本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体及治疗剂都可与一种或多种化疗剂或药物联合施用。化疗剂可以杀死增殖的肿瘤细^^，增加全面治疗所产生的坏死区。药物由此增强了本发明主要治疗剂的血栓形成作用。大部分癌症化疗剂对于分裂的氧化细胞有选择性。这些药物在组合疗法中是有优势的，因为化疗药物作用于与本发明主要治疗剂不同的乾目标上，产生更全面的抗血管或抗肿瘤效果。例如，化疗剂选择性的对胂瘤外围快速分裂的氧化肿瘤细胞具有活性，而本发明的药剂主要作用于"受压，，肿瘤核心中的血管或肿瘤细胞，其中富含活化的反应性氧形式。对肿瘤外围的充分氧化的新生血管具有选择性的抗血管发生药物也可被有效的联合使用，因为本发明的药剂作用于肿瘤核心中相对含氧量低的静息血管。通过诱导肿瘤血管中血栓的形成，本发明的主要治疗剂还可通过在肿瘤内保持或截留药物而增强化疗药物的作用。化疗剂由此被保持在肿瘤内，而药物的其他部分则从肿瘤中清除掉。肿瘤细胞因此在更高浓度的药物中暴露了更长的时间。药物在肿瘤内的这种截留使得有可能减少药物的剂量，使治疗更安全有效。在本发明中可组合使用的其他药物是作用于因主要治疗剂而对所说药物"致敏，，的细胞上的药物，从而减少了达到其抗肿瘤效果所需的第二药物的剂量。例如，这可以在这样的情况下发生，即，第二药物的主要组分作用于肿瘤血管中，且本发明的药剂使细胞对该药物敏感。在本发明的主要治疗剂直接地或者通过刺激细胞因子的释放而使肿瘤细胞对第二药物敏感的情况下也是如此。用于组合疗法的其他适当的第二抗癌剂是进一步增强宿主效应细胞活性的药剂，如通过选择性的抑制免疫系统中免疫抑制组分的活性而起作用的那些。所说的药剂使本发明的主要治疗剂更具有攻击性，作为其治疗机制的一部分它刺激了效应细胞的进攻。这样的药剂的例子是多西他赛。尽管进行本发明不需要了解主要治疗剂的确切作用机制，有关这些机制的资料和合理推论可用于选择联合用于本发明的具体第二抗癌剂。所选组合疗法的效力继而支持了原始资料和推测的作用机制，还确定了进行组合疗法的第二抗癌剂的优选范围。诱导凋亡的药物优选用于组合疗法中。例如，多西他赛通过与微管结合并破坏细胞的有丝分裂而诱发了凋亡以及因此而造成的PS暴露(Hotchkiss等人，2002)。正如体外3G4抗体的强结合所证实的，用亚临床浓度的多西他赛处理内皮细胞(排列于肿瘤血管内)和肿瘤细胞在此显示出诱导了PS在细胞表面的表达。正如增加的抗体介导吞噬作用所显示的，本发明的发明者还确定了本发明的抗肿瘤作用包括Fc结构域介导的免疫效应物功能的增大。因此，其他的Fc结构域介导的功能将会发生，例如ADCC、CDC、刺激细胞因子的产生以及这样的机制组合。这还涉及多西他赛，因为其他的研究已显示出用多西他赛治疗乳癌患者导致血清中IFN-Y、IL-2、IL-6和GM-CSF细胞因子水平的增高，通过提高天然杀手细胞(NK)和淋巴反应(Tsavaris等人，2002)。因此，本发明的发明者推断多西他赛诱导了PS表达和所施用的构建体、受体-抗体或p-抗体的结合，还增强了免疫效应物的活性，后者介导了抗肿瘤作用。基于前述考虑，本发明的发明者还证实了在带同位MDA-MB-435人乳癌异种移植物的小鼠中将3G4抗体与多西他赛结合使用明显优越于单独使用多西他赛或3G4(实施例XX)。因此，多西他赛和诱导凋亡的其他化疗剂是优选用于本发明联合疗法中的药剂。将构建体、受体-抗体或P-抗体与诸如多西他赛等的诱导凋亡的化疗药物组合将协同攻击肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞组分，不仅产生了显著增强的治疗效果还降低了毒性。这些组合预计可用于乳癌治疗中，尤其是将利用多西他赛的有规律化学疗法与本发明抗体的组合。M2.内毒素内毒素和已解毒的内毒素衍生物可用于组合治疗中，优选低剂量(PCT公开号WO03/028840，特别引入本文作为参考)。有各种已解毒的内毒素可供利用，它们优选用于动物尤其是人中。已解毒并精制的内毒素及其组合参阅美国专利4，866，034、4，435，386、4,505,899、4,436，727、4,436，728、4,505,900，各特别引入本文作为参考。非毒性衍生物单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA，MPL)是可用于本发明的解毒内毒素的一个例子。已知MPL对人是安全的，使用MPL作为佐剂的临床试验显示100pg/m卩对于人体应用是安全的，对于门诊患者也是如此。M3.细胞因子已经证明细胞因子疗法是联合治疗方案的有效配对方法。多种细胞因子可用于这些联合疗法。细胞因子的范例包括IL-la、IL-lp、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-13、TGF-P、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFa、TNFP、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-a、IFN-P、IFN-y。#>据与诸如患者状况和细胞因子相对毒性等的临床指征一致的标准方案施用细胞因子。子宫珠蛋白也可用于防止或抑制转移(美国专利5，696，092，引入本文作为参考)。M4.TNFoc和TNFoc的i秀导物TNFa和TNFot的诱导物还可与本发明组合使用。TNFa增加了血管的通透性，并因此可用于促进抗癌剂渗透入肿瘤。正如本发明中所述，尽管当乾向于PS和阴离子磷脂时，定位决非问题，但TNFcc的联合使用促进了其他化疗剂和免疫缀合物到达肿瘤，并甚至增加了本发明抗体与远距离肿瘤细胞的结合。还可使用低水平的内毒素、Racl拮抗物，例如减毒的或基因工程化的腺病毒、DMXAA(和FAA)、CM101和沙利度胺。Racl拮抗物还可用于本发明的组合疗法中，因为每个细胞中约5000个DM颗粒引起不依赖于CD14的TNF上调(Sanlioglu等人，2001)。CMIOI、沙利度胺和DMXAA还可以标准和减少的剂量用于此处的联合疗法中。M5.化疗无论机制为何，多种化疗剂可用于本文公开的联合治疗方法中。预计可组合应用的化疗剂包括如他莫西芬、红豆杉醇、长春碱、依托泊普(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、考布他汀，尤其是多西他赛(泰索帝)、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、多柔比星、氨甲蝶呤、紫杉醇和长春新碱，以及它们的衍生物和药物前体。本领域普通技术人员可以理解，化疗剂的适当剂量包括化疗剂单独施用或与其他化疗剂联合施用的临床疗法中已采用的剂量。不过，由于本发明提供的优越之处，现在有可能使用较低的剂量。例如，可以使用诸如顺铂等的药剂和其他DNA烷基化剂。顺铂^皮广泛用于治疗癌症，其临床应用的有效剂量为每3周5天给药20rag/m2，共3个疗程。顺铂不能口服吸收，因此必须经静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射。其他有用的药剂包括干扰DNA复制、有丝分裂、染色体分离和/或微管蛋白活性的化合物。这些化疗化合物包括阿霉素(也称为多柔比星)、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素、考布他汀等。在广泛用于治疗胂瘤的临床环境中，对于阿霉素而言，以25-75mg/i^的剂量范围，每隔21天通过大剂量静脉内注射给药；对于依托泊苷而言，以35-50mg/m2的剂量静脉内给药或以双倍于静脉内剂量的剂量口服。也可以使用破坏多核苷酸前体的合成和精确性的药剂。特别有用的是已经过深入检验并容易获得的药剂。例如，致瘤性组织优先使用诸如5-氟尿嘧啶(5FU)等药剂，使得此药剂对靶向致瘤性细胞特别有用。尽管5-FU毒性很大，但它可用于宽范围的载体，包括局部使用，然而，常用剂量范围是3-15mg/kg/天的静脉内施用。表D列出了在联合疗法中可应用的例示性化疗剂，其中所列的各种药剂仅作为例示而非限制。熟练技术人员可参照《雷明顿制药科学》，第15版，第33章，特别是第624-6W页。根据治疗对象的病情必需对剂量作一些改变。负责治疗的医师能够为各个受试者确定适当剂量。表D.用于致瘤性疾病的化疗剂<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>表D-续<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表D-续<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表D-续<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>M6.抗血管发生术语"血管发生"指新血管的产生，通常是进入组织或器官中。在正常生理学条件下，人或动物只在非常特殊的有限情况中才经历血管发生。例如，通常在创伤愈合、胎儿和胚胎发育、卵巢黄体、子宫内膜和胎盘形成中观察到血管发生。不过，新的证据显示血管发生在某些正常状况下是重要的，例如肾上腺組织、前列腺和卵巢中。本发明的治疗剂，其中抗血管发生不是唯一的作用模式，因此具有比著名的抗血管发生治疗剂(例如抗体A4.6.1)(Berra，1998;Baca等人，1997;Presta等人，1997)更优越之处在于使用本发明时其中的合乎需要的或"生理学，，的血管发生将不会被抑制。不受控制的(持续的和/或不受调控的)血管发生与多种疾病状态有关，并在肿瘤发展和转移过程中发生。受到控制和不受控制的血管发生被认为是以相似方式进行的。由基底膜包围的内皮细胞和外膜细胞形成毛细血管。血管发生从由内皮细胞和白细胞释放的酶对基底膜的侵蚀开始。然后沿血管腔排列的内皮细胞凸出基底膜。血管发生刺激物诱导内皮细胞迁移出受侵蚀的基底膜。迁移细胞在亲本血管外形成"萌芽，，，内皮细胞在此经历有丝分裂和增殖。内皮萌芽彼此汇合形成毛细血管环，从而形成新的血管。尽管有新的证据显示在某些正常组织中需要有血管生成，抗血管发生疗法在肿瘤和其他疾病的治疗中仍然是重要的。抗血管发生疗法因此意图用于本发明的组合疗法中。尤其考虑将相对频繁的低剂量本发明治疗剂与抑制血管发生的药剂组合。可用于组合疗法中的示例性抗血管发生剂如上文所列举的(针对免疫缀合物)。任何一种或多种这样的药剂，包括表B中的药剂，可与本发明联合使用。血管生长抑素、抑内皮素、抑血管素、制霉菌素和乳腺丝抑蛋白是目前优选的。许多已知的抗癌剂也具有抗血管发生效果作为其作用机制的一部分。这些药剂，如表E中所列举的，特别考虑用于本发明的组合疗法方面(如上所述，它们也可以与本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体缀合)。表E具有抗血管发生活性的抗癌剂<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>此外，针对(XvP3整联蛋白的抗体LM609也"^秀导肺瘤退化并可用组合疗法中。整联蛋白cuP3的拮抗剂，例如LM609,诱导血管发生性内皮细胞的凋亡，而对静止血管没有影响。LM609或其他otv^拮抗剂还可以通过抑制avP3与固P-2的相互作用来发挥作用(MMP-2被认为是在内皮细胞和成纤维细胞迁移中具有重要作用的蛋白水解酶)。LM609引起的血管发生性内皮的凋亡可能对剩余血管网络具有级联效果。抑制肿瘤血管网络对肺瘤扩张信号产生完全应答，事实上可能启动了网络的部分或全部崩溃，导致肿瘤细胞死亡和肿瘤体积损失。可能抑内皮素和血管生长抑素以相似方式发挥功能。LM609不影响静止血管但能够引起肿瘤退化的事实强烈说明在治疗中不需要靶向肿瘤中的所有血管来获得抗肿瘤效果。如美国专利5，520，914(特别引入本文作为参考)所述，可以采用针对血管生成素的抗体。由于FGF与血管发生有关，因此也可以使用FGF抑制剂。范例是序列中以交替的N-乙酰葡糖胺与2-^疏酸化糖醛酸作为主要重复单元的化合物，包括葡糖胺基聚糖，例如archaransulfate。美国专利6,028，061(特别引入本文作为参考)描迷了这些化合物，它们可用于与本文的联合。M7.VEGF抑制剂VEGF是低氧和致癌突变诱导的多功能性细胞因子。VEGF是胚胎发生中血管网络产生和保持的主要刺激物。它起着强通透性诱导剂、内皮细胞趋化剂、内皮存活因子和内皮细胞增殖因子的功能。它的活性是正常胚胎发育所需要的，因为一个或两个VEGF等位基因的靶向破坏会导致胚胎致死。利用一种或多种VEGF抑制方法是本发明组合疗法的优选方面。由有关VEGF是病理状况下血管发生的主要刺激物的认识产生了阻断VEGF活性的各种方法。所开发的任何VEGF抑制剂现在可有利的应用于此。因此，设计成干扰VEGF信号传导的任何一种或多种以下的中和性抗VEGF抗体、可溶性受体构建体、反义策略、RNAaptamers和酪氨酸激酶抑制剂都可应用。合适的药剂包括中和性抗体(Kim等人，1992;Presta等人,1997;Sioussat等人，1993;Kondo等人，1993;Asano等人，1995)、可溶性受体构建体(Kendall和Thomas,1993;Aiello等人，1995;Lin等人，1998;Millauer等人，1996)、酪氨酸激酶抑制剂(Siemeister等人，1998)、反义策略、RNAaptamer和针对VEGF或VEGF受体的核酶(Saleh等人，1996;Cheng等人，1996;Ke等人，1998;Parry等人，1999;引入本文作为参考)。正如WO98/16551(特别引入本文作为参考)所述，还可以采用具有拮抗剂特性的VEGF变体。上述各文献均特别引入作为参考。某些实施方案中将优选阻断抗VEGF抗体，尤其是为了简单起见。抗VEGF的单克隆抗体已显示出抑制小鼠中人肺瘤异种移植物的生长和腹水形成(Kim等人，1993;Mesiano等人，1998;Luo等人，1998a;1998b;Borgstrom等人，1996;1998;分别引入本文作为参考)。抗体A4.6.1是高亲和力的抗VEGF抗体，能够阻断VEGF与VEGFR1和VEGFR2二者的结合(nm等人，1992;Wiesmann等人，1997;Muller等人，1998;Key等，1996，分别引入本文作为参考)。A4.6.l最近已通过单价噬菌体展示技术进行了人源化，目前作为抗癌剂正在进行I期临床试验(Brem，1998;Baca等人，1997;Presta等人，1997;引入本文作为参考)。对A4.6.1Fab片段结合的VEGF的丙氨酸扫描诱变和X射线结晶学显示，A4.6.l结合的VEGF表位集中于第89-94位氨基酸周围。这一结构性结果证明A4.6.1竟争性抑制VEGF结合VEGFR2，但是最有可能通过位阻现象抑制VEGF结合VEGFR1(Muller等人，1998;Keyt等人，1996;引入本文作为参考)。A4.6.l可与本发明联合使用。不过，目前优选被命名为2C3(4545)的新抗体，它选择性的阻断VEGF与两个VEGF受体中只一个的相互作用。2C3抑制VEGF介导的内皮细胞生长，它具有强的抗肿瘤活性并选择性的阻断VEGF与VEGFR2(KDR/Flk-l)的相互作用，而不阻断VEGF与VEGFR1(FLT-1)的相互作用。与A4.6.l相反，2C3可以特异抑制VEGFR2诱导的血管发生，但不伴随着对巨噬细胞趋化性的抑制(由VEGFR1介导)，因此预计可以作为更安全的治疗剂。为了更进一步描述2C3抗体和其在抗血管发生疗法和VEGF抑制中的用途，将美国专利6，342，219、6,342，221、6，416，758和6，416，758特别引入本文作为参考。M8.凋亡i秀导剂本发明的治疗剂还优选与可诱导肿瘤中任何细胞内诱导(包括肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞)的凋亡的治疗方法相组合。诱导凋亡的典型药剂列举如上(针对免疫缀合物)。任何一种或多种这样的凋亡诱导剂都可以用于本发明的联合疗法中，无需与本发明抗体连接。许多已知的抗癌剂作为其作用机制的一部分还具有诱导凋亡的作用。这些药剂，如表F中列举的，尤其被考虑用于本发明的组合疗法方面(如上所述，它们还可与本发明的抗体缀合)。表F<table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>本发明还可与其他的免疫毒素或凝血配体联合使用，其中靶向部分耙向于肿瘤细胞、肿瘤血管或胂瘤基质的标志物。用于靶向至肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤基质的任何靶向剂都可用于这些实施方案中。在这些免疫毒素中，所附着的药剂包括抗细胞或细胞毒性剂、细胞因子、放疗剂、抗血管发生剂、凋亡诱导剂和抗微管蛋白药物。在凝血配体中，所附着的药剂是凝血剂。美国专利5，855，866、5，965，132、6,261,535、6,051,230、6,451,312(免疫毒素)、6,093,399、6，004，555、5，877，289和6，036，955(凝血配体)特别引入本文作为参考来说明这些构建体。M10.ADEPT和药物前体疗法本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体还可以与药物前体联合应用，其中所迷构建体、受体-抗体或抗体可操作地联接激活药物前体的成分，例如激活药物前体的酶，它只有在接触抗体时才将药物前体转变成更有活性的形式。这项技术通常称为"ADEPT"，并描述于如W095/13095、WO97/26918、WO97/24143、美国专利4，975，278和5,658,568(特别引入本文作为参考)。如本文所用，术语"药物前体"指生物学或制药学活性物质的前体或衍生物形式，与作为基础的亲本药物相比，它对靶细胞(包括肿瘤血管内皮细胞)的细胞毒性或抗细胞的效果下降。优选的是，药物前体或前体形式与"天然"或亲本形式相比细胞毒性或抗细胞的效果显著降低，或者更优选可以忽略。"药物前体"能够被激活或转变成更有活性的药物亲本形式。用于制备并使用药物前体的技术属于普通技术人员的技术范围之内。Willman等人(1986)和Stella等人(1985)在特别引入本文作为参考，以补充关于如何制备并使用各种药物前体的描述和教导。可用于本发明的药物前体构建体的范例包括(但不限于)含磷酸的药物前体(美国专利4，975，278)、含硫代磷酸的药物前体、含硫酸的药物前体、基于肽的药物前体(美国专利5，660，829、5,587,161、5,405,990、W097/07118)、D-氨基酸修饰的药物前体、糖基化的药物前体(美国专利5，561,H9、5,646,298、4,904,768、5,041,424)、含P—内酰胺的药物前体、任选含取代的苯氧基乙酰胺的药物前体(美国专利4,975，278)、任选含取代的苯乙酰胺的药物前体、甚至5-氟胞嘧咬(美国专利4，975，278)和5-氟尿嘧啶药物前体等等(每一项专利特别引入本文作为参考)。可以以药物前体形式使用的治疗剂或细胞毒性药物的类型事实上是不计其数的。优选以这种形式递送的细胞毒性剂比例如凝血剂多，凝血剂较不优选以药物前体的形式使用。在制备药物前体中需要的只是对构建体进行设计，使得药物前体基本上无活性，而"释放的"或激活的药物具有显著活性或者至少足以达到预定目的的活性。正如W095/03830、EP751，144(蒽环霉素类)、W097/07097(环丙基吲咮类(cyclopropylindoles))和W096/20169中乂〉开的，还知道对原始药物前体的多种改进，本文也涵盖其使用。例如，美国专利5，621,002(特别引入本文作为参考)中描述了Km降低的药物前体，可用于本发明中。正如WO96/03151(特别引入本文作为参考)所例示的，还知道在细胞内进行的药物前体疗法，本文可以进行实践。为了用于ADEPT，将激活或转变药物前体形成更有活性药物的药剂可操作附着于本发明的抗体上。所述的抗体由此将药物前体转变能力定位于血管发生性或肿瘤位点，从而只在这些区域产生有活性的药物，而在循环或健康组织中却不会。可附着于本发明的抗体从而发挥激活药物前体功能的酶包括(但不限于)与含磷酸的药物前体联合使用的碱性磷酸酶(美国专利4,975,278);与含硫酸的药物前体联合使用的芳基硫酸酶(美国专利5,270,196);与基于肽的药物前体联合使用的肽酶和蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶(美国专利5,660,829、5,587,161、5，405，990)和组织蛋白酶(包括组织蛋白酶B和L)、与D-氨基酸修饰的药物前体联合使用的D-丙氨酰羧肽酶；与糖基化的药物前体联合使用的碳水化合物切割酶，例如P-半乳糖苷酶和神经氨酸酶(美国专利5，561，119和5，646，298);与含P-内酰胺的药物前体联合使用的p-内酰胺酶；与在氨基氮处用苯氧基乙酰胺或苯基乙酰胺基团衍生的药物联合使用的青霉素酰胺酶，例如青霉素v酰胺酶(美国专利4，975，278)或青霉素G酰胺酶；和与基于5-氟胞嘧啶的药物前体(美国专利4，975，278)联合使用的胞嘧啶脱氨酶(美国专利5，338，678和5，545，548)(每一项专利特别引入本文作为参考)。N.抗体包被的脂质体和治疗剂脂质体制剂经常用于治疗剂和药物中。不过，有关脂质体分布的最初研究表明这样的制剂并非可广泛用于人体的。脂质体被网状内皮系统(RES)的吞噬细胞(包括循环性单核吞噬细胞和定位在肝和脾中的那些细胞)快速纟聂入。因此，血液循环半衰期可以短至几分钟。因此开发了"隐藏的或被隐藏的"脂质体和制剂技术，它可以使月旨质体逃避被RES摄取并循环较长的时间(Hristova和Needham，1993)。优选用于隐藏脂质体的药剂是聚乙二醇(PEG)，而产生的脂质体也被称为PEG化脂质体。其他隐藏剂(stealthingagents)包括聚(2-甲基-2-嗜,唑啉)和聚(2-乙基-2-噁唑啉)缀合物(Woodle等人，1994)。一系列改进的被隐藏的脂质体描述于美国专利6，284，267(特别地引入本文作为参考)中，它们可与本发明联合使用。直径比毛细血管中的窗孔平均直径小的脂质体从循环中泄漏出。在快速生长的肿瘤中的窗孔平均直径比在正常组织中大，因而直径小于大约IOOmn的脂质体迁移入肿瘤中。因此，隐藏的脂质体已被推荐用于递送细胞毒性剂至癌症患者的肿瘤中。一系列的药物已被掺入到隐藏的脂质体中，包括顺铂(Rosenthal等人，2002)、TNFa(Kim等人，2002)、多柔比星(Symon等人，1999)和阿霉素(Singh等人，1999)，分别引入本文作为参考。不过，最近的报道已显示出隐藏的脂质体柔红霉素和长春瑞滨在转移性乳癌治疗中意外的低效(Riraassa等人，2003)。本发明提供了改良的被隐藏的脂质体制剂，克服了现有技术中的各种缺点，其中用本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体功能性地联接或"包被，，隐藏的脂质体。在本发明的这些方面中无需二价构建体。任何隐藏的脂质体都可构成新脂质体制剂的主要成分，优选应用PEG化的脂质体。隐藏的脂质体是被"包被"的，即可操作地或功能性地联接了构建体、受体-抗体或p-抗体。该可操作的或功能性的联接形式能使构建体、受体-抗体或P-抗体保持特异性结合靶PS或阴离子磷脂的能力，从而将隐藏的脂质体和其中的任何组分递送或靶向至PS-阳性细胞，例如肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞。经包被的隐藏脂质体可以单独使用。不过，优选的，这样的脂质体还将包括一种或多种第二治疗剂，例如抗癌剂或化疗剂(第一治疗剂是抗体本身)。第二治疗剂通常被认为在脂质体的"核心"内。本领域已知和/或本文针对缀合或针对组合疗法所述的任意一种或多种第二抗癌剂或化疗剂都可针对用于本发明的经抗体包被的隐藏脂质体中。例如，任何化疗剂或放疗剂、细胞因子、抗血管发生剂或凋亡诱导剂。目前优选的化疗剂是抗微管蛋白药物、多西他赛和紫杉醇。此外，本发明的抗体包被隐藏脂质体还可装载一种或多种抗病毒药物以用于治疗病毒感染和疾病。正如抗癌剂一样，本领域和/或本文针对缀合抗体或组合疗法所述的任一种或多种第二抗病毒药物都可用于本发明的抗体包被隐藏脂质体中。西多福韦和AZT是目前优选的例子。0.抗血管、抗血管发生和其他疗法本发明可用于治疗涉及异常血管发生的其他疾病，包括具有前血栓形成性血管的疾病和紊乱。尽管并非唯一的治疗方法，但本发明的构建体、受体-抗体或p-抗体也可用于治疗患异常血管发生、例如促成多种疾病和紊乱的异常血管发生的动物和患者。无论是基于抗血管发生、前血栓形成性血管系统还是其他的抗血管机制，本发明都可用于治疗除了癌症之外的最普遍和/或在临床上重要的疾病，包括关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变、与年龄有关的黄斑变性、格雷夫氏病、血管再狭窄(包括血管成形术后再狭窄)、动静脉畸形(AVM)、脑(脊)膜瘤、血管瘤和新血管性青光眼。其他的干预乾包括血管纤维瘤、动脉粥样硬化病斑、角膜移植物新血管形成、血友病性关节、肥大性瘢痕、Osier-Weber综合症、脓性肉芽肺、晶状体后纤维增生症、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、各种其他炎症性疾病和紊乱和甚至是子宫内膜异位症。下文列出了本发明可以治疗的其他疾病和紊乱，以及这些血管发生性疾病的统一基础。涉及异常血管和血管发生的一种重要疾病是类风湿性关节炎，其中关节滑膜内层的血管经历血管发生。除了形成新血管网络，内皮细胞还释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧类。血管发生中涉及的因子可以积极促成并维持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。与血管发生有关的因子在骨关节炎中也有作用，促成关节的破坏。包括机理。涉及异常血管系统和血管发生的另一重要疾病范例是眼部新血管性疾病。该疾病的特征为新血管侵入眼结构，例如视网膜或角膜。这是失明的最常见原因，并涉及大约20种眼科疾病。在与年龄有关的黄斑变性中，相关视觉问题是由脉络膜毛细血管经Bruch氏膜(玻璃膜)的缺陷向内生长，同时视网膜色素上皮下的纤维血管组织增殖引起的。血管发生性损伤还涉及糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶状体后纤维组织形成。可按本发明进行治疗的与角膜新血管形成有关的其他疾病包括(但不限于)流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、隐形眼镜过度佩戴、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、Sjogren症(干燥症)、玫瑰痤齊(酒糟鼻)、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、脂肪变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱渗感染、原生动物感染、Kaposi氏肉瘤、Mooren溃疡、Terrien氏边缘变性、边缘角质层分离、类风湿性关节炎、系统狼疮、多动脉炎、夕卜伤、Wegeners类肉瘤、巩膜炎、Steven'sJohnson病、角膜放射状切开术和角膜移植排斥。可按本发明进行治疗的与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括(但不限于)糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰刀形红细胞贫血病、结节病、梅毒、弹性假黄色瘤、Pagets病、静脉堵塞、动脉堵塞、颈动脉梗阻性疾病、慢性色素层炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、Lyme氏病、系统性红斑狼痴、早产儿视网膜病变、Eales病、Bechets病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、推测的眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、视窝、Stargarts病、平坦部炎、慢性视网膜脱落、高粘滞性综合症、弓形体病、外伤和激光后并发症。可按本发明进行治疗的其他疾病包括(但不限于)与发红有关的疾病(虹膜角的新血管形成)和由纤维血管或纤维组织异常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变，无论其是否与糖尿病相关。慢性炎症也涉及异常血管系统和病理性血管发生。这些疾病状态(如溃疡性结肠炎和Crohn氏病)显示组织学变化，其中有新血管进入发炎组织的向内生长。巴尔通体病(在南美洲发现的细菌性感染)能够导致特征为血管内皮细胞增殖的慢性阶段。在动脉粥样硬化中发现了与异常血管系统和血管发生有关的另一种病理学作用。在血管内腔内形成的病斑显示具有血管发生刺激活性。有具体证据证明了诸如VEGF等的血管发生标志在人冠状动脉粥样硬化发展中，以及在冠脉梗阻性疾病的血管再成形过程中有病理生理学重要性。本发明为这些状况提供了有效治疗。血管瘤是儿童时期最频繁的血管发生性疾病之一。在大多数情况中，肿瘤是良性的，并在没有千预的条件下就退化。在更严重的情况中，肿瘤发展成大型海绵状和渗透性形式并产生临床并发症。血管瘤的系统形式，血管瘤病，具有较高的死亡率。存在耐受治疗的血管瘤，不能用目前使用的治疗剂进行治疗，本发明则特别针对解决该问题。血管发生还与在遗传性疾病(例如Osler-Weber-Rendu病或遗传性出血性毛细管扩张症)中发现的损伤有关。遗传性出血性毛细管扩张是特征为多处小型血管瘤、血管或淋巴管肿瘤的遗传病。血管瘤存在于皮肤和粘膜中，常常伴随鼻出血或胃肠出血，有时伴随肺或肝动静脉瘘管。血管发生还与正常的生理学过程有关，例如再生和创伤愈合。血管发生是排卵还有受精后嚢胚着床中的重要步骤。根据本发明预防血管发生可用于诱导闭经，阻断排卵或防止嚢胚着床。在创伤愈合中，过度修复或纤维增生成为手术治疗的有害副作用，而且可能由血管发生引起并恶化。粘附是手术后频繁的并发症，并导致诸如小型肠梗阻等问题。这也可以用本发明进行治疗。所有前述疾病和病症，以及所有类型的肿瘤，都被考虑按照本发明进行治疗。美国专利5，712，291特别引入本文作为参考，以便进一步证明本领域内的认识，即，一旦使用某一具体药剂已显示出对血管发生的抑制作用，那么用它或类似药剂治疗与异常血管发生相关的广泛类型疾病就应该能进行。美国专利6，524，583也特别引入本文作为参考以达到相似的目的，并特别证明此原理适用于利用所靶向的治疗剂抑制血管发生和治疗血管发生性疾病。本发明进一步提供了用于治疗PS或阴离子磷脂在其中起作用的其他疾病。例如，因为细胞粘附、炎性反应和脓毒性休克中涉及PS，所以构建体、受体-抗体或P-抗体可用于治疗发炎和脓毒性休克。阴离子磷脂，尤其是PS，还与镰状细胞贫血有关，具体而言，是作为清除过程的一部分。因此，构建体、受体-抗体或P-抗体可用于治疗或改善镰状细胞贫血。本发明的构建体、受体-抗体或P-抗体还可以用于治疗寄生虫病和治疗疟疾。P.抗病毒治疗方法本发明还提供了一系列构建体(其任选与抗病毒剂缀合)，可用于治疗病毒感染。用药方式、尤其是剂量通常与上文关于本发明癌症治疗所述的一样，适应性是本发明整体的一个优势。尽管实施本发明的抗病毒治疗不需要理解其作用的特殊机制，根据本文中工作实施例所支持的，有关病毒疗法的某些原理如下。最重要的机制被认为是与病毒复制和宿主细胞的活化有关。在病毒感染期间，病毒在其细胞内复制过程期间激活细胞。正如对疱渗病毒、丙肝病毒和HIV-l的研究所显示的，此细胞活化过程是病毒复制所必需的。病毒的发展激活了病毒和宿主二者的基因表达。例如，皮钦德病毒(Pichindevirus)和马丘坡病毒(Machupovirus)的复制在复制周期的晚期被放线菌素D所抑制，表明宿主细胞基因转录是完成病毒复制所必需的。病毒对宿主细胞的活化引起细胞使阴离子磷脂例如PS外在化。具体地说，发明者推测，病毒活化引起Ca"流入细胞，激活了爬行酶(scramblase)，使阴离子磷脂(尤其是PS)外在化。然后，可结合阴离子磷脂(优选PS)的构建体和缀合物结合并干扰活化过程，使病毒不能够正确复制。本发明的实施例显示本发明在病毒感染过程的晚期发挥作用，阻断了病毒成熟或溢出。发明者的研究显示本发明药剂的抑制作用是广泛可用的，因为已显示对利用不同溢出机制的病毒均可起作用。例如，本发明的实施例证实阻断了疱疹病毒(CMV)(它从高尔基体衍生的胞外嚢泡中释放出来)，还阻断了沙粒病毒(皮钦德病毒)和副粘病毒(RSV)直接从原生质膜中出芽)。受病毒感染的细胞使阴离子磷脂(尤其是PS)外在化，正常情况下这些磷脂是细胞内的，即局限于原生质膜的内表面。在病毒释放期间，磷脂在释放的部位重新分布，在病毒出芽或从质膜进行胞吐的期间接纳膜弯曲，在此过程中阴离子磷脂和氨基磷脂被外在化。本发明的构建体和缀合物因此与外在化的阴离子磷脂(尤其是PS)结合，并阻止了病毒从被感染细胞中的释;^文。本发明构建体与受病毒感染的细胞的结合在本发明的实施例中也有显示。本发明的构建体和缀合物可进一步结合外在化的阴离子磷脂(尤其是PS)并干扰病毒基因表达和/或复制所必需的一种或多种信号传导途径。此外，有包膜的病毒粒子本身在其外表面很可能有阴离子磷脂例146如PS。由于病毒缺乏转位酶来保持或恢复磷脂的不对称性，所以预期存在磷脂例如PS的持续暴露。本发明的构建体和缀合物因此可引起调理作用、补体的结合、诸如巨噬细胞等宿主细胞的内吞作用以及自由病毒颗粒的清除。在本发明的另一方面，病毒很可能需要阴离子磷脂用于感染和/或合胞体(syncitia)形成。本发明的构建体和缀合物可通过结合阴离子磷脂而进一步阻断病毒生命周期的这些方面。依照前述观察结果并根据本发明的实施例，本发明病毒疗法的范围可以扩展到任何病毒，可以是包膜或没有包膜的，DNA或RM。由于本发明的结合阴离子磷脂的构建体和缀合物至少在部分程度上阻断了病毒在细胞内的复制并/或阻止了病毒从细胞中释放，因此本发明并不只限于治疗有包膜的病毒，也不限于任何具体的病毒，这是一个重要的有利之处。例如，本发明随后发表的工作报道了膜联蛋白V和PS嚢泡能抑制巨噬细胞的HIV-1感染，但不能抑制T细胞的HIV-1感染或抑制其他病毒，例如水泡性口炎病毒G和兼嗜性小鼠白血病病毒(Callahan等人，2003)。自然地，本发明的构建体和缀合物确实作用于有包膜的病毒，尤其是在包膜外表面有阴离子磷脂(尤其是PS)的那些病毒，其中所述构建体和缀合物使病毒被清除并/或抑制了病毒进入靶细胞。因此本发明的重要方面是它可普遍应用，适于治疗重组、基因工程化和合成的病毒，如作为生物恐怖主义而发展的病毒。事实上，本发明并不限于治疗动物和人。由于在病毒分类群中发现的宿主类型包括藻类、古生菌(archaea)、细菌、真菌、无脊推动物、支原体、植物、原生动物、螺旋质体和脊推动物，本发明可用于抑制在任何这样类型宿主中的病毒感染和复制，包括农业上重要的病毒。目前优选脊推动物中病毒感染和相关疾病的治疗，而表H中感染脊推动物的任一种或多种病毒都可用本发明的制剂进行抑制并治疗所产生的感染。表H脊稚动物的病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>优选将本发明用于治疗哺乳动物中的病毒感染和相关疾病，尤其是有价值的或赋予价值的动物(例如赛马和家养宠物)和用于直接产生(如肉类)或间接产生(如牛奶和蛋)食物供人类消耗的动物和鸟类。除了对人的治疗外，本发明示范性的实施方案包括治疗马、狗、猫等等；治疗牛、猪、野猪、绵羊、山羊、水牛、野牛、骆驼、鹿、麋鹿和其他大型动物，以及它们的幼崽，包括牛犊和羔羊。尤其优选对人的治疗，无论是针对天然产生的病毒或由于生物恐怖主义产生的病毒。对于天然存在的病毒和所引起的疾病来说，本发明在其应用中是不受约束的。因此，表J中的任一种或多种病毒都可用本发明进行抑制，并由此治疗所产生的感染和疾病。表J人体中的病毒疾病<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>本发明尤其预计可用于治疗CMV相关疾病，例如病毒性肺炎、单核细胞增多症类综合症和相关的先天畸形(耳聋和精神发育迟緩)；呼吸道疾病，例如RSV引起的疾病，包括细支气管炎和病毒性肺炎、流行性感冒、普通的感冒和SARS;AIDS;肝炎；与病毒感染相关的癌症；单核细胞增多症；和天花。在其他实施方案中，发明者尤其考虑对在人体中有致病性的沙粒病毒进行抑制。沙粒病毒包括造成拉沙热(拉沙病毒)和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCMV)的老世界病毒(OldWorldviruses)。拉沙热是西非的地方流行病，每年感染多达300，000人并引起高达3000人死亡。拉沙热的感染在约10天内导致发热和不适。腹痛、恶心、呕吐和腹泻是常见的。可能发生咽炎和咳嗽。神经上的症状经常是轻微的。诸如浮肿和胸腔积液等的血管渗漏综合症在更严重的病例中存在。在约四分之一的患者中可见到出血。此疾病可在心血管系统中引起改变并最终导致休克和死亡。沙粒病毒还包括造成大腹菌出血热(胡宁病毒)、波利维亚出血热(马丘坡病毒)和委内瑞拉出血热(瓜纳瑞托病毒)的抗原独特型新世界病毒(NewWorldviruses)。所有这些病毒均在可能的生物恐怖主义武器的A类型CDC名单上。适用于抗肿瘤实施方案的剂量还适于抗病毒治疗。类似地，多重施用可用于慢性感染，高剂量可用于急性感染。任何适当的施用途径都可应用，如同针对癌症治疗方面所公布的，包括IV、IM、SC，针对肺或气道的气雾剂等等。本发明所提供的治疗剂是具有广谱抗病毒活性的有用药剂。除了对多种潜在的致命病毒有效外，还可以在暴露于病毒后施用所说的药剂，甚至在病毒的确切特性未知的情况下也可应用。因此，本发明的抗病毒疗法不要求病原体鉴别和进行治疗给药之间的很长时间，与特异性疫苗的开发、生产或递送所需的时间和费用形成了鲜明的对照。提供下列实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员在本发明实践中良好运用，由此视为构成了其实践的优选方法。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当认识到，无需偏离本发明的精神和范围即可在公开的具体实施方案中进行许多变化而仍获得相同或相似的结果。本实施例显示了在将靶向肿瘤血管系统的凝血剂("凝血配体，，)施用于患肿瘤的动物后造成的体内肿瘤血管系统的特异凝血以及由此产生的抗肿瘤效果。在此凝血配体中，针对VCAM-1(血管内皮粘附分子-1，VCAM-1)的抗体被用作靶向剂而将截短的组织因子(tTF)(—种修饰形式的人凝血剂)递送至肿瘤血管。分泌抗小鼠VCAM-l的大鼠IgGl抗体的MK2.7杂交瘤获自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville，MD;ATCCCRL1909)。分泌抗小鼠病毒蛋白p30gag的大鼠IgGl抗体的R187杂交瘤获自ATCC,并被用作抗VCAM-1抗体的同种型匹配对照。用抗VCAM-l抗体免疫组化检测具有皮下L540人Hodgkin，s肿瘤的小鼠主要器官和肿瘤的血管中VCAM-1的表达。大体上，在作为阳性对照的抗-内皮糖蛋白抗体MJ7/18染色的20-30%总肿瘤血管上观察到VCAM-1的表达。在患肿瘤动物和正常动物的心脏和肺中都发现了VCAM-l的组成型血管表达。在VCAM-l严格表达于血管外的睾丸中观察到强的基质染色。用抗VCAM-1抗体静脉注射带皮下L540肿瘤的小鼠，两小时后，将小鼠放血。切下肿瘤和正常器官，制备冷冻切片并进行免疫组化检测应当认识到，实施例I用抗VCAM-1-tTF凝血配体进行肿瘤治疗以确定抗体的位置。在肿瘤、心脏和肺的内皮上检测到抗VCAM-1抗体。染色是特异的，因为在用无关特异性的物种同种型匹配抗体R187注射的小鼠内肿瘤和器官中观察到无内皮染色。在睾丸和除了心脏和肺之外的任何正常器官中均发现无抗VCAM-1抗体的定位。用已截短的组织因子(tTF)制备抗VCAM-l.tTF缀合物或"凝血配体，，。抗VCAM-l.tTF凝血配体的静脉内施用诱导了患肿瘤小鼠中肿瘤血管的选择性血栓形成，与正常组织中的血管相反。将抗VCAM-l.tTF凝血配体施用于皮下带直径为0.4-0.6cm的L540肿瘤的小鼠。在注射凝血配体前，肿瘤正常，具有无坏死区的均衡的形态。肿瘤是很好的血管化的，完全无自发形成血栓的血管或出血。在凝血配体注射4小时后，40-70%的血管形成血栓，尽管最初只有20-30%的肿瘤血管染色。形成血栓的血管包含堵塞的血小板聚集、压紧的红细胞和纤维蛋白。在许多区域中，血管已破裂，红细胞溢出至肿瘤间质组织中。凝血配体注射后24小时，血管仍然被堵塞，并且广泛的出血已扩散至整个肺瘤。肿瘤细胞已相互分离，具有固缩核并正经历细胞溶解。72小时时，整个肿瘤中都可见明显的高程度坏死。有可能起始的凝血配体诱导的凝血酶沉积作用导致了主要血管上VCAM-1靶抗原的诱导增加，因此扩大了靼向和肿瘤破坏作用。抗VCAM-l.tTF在肿瘤血管上的血栓形成作用是抗原特异性的。同等量施用的对照药剂(只有tTF、只有抗VCAM-1抗体、tTF加抗VCAM-l抗体或无关特异性的对照凝血配体)均不造成血栓形成。除了肿瘤血管的血栓形成外，此研究还显示了抗VCAM-l'tTF凝血配体的静脉内施用不会诱导正常器官中血管的血栓形成。尽管VCAM-1在正常小鼠或患L540肿瘤的小鼠的心脏和肺血管上均表达，在施用抗VCAM-l.tTF凝血配体后不发生血栓形成。在4或24小时前注射了5-45pg凝血配体的25只小鼠中未观察到血栓形成、组织损伤或形态改变的迹象。来自较多肿瘤血栓形成的同一'J、鼠的心脏和肺具有正常组织学外观。所有其他的主要器官(脑、肝、肾、脾、胰腺、肠、睾丸)也具有未改变的形态。当用抗TF抗体，IOHIO，或抗大鼠IgG抗体显色时，来自经凝血配体处理的小鼠的器官和肿瘤冷冻切片显示出一致的染色模式，证实了凝血配体已定位于心脏、肺和肿瘤中的血管。染色强度与凝血配体直接以高浓度施用于切片随后用抗TF或抗大鼠IgG显色的情况下观察到的相等，表明体内已达到结合饱和。这些研究显示，凝血配体与心脏和肺中正常血管系统内VCAM-1的结合不足以诱发血栓形成，且肿瘤血管系统提供了更多的因子来支持凝血。在带有O.3-0.4cm3L540肺瘤的SCID小鼠中测定抗VCAM-l.tTF凝血配体的抗肺瘤活性。间隔4天静脉内注射药物3次。与所有其他组相比，处理后21天时抗VCAM-l.tTF处理小鼠的平均肿瘤体积显著减小(p<0.001)。用特异性凝血配体处理的总共15只小鼠中有9只显示出肿瘤体积有超过50%的降低。此作用是特异的，因为未缀合tTF、对照IgG凝血配体以及游离抗VCAM-l与tTF的混合物不会影响肿瘤的生长。实施例II肿瘤血管上的磷脂酰丝氨酸表达为了解释为何抗VCAM-1'tTF在心脏和肺的VCAM-1阳性血管系统中无血栓形成作用，某些发明者提出了正常血管和肿瘤血管之间存在有差异的氨基磷脂和阴离子磷脂(如PS和PE)定位的设想。具体的说，他们猜测正常组织中的内皮细胞将氨基磷脂和阴离子磷脂(如PS和PE)隔离于质膜磷脂双分子层的内表面，在此PS不能参与血栓形成反应；而肿瘤中的内皮细胞则将氨基磷脂和阴离子磷脂转位至质膜的外表面，在此PS能支持凝血配体的凝血活动。细胞表面的PS表达使凝血得以形成，因为它使凝血因子能附着于膜上并协调凝血起始复合物的装配。如本文所提出的，发明者将氨基磷脂和阴离子磷脂转位至肿瘤血管内皮细胞表面的模型是不寻常的，其中PS的表达不是在细胞死亡之后发生，也不会不可避免地引起细胞死亡。肿瘤内皮细胞表面的氨基磷脂和阴离子磷脂因此足够稳定，能使氨基磷脂和阴离子磚脂(如PS和PE)能用作干预治疗的可靶向实体。为了证实肿瘤血管内皮在质膜内腔表面表达PS的猜测，发明者利用以下的免疫组化研究来确定抗PS抗体在静脉内注射入患L540肺瘤的小鼠体内后的分布。A.方法抗PS和抗心磷脂抗体均为小鼠单克隆IgM抗体，如实施例IV所述由Rote等人(1993，引入本文作为参考)生产和鉴定。3SB的主要反应性是与PS反应，但它也与氨基磷脂磷脂酸(质膜上相对较少的一种组分，它也紧密的被隔离于正常细胞内表面)有反应性。用20jLig抗PS或抗心磷脂小鼠IgM抗体静脉内注射患L540肿瘤的小鼠。IO分钟后，将小鼠麻醉并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。切下肿瘤和正常组织并速冻。用检测抗PS抗体的HRP标记抗小鼠IgM或者用抗VCAM-l抗体并随后加HRP标记的抗大鼠Ig对器官和肿瘤的连续切片染色。为了在冷冻切片上保留膜磷脂，提出了以下方法。用含L5mMCa"的DPBS灌注动物。将组织放置于3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷包被的栽片上并在24小时内染色。在载片的固定或清洗中不使用有机溶剂、甲醛或去污剂。用含2.5mM0&2+和0.2。/。明胶的DPBS将载片再水合。同样的溶液也用于漂洗切片以去除过量的药剂。将切片与HRP标记的抗小鼠IgM室温保温3.5小时以检测抗PSIgM。B.结果管，包括可能缺乏VCAM-1的肿瘤中心区内的血管。对VCAM-1呈阳性的血管对PS也呈阳性。因此，PS在肿瘤内表达VCAM-1的血管上有一致的表达。在体内定位研究中，包括心脏和肺的VCAM-1阳性血管系统在内的正常器官中没有血管被染色，表明内皮细胞外表面没有PS。相反，当用抗PS抗体体外直接对正常组织和肿瘤的切片染色时，在正常的和肿瘤的内皮或其他细胞类型之间没有明显的不同，表明PS存在于这些细胞内，但只在胂瘤内皮细胞表面表达出来。通过两个独立的实验证实了PS检测的特异性。首先，针对不同的带负电磷脂(心磷脂)的小鼠IgM单克隆抗体在体内不归于肿瘤或任何器官。其次，将冷冻切片用丙酮预处理消除了抗PS抗体的染色，据推测可能是因为它将脂质连同结合的抗PS抗体一起萃取掉了。实施例III膜联蛋白V阻断了凝血配体的活性本实施例从利用高亲和力PS结合性配体(膜联蛋白V)在体外和体内阻断PS功能的有关研究中提供了进一步的证据证明表面PS表达在凝血配体活性中的作用。A.膜联蛋白V在体外阻断了因子X的凝血配体活化作用用呈色试验测定膜联蛋白V影响凝血配体所诱导的因子X形成的能力。将IL-loc刺激的bEnd.3细胞与抗VCAM-l'tTF—起保温并用皂素使其透化。添加O.l-10jug/ml范围浓度的膜联蛋白V，将细胞保温30分钟，然后加入稀释的ProplexT。测定在膜联蛋白V存在或缺乏的条件下产生的因子Xa的量。用双份平行试样进行各个测定并重复至少两次。在凝血配体的作用中需要表面PS的表达通过发明者的下述发现得到了进一步的证明，即可与PS以高亲和力结合的膜联蛋白V在体外阻断了抗VCAM-l.tTF结合bEnd.3细胞从而产生因子Xa的能力。向与抗VCAM-l.tTF预保温过的透化细胞中加入膜联蛋白V会以剂量依赖型的方式抑制因子Xa的形成。在缺乏膜联蛋白V的情况下，细胞结合的凝血配体每60分钟在每10000个细胞内产生95ng因子Xa。逐步增加所加入膜联蛋白V的量(在jag/ml的范围内)抑制了因子Xa的产生。当添加量为10)ag/ml时，膜联蛋白V抑制了58。/。的因子Xa的产生。在试验期间逐步提高膜联蛋白V的浓度未观察到更多的抑制，表明在IOjig/ml时膜联蛋白V饱和了所有可供利用的结合位点。B.膜联蛋白V阻断了体内的凝血配体活性在患L540Hodgkin的SCID小鼠中检测膜联蛋白V抑制体内凝血配体诱导血栓形成的能力。在小鼠中生成肿瘤，两只小鼠一组(肺瘤尺寸为直径0.5cm)用以下药剂中的一种从尾静脉处静脉内注射a)生理盐水；b)100jig膜联蛋白V;c)40jug抗VCAM-l'tTF;d)100jag膜联蛋白V并在2小时后注射40jjg抗VCAM-l.tTF。最后一次注射4小时后，麻醉小鼠并用肝素化的盐水灌注。切下肿瘤，用4%的福尔马林固定、石蜡包埋并用苏木精-伊红染色。对形成血栓和未形成血栓的血管进行计数，并计算血栓形成的百分率。膜联蛋白V还封闭了体内抗VCAM-l.tTF凝血配体的活性。用对照或实验药剂之一处理带肿瘤的小鼠组。给小鼠施加a)生理盐水；b)100Jiig膜联蛋白V;c)4D)jg抗VCAM-l.tTF;d)100jag膜联蛋白V并在2小时后施加40jag抗VCAM-1.tTF凝血配体。在每组的两只小鼠中都得到了相同的结果。在盐水注射小鼠的肿瘤中未观察到自发的血栓形成、出血或坏死。单独用膜联蛋白V处理不改变肿瘤的形态。按照本文所提供的其他结果，40jag抗VCAM-l.tTF凝血配体在总共70%的肿瘤血管中引起血栓形成。大多数血管被聚集的红细胞和血凝块堵塞，肿瘤细胞相互分离。通过用膜联蛋白V预处理小鼠，完全消除了凝血配体诱导的抗肿瘤作用，即血管内血栓形成和肿瘤细胞形态的改变。这些发现证明了凝血配体的抗肿瘤效果是通过肿瘤血管的堵塞介导的这些数据还证明了PS是体内凝血配体诱导的血栓形成所必需的。实施例IV产生抗氨基磷脂、阴离子磷脂和复合物的抗体此实施例描述了发明者根据其对肿瘤血管内皮细胞中氨基磷脂和阴离子磷脂转位的观察设计的、且已发现在抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体产生中运作良好的免疫接种方法。获得了许多与诸如PS和PE等氨基磷脂和阴离子磷脂有反应性的抗体。在本实施例和以下实施例中，为了简便起见，与PS有反应性的抗体可称为"抗PS抗体"，尽管某些这样的抗体的结合并不局限于PS,而是如本文所示延伸到了某些其他的氨基磷脂和阴离子磷脂。A.免疫接种方案为了将氨基磷脂和阴离子磷脂作为较强的免疫原呈递于免疫系统中，将氨基磷脂和阴离子磷脂制备成氨基磷脂阳性和阴离子磷脂阳性细胞。插入膜且被其他膜组分所包围的氨基磷脂和阴离子磷脂对于产生抗体来说具有更好的构象和清除率。意图用表达氨基磷脂和阴离子磷脂(在此实施例中以PS为示范说明)的自体细胞免疫有免疫能力的动物，其中所述动物不会产生抗所有自身表面抗原的抗体，但会将膜暴露的磷脂(如PS)识别为外源成分。此方案可应用于任何标准实验室动物的使用中，例如有免疫能力的BALB/c小鼠和Lewis大鼠，以及任何氨基磷脂阳性或阴离子阳性细胞。首先选择BALB/c小鼠和小鼠内皮细胞bEnd.3(永生化的小鼠(BALB/c抹系)内皮细胞)。在10。/。C02培养箱中将bEnd.3培养于含9ml/500mlHEPES緩冲液的10%DMEM中。将bEnd.3细胞在T175TC烧瓶中扩大培养，直到获得所期望的细胞数目。一般而言，各烧瓶在细胞汇合至约70-80。/。时有约3x106个细胞，各小鼠应接受lx1(^至20x106个细月包，多达lxl()7个细月包。在37。C用50yM至200jaM过氧化氢处理bEnd.3细胞1小时或2小时，以便在免疫前暴露阴离子磷脂(例如PS)。11202的贮液是[9.8M];30%(v/v)。将其1:1000稀释，然后将O.4ml加入含40ml培养基的T175TC烧瓶中至终浓度为100)LiMH202。将细胞在37。C保持1小时。为了收获，用温的PBS(+10mMEDTA)漂洗细胞3次以去除培养基中所有的BSA或血清蛋白。用胰蛋白酶温和处理以取下细胞，漂洗并IOOOrpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于无添加剂的DMEM中至适当体积(每只小鼠接受在200jal中的约lx107个细胞)并保存于水上。用lml注射器和23号针头将以此方式处理的细胞(200yl细胞悬浮液)腹膜内注射入各个小鼠中。间隔3-4周免疫小鼠3-7次。从第二次激发开始，每次激发后10天给小鼠放血收集免疫血清。用ELISA测定抗PS的血清滴度。这些用自体PS阳性细胞进行的免疫不会导致自身抗体不受控的产生，而只局限于与PS有反应性、与联合了其他氨基磷脂和阴离子磷脂骨在另一项研究中，用经200uM过氧化氢处理2小时的bEnd.3内皮细胞免疫雌性Lewis大鼠。根据^I-标记的膜联蛋白V检测，此处理在70-90%的细胞中造成阴离子磷脂转位至外表面。将处理后的细胞漂洗、分离并计数。将200万细胞悬浮于无菌PBS中并每隔3周腹膜内注射5次。每次免疫后2天测定针对阴离子砩脂的多克隆抗体的滴度。B.高滴度抗血清得到了具有高效价的与诸如PS等阴离子磷脂有反应性的抗体的小鼠(表l)。小鼠未显示出任何的毒性迹象。尽管总体而言此免疫方法在小鼠中比在大鼠中更有效，对大鼠的免疫也是有效的，并且产生了9D2抗体(见下文)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>在进一步的免疫中，用经过氧化氢处理的bEnd.3细胞免疫多种小鼠3次，并在首次免疫后M天检测血清。用抗小鼠IgG，即Fc特异性二抗，检测血清中与PS有反应性的IgG抗体，用抗小鼠IgGmu特异性二抗检测血清中的IgM抗体。用此免疫方法获得了许多具有对PS有反应性的IgG和IgM的有效抗血清，其中含IgG抗体的抗血清通常更有效。这些方法现在可用于产生更多的特殊抗PS抗体，例如包括如下所述经筛选有效竟争3G4抗体的抗体。一般而言，当预期的抗PS抗血清的IgG滴度达到大于200，000，而PC滴度小于50，OOO时，可进行融合而产生单克隆抗体。此外，这些方法并不局限于用11202开始处理细胞，因为诱导氨基磷脂和阴离子磷脂表达的其他方法也可应用。例如，用TNF和放线菌素D进行处理是另一种有用的方法。在一种情况下，在37。C培养箱中用10ng/ml小鼠TNF和llig/ml放线菌素D处理亚汇合(约85%汇合)的bEnd.3细胞16小时。然后通过上述免疫步骤获得细胞。用膜破裂剂即溶血磷脂酰胆碱(LPC)进行处理可以用于诱导PS暴露。C.IgG和IgM单克隆抗体通过将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤配偶体P3X63AG8.653细胞(ATCC，Rockville，MD)融合得到杂交瘤。本发明者用于制备肿瘤治疗中有用的单克隆抗体的技术中一个重要方面是选择的策略，它包括通过筛选而选择可结合氨基磷脂或阴离子磷脂但不结合中性磷脂的抗体。另一重要的方面是选择不引起或显著造成抗磷脂综合症的抗体。分离与PS有反应性的单克隆抗体的方法包括例如用抗小鼠IgG，即FcY特异性二抗，在PS包被平板上筛选杂交瘤上清液。首先进行针对四种磷脂(ps，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺CL，心磷脂和PC，卵磷脂)以及bEnd.3细胞的筛选。丢弃与中性磷脂PC有反应性的克隆与bEnd.3细胞无反应性的克隆。选择高度结合抗PS的克隆。首先亚克隆只具有PS反应性或强烈倾向于PS的孔，其次亚克隆展示了PS反应性并且可与其他阴离子磷脂结合的孔。在以下研究中，按Rote等人(1993)所迷生产且被称为3SB、Dll和BA3的小鼠单克隆IgM抗体也包括在内。3SB抗体在该文献中被描述为抗PS抗体，而D11抗体在该文献中被描述为抗心磷脂(抗CL)抗体。Rose等人(1993，引入本文作为参考)报道了这些抗体的产生和鉴定的详情。测定发明者所制备的各选定杂交瘤的同种型。IgG类抗体具有许多优越于IgM之处，包括通常亲和力较高、体内清除率较低以及纯化、修饰和处理的简便性，所以它们的产生是尤其合乎需要的。为了集中于具有均一IgG同种型的孔，将含IgM或不同Ig混合物的孔丟弃或重克隆。高阳性克隆的亚克隆被重复3-4次。根据ELISA所测定的代表性的IgG和IgM抗体同种型见表2。在将其命名改变成3G4之前，发明者最初将3G4抗体称为"F3-G4"。这并未反映生物材料的任何变化。抗体的血清依赖性或不依赖性也参见表2(还可参见实施例XXX)。表2抗PS抗体的同种型和血清依赖性<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>3F8此研究小鼠IgG;膜联蛋白V不D.ELISA方案和初始抗体鉴定用ELISA进一步研究抗体并与3SB和D11比较。用于本研究实施例中的抗-PSELISA如下进行。除非详细说明具体的差异，这是本申请整个研究中所用的ELISA形式。后来开发了其他类型的ELISA，来自那些研究的结果列在实施例XXX中。用抗原PS(在2.5ml瓶中的P-664125mg10mg/ml(溶剂是氯仿MeOH95:5)示范说明了本实施例的ELISA。其他的磷脂可以相同的方法利用。PS(或其他磷脂)贮液应等分分装并在-30'C贮存于密封容目录号Oll-010-3550)。本实施例所用的标准封闭緩沖液是溶于PBS中的10。/。牛血清。其他的封闭溶液也是合适的，但封闭和漂洗溶液中应不含任何去污剂。一抗是待测样品或混合物。优选的二抗是山羊抗小鼠IgG-HRP。显色溶液是10ml0.2MNa2P04、10ml0.1M柠檬酸、一片10mg的OPD和lO过氧化氢。终止液是Q.18MH2SO"本实施例的方案按如下步骤用PS包被96孔板将PS贮液在正己烷中稀释至10)ag/ml并混合均匀。在每个孔中添加SOu1并4吏其蒸发1小时。在各孔中添加200ja110%的血清(或其他封闭緩冲液)，覆盖并室温放置2小时或在4。C过夜。用PBS漂洗平板3次。添加一抗(稀释于封闭緩冲液中)并在37。C保温W、时。用PBS漂洗3次。添加100jal/孔二抗(通常是山羊抗小鼠IgG-HRP或其他合适的二抗)并在3丌C保温1小时。用PBS漂洗平板3次。ELISA的显色进行如下添加100jal显色溶液至各孔中，显色10分钟，然后在各平板中加入100"l终止液并读取490nm处的O.D.值。以下是9D2、1B12、3G4和1B9的结果。测定这些抗体对PS的亲和力并与3SB进行比较。与3SB相比，新抗体的某些相对亲和力有了很大的提高(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>'基于组织培养上清液的稀释液；用抗小鼠或大鼠Igs作为俘获抗体通过夹心ELISA测定IgG和IgM的浓度。所有克隆平均分泌IO-15pg/ml的Ig。2用于转换的分子量IgM-900kDa，IgG-150kDa，膜联蛋白V-36kDa。3膜联蛋白对PS的亲和力在0.lnM至lnM的范围内。此表中的值代表了用与抗PS抗体相同的ELISA条件通过链霉抗生物素蛋白-HRP检测的市售生物素化膜联蛋白V的结合。用被以下磷脂包被的平板通过ELISA测定抗体的特异性PS，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，砩脂酰肌醇；PA，磷脂酸；PG，磷脂酰甘油；PC,卵磷脂；CL,心磷脂；和SM，鞘磷脂。将9D2、1B12、3G4和1B9的特异性^^莫式与3SB和D11进行比较，如表4中所显示的。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>3G4PS=PA=PI-PG=CL》PE2aG4PS=PA=PI=PG=CL>>PECh3G4PS=PA=PI=PG=CL》PE9D2PA〉PS=a>PG=PI〉>PEP2D9PS>PE=CL(PC不反应)1B12PS=PA>CL>PE=PI，PG3B10PS=PA=PIPE1B9只有PS反应2G7只有PS反应7C5只有PS反应3F8PS〉PE〉CL(PC反应很小或不反应)膜联蛋白vPS=PE=PI=PA>CL>PG'符号">"表明在相同抗体浓度下测试时与各种磷脂的结合至少有2倍的差异。2符号">>"表明在相同抗体浓度下测试时与各种磷脂的结合至少有io倍的差异。1B9、2G7和7C5抗体表现基本上相同。这些抗体只识别PS，并在结合PS时需要血清或血清蛋白质。在本实施例中1B9、^7和7(:5与多种磷脂的结合只有在存在10%牛血清的条件下才能检测到，而其他抗体则在缺乏或存在血清的条件下都可检测到。3SB基本上缺乏与磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇以及磷脂酰胆碱和鞘磷脂的反应性(表4)。E.进一步的抗体表征进一步测试3G4抗体与塑料固定化的磷脂的反应性。将磷脂溶解于正己烷中至浓度为50yg/ml。将100jul这种溶液加入96孔孩史量滴定板的孔中。溶剂在空气中蒸发后，平板用在包含2mMCa"的DPBS(结合緩沖液)中稀释的10%FBS封闭2小时。以33nM的起始浓度，将3G4抗体在10%牛血清存在下在结合緩沖液中稀释。在平板中制备2倍系列稀释物(lOOial/孔)。平板随后在室温下孵育2小时。洗涤后，使用HRP山羊抗小鼠IgG(1:1000稀释)来检测3G4。通过使用生色底物OPD随后通过使用微培养板阅读器(MolecularDevices,PaloAlto，CA)在490nm处读板，来检测第二级试剂。通过使用各种脂质体的竟争测定法来进一步证实磷脂识别的特异性。由在氯仿中的5mg单一磷脂(PS、PI、PC、CL、PA)来制备脂质体。溶液在氮气中干燥从而在圆底玻璃烧瓶中形成薄层。随后加入IOmlTris緩沖液(O.1M，pH7.4),并将烧瓶用超声处理5次，每次2分钟。3G4(6.6nM)与200jug/ml脂质体溶液一起在室温下预孵育1小时。将混合物加入经磷脂包被的平板中。如上所述测定在不同脂质体存在或不存在下3G4结合固定的磷脂的能力。该正在进行的研究显示，3G4是特异性地识别阴离子磷脂的小鼠IgG3K单克隆抗体。在5%牛血清(图4)或人血清存在下它强烈地结合至用阴离子磷脂(PS、PA、CL、PI)包被的ELISA板。使用浓度为O.2-0.4nM的3G4时观察到半最大结合(图4)。3G々在ELISA中不结合中性磷脂(PE、PC和SM)。具有无关特异性的对照小鼠IgG3单克隆抗体不结合。通过从阴离子磷脂制备的脂质体，而不是从中性磷脂制备的脂质体，来阻断结合(图3)。3G4结合用具有饱和的(不可氧化的)二棕榈酰基侧链的合成PS、PA和CL包被的ELISA板，并结合具有单脂肪酸侧链的溶血磷脂酸。结合不受5mMEDTA存在的影响，显示结合不依赖于0&2+。在本实施例的研究中，在血清不存在的情况下，与用阴离子磷脂包被的ELISA板的结合减少了90%。在lmg/ml人P2-糖蛋白I存在下恢复完全结合。结合不受凝血酶原、蛋白质、蛋白C、蛋白S、氧化的LDL、HMW激肽原、LMW激肽原、因子XII、组织纤溶酶原激活剂或膜联蛋白A5的影响。因此，现在已发现3G4抗体在血清或|32-糖蛋白1存在下识别阴离子磷脂。本文实施例XXX中呈现了来自与这个表征相关的进一步研究的结果。PS是质膜中最丰富的阴离子磷脂，并在正常条件下在正常细胞中被紧密隔离于质膜内表面。PS是氨基磷脂。PE也是氨基磷脂，但PE是中性的，非阴离子的。除了是中性氦基磷脂之外，PE的表现与PS类似并通常紧密隔离于质膜的内表面。PI是质膜的另一主要阴离子磷脂，它在正常条件下更紧密的隔离于正常细胞内表面。PA和PG是质膜中较少的阴离子磷脂(Hinkovska-Galcheva等人，1989),它们通常也隔离于内表面。CL是存在于线粒体膜中的阴离子磷脂，通常在质膜中没有。PC和SM是质膜中含胆碱的中性磷脂。PC和SM在正常条件下均主要位于外表面。与本发明者关于正常血管和肿瘤血管之间氨基磷脂和阴离子磷脂表达不同的模型一致，用选定方法开发的抗不有与中性磷脂PC和SM反应。1B9抗体特异于PS，而9D2、1B12和3G4以表4中所示的优先性结合阴离子磷脂和氨基磷脂。9D2抗体在实施例VI中也有描述。实施例V外在化的磷脂酰丝氨酸是肿瘤血管的总体标记物本实施例显示在小鼠中生长的10种不同实体瘤中每一种的内皮细胞上都存在PS的暴露，而不是局限于实施例11中所述的LMO肿瘤模型中。通过将针对PS的单克隆抗体静脉内注射入携带各种类型人或小鼠肿瘤的小鼠中来检测体内的外在化PS。抗PS抗体显示出在所有10种不同的肿瘤模型中均特异性结合血管内皮。来自同一小鼠正常器官的血管内皮则不被染色。同种型匹配的对照单克隆抗体不定位于肿瘤或正常细胞。免疫组化方法还鉴定了凋亡细胞，其中肿瘤中很少内皮细胞表达凋亡的标记物。本实施例因此显示了肿瘤中的血管内皮细胞使PS外在化，而正常血管内的内皮细胞则不会使PS外在化。大部分具有暴露的PS的肿瘤内皮细胞不是凋亡细胞。因此PS是肿瘤血管系统中丰富且易接近的标记物，能用于肿瘤血管的成像和治疗。A.L540、H358和HT29肺瘤用于这些研究中的抗PS抗体是被称为3SB的小鼠单克隆IgM抗体(实施例IV，Rote等人，1993)。3SB主要结合PS，但也与PA(—种分布类似于PS但相对较少的阴离子磷脂)有反应性。所用的抗CL抗体是被称为Dll的小鼠单克隆IgM抗体(实施例IV,Rote等人，1993)。首先在三种动物肿瘤模型中检测肿瘤血管和正常血管内皮上的PS暴露L540人Hodgkin，s淋巴瘤、NCIH358人非小细胞肺癌(NSCLC)和HT29人结肠直肠癌。为了在体内形成肿瘤，将2x106个细胞注射入SCID小鼠的右侧，寸吏胂瘤长到直径O.8-1.2cm。通过尾静脉将20ug抗PS或抗CL抗体静脉内注射入携带大肿瘤(体积大于800mm3)的小鼠。注射后1小时，麻醉小鼠并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。切下肿瘤和正常器官并速冻制备冷冻切片。用山羊抗小鼠IgM(ja特异性)-HRP缀合物并随后以咔唑显色来检测小鼠IgM。以40倍的放大倍数在每张切片上观察至少10个随机视野，计算阳性血管的平均百分率。抗PS抗体在体内特异导向于所有这三种肿瘤(HT"、LWO和NCI-H358)的血管系统，与用小鼠IgM检测所显示的一样。在此第一组研究中，肿瘤中被染色的血管的平均百分率对于HT29来说是80。/。，对于L540来说是30。/。，对于NCI-H3S8是50。/。。肿瘤中所有区域内的血管都被染色，并且小的毛细血管和较大的血管都被染色。在任何正常组织中都未观察到抗PS抗体对血管的染色。在肾中，抗PS和抗CL接受者二者的小管都被染色，这与IgM通过此器官分泌有关。除了肾之外，在任何肿瘤或正常组织中都未检测到抗CL抗体。这些发现表明只有肿瘤内皮将PS暴露于质膜外侧。B.小的和大的L540肿瘤为了估计肿瘤血管丧失将PS隔离于膜内侧的能力的时间点，对体积在140-1600mm3之间的L540肿瘤检测抗PS的定位。按照肿瘤的尺寸将小鼠分成3组140-300、350-800和800-1600mra3。在携带小LMO肿瘤(不超过300mm3)的三只小鼠中都未检测到抗PS抗体。抗PS抗体定位于5只携带中等大小L540肿瘤小鼠中的3只内以及携带大L5"肿瘤的所有小鼠(每组4只，4只都是)内(表5)。PS阳性血管占总血管的百分率(通过泛内皮标记Meca32进行鉴定)在L540中等大小组中是10-20%，在大L540肿瘤组中是20-40%(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>本按照肿瘤大小将携带L540Cy肿瘤的小鼠分成3组。静脉内注射20]ag抗PS抗体并使其循环l小时。用抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测冷冻切片上的小鼠抗体。"用泛内皮抗体Meca32测定血管的总数。在肿瘤的每张横切片上4个视野计数PS阳性和Meca阳性血管。表中显示了同一組中PS阳性血管的百分率范围。C.L540、H358、HT29、Colo26、B16和3LL肿瘤利用相同的抗PS(3SB)和抗CL(D11)抗体，通过另外三种动物肺瘤模型(总共6种)在进一步的研究中检测肿瘤血管和正常血管内皮上PS的暴露L540人Hodgkin，s淋巴瘤、NCIH3S8人非小细胞肺癌(NSCLC)、HT29人结肠直肠癌、Colo26小鼠结肠癌、B16小鼠黑素瘤和3LL小鼠肺肿瘤。在这些研究中，使肿瘤在SCID小鼠中皮下生长至体积达到O.4-0.7cm3。每组用3只或更多的小鼠。静脉内注射溶于200jal盐水中的抗PS或抗CL小鼠IgM抗体(30jug/小鼠)。30分钟后，将小鼠处死、放血并用肝素化的盐水灌注其血液循环系统。收获主要器官和肿瘤并速冻制备冷冻切片。用山羊抗小鼠IgM(ia特异性)-肌P缀合物并随后以呼唑显色检测小鼠IgM。用针对小鼠血管泛内皮标记的单克隆抗体MECA32对肺瘤的系列切片染色。通过形态学和它们与抗小鼠IgM和MECA32—致的染色来识别PS阳性血管。由两个独立的观察者以盲法检测每张切片上至少10个随机视野(0.317mm7视野)。计数PS染色阳性的MECA32-阳性血管百分率。在两个独立试验中的每一个中检测每种类型的三个肺瘤。计算平均值和标准偏差(SE)。各组中，胂瘤间的总血管和PS阳性血管数目差异约为10%。此研究中的所有6种肿瘤都包含PS阳性血管(表6A)。用3SB进行的PS检测是特异的，因为用抗CL抗体未观察到肿瘤内皮的染色(表6A)。在除了肾(在抗PS和抗CL接受者二者中均有小管染色，反映了IgM的分泌通过此器官)以外的正常器官中未观察到抗PS或抗CL抗体的血管定位。表6A抗PS抗体对肿瘤血管的特异定位<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table>*结果表示为每0.317mm'的视野中MECA32染色血管中PS阳性血管的平均(士SE)百分率。分析每种类型的6个肿瘤。对于L540、H358、HT29、B16、3LL和Colo26肺瘤来说，每O.317mm2的视野中MECA32阳性血管的平均数目分别是25、21、17、18、27和22±10%血管。"在抗PS和抗CL接受者中都可见无抗原特异性的小管染色。在这些研究中，PS阳性血管的百分率变动范围是从Colo26肺瘤中的10%至816胂瘤中的40%。抗PSIgM存在于胂瘤所有区域毛细血管和小静脉内腔表面。PS阳性血管看起来在坏死区内和周围特别普遍。阳性血管通常未显示出形态异常，这在光学显微镜下是显而易见的。定位于坏死区的偶发血管显示出消退的形态学迹象。抗PS抗体(但不是抗CL抗体)也定位于坏死的和凋亡的肿瘤细胞。这些对照研究证明了PS—致地暴露于各种肿瘤的血管内皮内腔表面，但在正常组织中不会如此，且肿瘤血管系统表达不是模型特异性的。D.大部分PS阳性肿瘤血管不是凋亡性的用双标记技术鉴定肿瘤切片中的凋亡内皮细胞。用泛内皮细胞标记MECA32鉴定内皮细胞。用两种独立的标记通过免疫组化方式鉴定凋亡细胞鉴定垂死细胞中胞质变化的活性形式胱天蛋白酶-3(Krajewska等人，1992)和鉴定具有核变化的细胞的片段化DNA(Gavrieli等人，1992)。通过兔抗胱天蛋白酶-3特异性抗体(MD，Minneapolis,MN)并随后与缀合了碱性磷酸酶的抗兔IgG(AP,Pierce,Rockford，IL)一起保温来检测活性胱天蛋白酶-3。以抗毛地黄毒苷-碱性磷酸酶缀合物作为检测药剂通过Tunel测定法(ApopTagTM试剂盒，0ncor，MD)分析其他的肿瘤切片。用凋亡标记物(粉色)和内皮细胞标记物MECA32(褐色)对切片双染色。如果内皮细胞和凋亡细胞的标记物一致，则两种颜色在同一细胞上都清晰可见。在6种类型肿瘤中有5种(HT29、H358、B16、Colo26、L540)的内皮细胞不展示任何一种凋亡标记物(表7)。第六种肿瘤3LL展示了定位于坏死区内的一些凋亡内皮细胞。相反，在所有类型肺瘤中凋亡的恶性细胞是常见的。凋亡肿瘤细胞的百分率是从L540肿瘤中的1-2%到3LL肿瘤中的12.6-19.6%的范围。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>*在每张切片的10个高倍视野下测定胱天蛋白酶-3阳性或Tunel阳性的肿瘤细胞或肿瘤血管百分率。沿着从边缘通过肿瘤中心的两个垂直方向随机选择视野。表中显示了来自6只小鼠的肿瘤中阳性细胞或血管的平均(±SE)百分率。"3LL肿瘤坏死区中的偶发血管(大于100条中有1条)展示了两种凋亡标记物。E.MDA-MB-231和MethA肿瘤还在小鼠内生长的MDA-MB-231人乳腺肿瘤中和在皮下生长的小鼠MethA纤维肉瘤中检测肿瘤血管内皮上的PS暴露。这些研究中所用的抗体是9D2抗体，按实施例IV中所述产生，它对阴离子磷脂有反应性。如实施例VI中所述，9D2定位于以下肿瘤的肿瘤血管L540、NCI-H358和B16肿瘤，以及同位生长于SCID小鼠乳房脂垫中的MDA-MB-231模型以及皮下生长的MethA纤维肉瘤。9D2定位于所有S种肿瘤的肿瘤血管。肿瘤中的血管内皮显示出独特的膜染色。9D2抗体还定位于坏死肿瘤细胞和凋亡肿瘤细胞的膜和胞质上。在被检测的10种正常器官中的9种内未观察到9D2抗体的血管定位，在肾中观察到小管的非特异染色。还进行了双染色研究，其中用生物素化的9D2抗体静脉内注射携带同位MDA-MB-231乳房肿瘤的小鼠，稍后用FITC缀合的MECA32对冷冻切片染色(实施例VI)。约40。/。MECA32阳性血管可结合9D2。F.MD-MBA-435肿瘤在进一步的乳癌模型中，在小鼠内生长的MDA-MB-435人乳癌细胞中检测肿瘤血管内皮上的PS暴露。用于这些研究中的抗体是嵌合形式的3G4抗体(ch3G4)。3G4抗体的产生如实施例IV所述，而嵌合3G4抗体的生产则详见实施例XIX。ch3G4对MDA-MB-435才莫型中肿瘤血管内皮的定位更详述于实施例XIX中。简而言之，用MDA-MB-435s细胞建立肿瘤，并施用生物素化形式的嵌合3G4抗体和无关特异性的对照IgG。肿瘤切片用Cy3-缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测生物素化的蛋白质。用MECA32抗体及随后加入的FITC标记抗大鼠IgG二抗进行双染色以检测血管内皮。此检测方法用红色和绿色标记生物素化的蛋白质和血管内皮，所以在会聚的图像中结合在内皮上的生物素化蛋白质呈现黄色。此研究显示嵌合3G4抗体对肿瘤血管内皮有特异性定位。在类似研究中，通过腹膜内或静脉内注射抗体并在H、时、6小时或24小时后给小鼠放血来测定3G4在体内选择性定位于肿瘤血管的能力。给肺瘤和正常组织的冷冻切片染色以确定小鼠免疫球蛋白的存在。使用已证实为具有不可检测的循环免疫球蛋白的SCID小鼠以避免背景染色。在这些研究中，切片用抗小鼠CD31复染以检测血管内皮并合并图像。将定位的3G4和CD31之间染色的同时存在视为特异性定位的证据。同时存在的染色呈现黄色，除非那个区域中特别强烈的绿色或红色荧光占优势。血管定位的抗原特异性通过肿瘤中缺乏内皮染色来证实，所述肿瘤来自用同种型匹配的对照抗体BBG3注射的小鼠。在这些研究中，如合并图像所测定的，在经腹膜内或静脉内注射到具有同位MDA-MB-435乳腺肿瘤的小鼠中后，3G4定位于平均40±10%的肺瘤血管中。在腹膜内注射3G4后，对肺瘤血管的定位在注射后l小时显现并在注射后6小时最大，而静脉内注射的3G4在注射后1小时内产生最大染色。经标记的血管在肿瘤的所有区域中可见，但在坏死区域内和周围特别丰富。在较大的血管中，有时观察到单个血管中PS暴露的不均一性。在某些血管的内皮周围也可见其中3G4已渗漏到肿瘤间质中的区域。在肿瘤坏死区域内和周围的肿瘤细胞被染色。在来自用对照抗体BBG3注射的小鼠的肿瘤中没有观察到坏死的肿瘤细胞的染色，这表明在用3G4注射的小鼠中对坏死肿瘤细胞的定位是抗原特异性的。在经静脉内注射3G4或对照抗体(BBG3)的小鼠中，初期4小时没有观察到3G4定位于正常组织的血管内皮。经检查的正常组织是心脏、肺、肝、胆囊、食道、胃、胰腺、十二指肠、盲肠、直肠、肾、肾上腺、脾、脑、目艮、唾液腺和卵巢。这些正常组织的非血管组分也是未被染色的。G.RIP-标签肿瘤对于第十种模型，在多阶段癌发生的"RIP-标签"转基因小鼠模型(RIP1-标签2)中检测肺瘤血管内皮上的PS暴露。在此转基因小鼠模型中，由于SV40T抗原(标签)癌基因在产生胰岛素的P细胞中的表达，每只小鼠在12-14周龄前发生胰腺的胰岛肿瘤。肿瘤分多阶段自过度增殖的胰岛发展，且需要有血管发生的开关从而发展成恶性。基质金属蛋白酶-9调控血管发生开关(REF)。与UCSF病理系教授DonaldMcDonald博士合作在RIPl-标签Z模型中进行9D2定位研究。当所有小鼠都具有小的、高度血管化的实体瘤时，将9D2静脉内注射入10周龄以上大的RIP1-标签2小鼠。进行厚肿瘤切片(80jam)的双染色来鉴别肿瘤和正常胰腺中的定位9D2和CD31。胰腺肿瘤中约50%的血管(CD31阳性)具有已定位的9D2，而正常胰岛中的血管则未被染色。用对照大鼠IgM注射的小鼠具有弱的且不频繁的肿瘤血管染色。9D2和对照大鼠IgM向内皮外的血管外组织的某些渗漏也是明显的。H.肿瘤定位研究概述本发明人现在已研究了各种抗PS抗体对在具有许多不同肿瘤的小鼠中的肿瘤血管的定位。来自此类研究的组合结果概括于表6B中。抗PS抗体定位于所有肺瘤的肿瘤血管中，而在正常器官中没有观察到血管定位(表6B)。表6B抗PS抗体对肿瘤和正常血管的定位<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table>因此，本实施例证实了肿瘤中的血管内皮细胞使PS和阴离子磷脂外在化至其内腔表面，在此它们能被体内的抗PS抗体结合。在正常组织中血管内皮细胞外表面无PS，表明识别PS的抗体、膜联蛋白v和其他配体可用于递送细胞毒性药物、凝血剂和放射性核素以供实体瘤中血管的选择性成像或破坏。在极大程度上，PS阳性肿瘤内皮看起来在此研究所用的肿瘤中是有活力的。它没有呈现出凋亡的标记，在形态上是完整的且代谢活跃，正如其中VCAM-1、E-选择蛋白和其他快速转换蛋白的表达所显示的。尽管经常被认为是凋亡的指示特征，PS的暴露还在几种类型的存活细胞中观察到，包括恶性细胞(Rao等人，1992)、(Utsugi等人，1991)活化的血小板(Rote等人，1993)以及在迁移、基质入侵和融合各阶段的胚胎营养细胞(Adler等人，19")。在去除凋亡原刺激物后恢复PS不对称性且正常生长的凋亡前B淋巴瘤细胞上也显示出PS的暴露与细胞死亡命运之间无相关性(Hammi11等人，1999)。在正常存活细胞中，通过诸如配体-受体相互作用等诱导Ca"流入细胞的表面活动可能引发PS暴露(Dillon等人，2000)。Ca"流激活了爬行酶(Zhao等人，1998)，并同时抑制了氨基磷脂转位酶(Comfurius等人，1990)。由于以下几个原因，肿瘤血管上的PS作为癌症摄像或治疗的靶目标来说是引入注目的它很丰富(约3xl(^个分子/个细胞)；位于肿瘤内皮的内腔表面，对于血液中血管靶向剂的结合来说是完全易接近的；它存在于多种实体瘤中高百分率的肿瘤内皮细胞上，而在迄今所检测的所有正常组织的内皮上都没有。因此针对肿瘤血管系统中的PS的未缀合抗体、血管靶向剂和成像剂能用于人类中癌症的检测和治疗。实施例VI阴离子磷脂暴露于胂瘤血管的表面正常条件下哺乳动物细胞质膜外表面基本上没有阴离子磷脂。磷脂酰丝氨酸在例如细胞表面的暴露是在凋亡、坏死、细胞损伤、细胞活化和恶性转化期间发生的。本实施例显示出体内肿瘤血管上阴离子磷脂上调，这通过结合阴离子磷脂的特异性抗体和天然配体二者的定位得到证实。将特异性识别阴离子磷脂的单克隆抗体9D2注射入携带多种同位或异位肿瘤的小鼠中。其他小鼠接受可结合阴离子磷脂的天然配体膜联蛋白V。9D2和膜联蛋白V特异性地定位于所有肿瘤的血管内皮上，还定位于坏死区内和周围的肿瘤细胞处。肿瘤血管中15-40%的内皮细胞被染色。在正常内皮上未检测到定位。根据9D2和膜联蛋白V的结合进行评估的，检测已知存在于肿瘤微环境中的各种因子和肿瘤相关状态引起培养内皮细胞中阴离子磷脂暴露的能力。低氧/复氧、酸性、凝血酶和炎性细胞因子都诱导了阴离子磷脂的暴露。过氧化物酶也是一种强诱导剂。用炎性细胞因子和低氧/复氧的组合处理效果大于加和效果。因此，已证实的体内肿瘤内皮上阴离子磷脂的暴露有可能是通过损伤以及细胞因子和反应性氧类的活化引起的。无论是何机制，阴离子磷脂都是目前能用于肿瘤血管靶向、成像和治疗中的肿瘤血管标记物。A.材料和方法1.材料Na出I获自Amersham(ArlingtonHeights,IL)。Dulbecco改良的Eagle组织培养基和含Ca2+和Mg2+的DulbeccoPBS获自Gibco(GrandIsland,纽约)。胎牛血清获自Hyclone(Logan，Utah)。L-a-磷月旨酰丝氨酸、L-a-卵磷脂、心磷脂、L-a-磷脂酰乙醇胺、L-a-磷脂酰肌醇、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、0-苯二胺、过氧化氢和凝血酶获自Sigma(St.Louis，M0)。24孑L平底板获自Falcon(BectonDickinson和Co.，LincolnPark,NJ)。重组肝细胞生长因子(HGF或扩散因子)和放线菌素D来自Calbiochem(SanDiego,CA)。重组小鼠白介素-lot、P和胂瘤坏死因子oc(TNFot)购自R&DSystems(Minneapolis,MN)。I型通用干扰素(取代所有类型干扰素的杂合蛋白质)购自PBLBiomedicalLaboratories(NewBrunswick,NJ)。重组人血管内皮生长因子121(VEGF)、人血小板衍生生长因子-BB、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)和人成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)购自PeproTech(RockyHi11，NJ)。2.抗体泛小鼠内皮细胞抗体MECA32获自E.Butcher博士(斯坦福大学，加州)并用作免疫组化研究的阳性对照。有关此抗体的详情已发表(Leppink等人，1989)。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的兔抗大鼠免疫球蛋白、大鼠抗小鼠免疫球蛋白以及山羊抗小鼠和抗大鼠二抗购自Daco(Carpinteria,CA)或JacksonImmunoresearchLabs(WestGrove,PA)。这些研究中所用的9D2抗体按实施例IV所述产生。9DZ抗体是与阴离子磷脂有反应性的大鼠单克隆抗体。9D卩的磷脂特异性的进一步表征参见此实施例的结果部分。3.细胞来自末期疾病患者的L540CyHodgkin淋巴瘤细胞由V.Diehl教授(Koln,德国)提供。NCI-H358人非小细胞肺癌由AdiGazdar博士(西南医学中心，达拉斯，德州)提供。MethA小鼠纤维肉瘤和MDA-MB-231人乳癌获自美国典型细胞保藏中心(RockvUle，MD)。小鼠脑内皮瘤细胞系bEnd.3由WemerRisau教授提供(MaxPlank研究所，Munich,德国)并保持于含10。/。FBS的DMEM中。成年牛主动脉内皮(ABAB)细胞购自Clonetics(SanDiego，加州；Walkerville，MD)。ABAE细胞保持于含10%血清和2ng/mlbFGF的DMEM中。4.组织培养bEnd.3、ABAE细胞和除L540Cy淋巴瘤之外的所有肿瘤细胞均保持于补充了10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、2单位/ml青霉素G和2jag/ml链霉素的DMEM中。LMOCy细胞保持于含相同添加剂的RPMI1640中。细胞每周传代培养一次。用溶于含O.2%EDTA的PBS中的O.125%胰蛋白酶进行bEnd.3细胞的胰酶消化。为了进行体外研究，以IOx1(^个细胞/加i的密度将内皮细胞接种于24孔板内的1ml培养基中，并在用于本试验前保温48-96小时。每次研究前24小时更换培养基。5.与塑料固定化的磷脂的反应性将磷脂溶于正己烷中至浓度为50pg/ml。将100iil此溶液加入96孔微量滴定板的孔内。待溶剂在空气中蒸发后，用稀释于含2mMCa2+的DPBS(结合緩冲液)中的10。/。胎牛血清封闭平板2小时。将9D2抗体或膜联蛋白V以6.7nM的起始浓度稀释于含10。/o血清的结合緩冲液中。在平板中配制两倍的系列稀释液U00u1/孔)。然后将平板在室温保温2小时。漂洗平板并分别用与HRP缀合的山羊抗大鼠IgM和兔抗人膜联蛋白V以及随后的与HRP缀合的山羊抗兔IgG(均为1:1000稀释)检测9D2和膜联蛋白V。用生色底物OPD检测第二级试剂，然后用微量平板读数仪(MolecularDevices,PaloAlto，CA)在490nm处对平板读数。用具有无关特异性的对照大鼠IgM(Pharmingen，SanDiego，CA)证实了9D2抗体结合的特异性。膜联蛋白V结合磷脂的特异性是Ca2+依赖型的，通过将药剂稀释于含5mMEDTA的DPBS中对其进行测定。另外的阴性对照是用含O.2°/去污剂吐温20的结合緩冲液漂洗平板。此处理将脂抽提出来，因此去除了吸附于塑料上的磷脂。9D2抗体和膜联蛋白V都不结合经去污剂漂洗过的平板。6.在培养的内皮细胞表面上的阴离子磷脂的检测将内皮细胞培养至约70%汇合。为了诱导PS暴露，在37'C用H202(200uM)处理细胞l小时。用含Ca"和Mg"的DPBS漂洗对照和处理过的载玻片，并用稀释于相同緩冲液中的O.25%戊二醛固定。通过与50mMNIU:U阵育5分钟来淬灭过量的醛基。为了检查去污剂和有机溶剂对磷脂检测的影响，将一些载玻片与丙酮(5分钟)或含l%(v/v)TritonX-100的PBS—起预孵育。细胞用DPBS(含Ca"、Mg2+和0.2%(w/v)明胶)漂洗并与1jag/ml生物素化膜联蛋白V(Pharmingen，SanDiego,CA)或lug/ml9D2抗体孵育。孵育2小时后，用O.2%明胶緩冲液漂洗细胞并与链霉抗生物素蛋白-服P(l:500稀释)保温。无关特异性的大鼠IgM和链霉抗生物素蛋白单独使用作为这些试验中的阴性对照。所有步骤都在室温进行。加入溶于柠檬酸盐-磷酸盐緩冲液，pH5.5中的邻苯二胺(0.5mg/ml)和过氧化氢(0.03%w/v)检测HRP的活性。15分钟后，将100jli1上清液转移至96孔板中，加入100y10.18MH2SO4并检测490nm处的吸收值。或者，通过加入^t唑底物，产生不溶性红褐色沉淀来检测PS阳性细胞。每个试验都以双份试样进行并重复至少两次。7.通过脂质体抑制9D2和膜联蛋白V与磷脂的结合通过用各种脂质体进行的竟争性试验进一步证实了磷脂识别的特异性。脂质体是从氯仿中含5mg单一磷脂的溶液制备的。将溶液在氮气中千燥，使其在圆底玻璃瓶中形成薄层。然后加入IOmlTris緩沖液(0.1M,pH7.4)并将烧瓶超声处理5次，每次2分钟。将9D2或膜联蛋白V(6.66nM)与200ng/ml脂质体溶液于室温预保温l小时。将混合物加入经磷脂包被的平板或内皮细胞单层上。如上所述测定在存在或不存在不同脂质体的条件下9D2结合固定化磷脂或细胞表面的能力。8.9D2和膜联蛋白V竟争结合固定化的PS通过将纯化蛋白质与10倍摩尔浓度过量的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(Sigma,M0)在室温保温1小时来制备生物素化9D〗抗体和膜联蛋白V。用PBS透析除去游离的生物素。生物素化的步骤不会削弱任一蛋白质的PS结合能力。为了进行竟争性试验，将未修饰的和生物素化的蛋白质与1O倍摩尔浓度过量的未修饰蛋白质预混合。然后将混合物加到PS包被平板上。用l:IOOO稀释的链霹抗生物素蛋白-HRP缀合物检测所结合的药剂。在无竟争剂的条件下各药剂与PS的结合值作为100。/。。9.皮下移植肿瘤的生长为了进行定位研究，将2x10'个L540人Hodgkin，s淋巴瘤细胞或lx1(T个其他肿瘤类型细胞皮下注射入SCID小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)的右侧。使肿瘤长至体积O.-0.7cra3。每组最少用3只动物。研究重复至少3次。10.人MDA-MB-231乳癌的同位模型雌性/7w/z"或SCID小鼠购自CharlesRiver。按照所7>布的方法(Price，1996)将MDA-MB-231人乳腺癌细胞移植入乳房脂垫中。简而言之，将小鼠麻醉并在侧面胸腔上方皮肤处做一5mm的切口。使乳房垫暴露以保证重悬于O.1ml盐水中的lx10'个MDA-MB-231细胞注射的位点正确。11.患肿瘤小鼠体内阴离子磷脂的检测将9D2或膜联蛋白V直接施加到冷冻组织切片上的免疫组化技术不能区别质膜内表面和外表面上的阴离子磷脂。为了检测外部定位的磷脂，基本上如前文所述进行操作(实施例V;Ran等人，1998)，将50pg9D2或生物素化9D2抗体或100yg生物素化膜联蛋白V静脉内注射入患肿瘤的SCID小鼠。60分钟后，如前文所述(Burrows等人，1992),处死小鼠并将其血放干，用肝素化的盐水灌注。收获所有主要器官和肿瘤并速冻以制备冷冻切片。用含10。/。血清的PBS封闭切片。为了防止磷脂在栽片处理过程中丢失，在封闭和漂洗緩沖液中避免使用去污剂和有机溶剂。用山羊抗大鼠IgM(ji特异性)-HRP缀合物及随后用呼唑或DAB显色来检测大鼠IgM(Fries等人，1993)。用与HRP缀合的链霉抗生物素蛋白检测生物素化的药剂。将来自注射了盐水或无关特异性大鼠IgM的小鼠的肿瘤切片作为阴性对照。另外的对照包括将载片在1%Triton溶液或丙酮中孵育lO分钟。这些处理将磷脂抽提出来。在这些条件下检测不到信号。以100X的放大倍数测定每个高倍视野中阳性血管的数目。每张切片上至少检查10个视野并计算阳性血管的平均百分率。用此方法对切片进行染色以分析9D2或膜联蛋白V存在情况的研究检测到具有体内药剂易靠近结合的外在化阴离子磷脂的细胞。12.PS阳性肺瘤血管的鉴别和定量具有定位化9D2抗体或膜联蛋白V的结构通过DAB染色切片上的形态学外观和冷冻组织连续切片上泛内皮细胞标记MECA32的一致染色被确认为血管。通过对肿瘤连续切片中被MECA32、9D2或膜联蛋白V染色的血管计数，进行DAB染色切片的定量。检查由注射了9D2抗体、对照大鼠IgM或膜联蛋白V的6只小鼠来源的各肿瘤类型的6张切片。由两个独立的观察者以盲法对每张切片上至少10个随机视野(0.317mmV视野)进行评分。计算被9D2、膜联蛋白V或MECA32染色的血管的平均数目和标准偏差。将各肿瘤类型组中测定的9D2或膜联蛋白V阳性血管的平均数目与同一肿瘤组中MECA32阳性血管的平均数目进行比较。计算9D2或膜联蛋白V阳性血管的百分率。在进一步的研究中，将50jag生物素化9D2、对照IgM或膜联蛋白V(每组6只小鼠)静脉内注射入患MDA-MB-231肿瘤(体积0.3-0.7cm3)的SCID小鼠中。生物素化的试剂首先与链霉抗生物素蛋白-Cys缀合物一起孵育，在PBS中漂洗，然后与MECA32抗体孵育，再与FITC标记的抗大鼠IgG二抗孵育。分别用针对Cy3(红色)和FITC(绿色)荧光的适当滤镜通过数码相机捕捉单一的图像并传输到计算机上。通过Metaview软件将表现为黄色(融合了绿色和红色荧光的结果)IO个随机视野(0.317mm7视野)的图像叠加。用同样的方法分析来自注射了对照大鼠IgM或盐水的小鼠的肿瘤。如下计算具有定位化9D2或膜联蛋白V的血管的百分率用每个视野中黄色血管的平均数目除以绿色(总)血管的平均数再乘以IOO。B.结果1.9D2抗体和膜联蛋白V的磷脂特异性在ELISA中，9D2抗体特异性识别阴离子磷脂(PS、PA、CL、PI、PG),而对中性磷脂(PE、PC和SM)无显著的反应性(表8)。在ELISA中9D2与磷脂结合的强度顺序是PAWSK:L〉PG-PI。结合是抗原特异性的，因为用几个无关特异性大鼠IgM对照未观察到结合。9D2与吸附于ELISA平板上的任何阴离子磷脂的结合都会被由任何阴离子磷脂制备的脂质体封闭，但不会被由任何中性磷脂制备的脂质体所封闭。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table>a总磷脂的百分数，来自Fridrikkson等人，1999。不同细胞类型间百分数可能有变化。膜联蛋白V也与阴离子磷脂结合，但它的结合特异性小于9D2与阴离子磷脂结合的特异性，因为它也与中性磷脂PE强结合。在ELISA中膜联蛋白V与磷脂结合的强度顺序是PI〉PS-PE-PA-CUPG(表8)。这些有关膜联蛋白V的发现与较早的资料是一致的(Andree等人，1990)。9D2的结合不受5mMEDTA存在的影响，表明它与阴离子磷脂的结合不需要Ca"。相反，5raMEDTA存在时会消除膜联蛋白V与阴离子磷脂的结合，正如由它与阴离子磷脂或PE的结合依赖于Ca"这一已有知识可预计到的(Schlaepfer等人，1987;Blackwood和Ernst，1990)。9D2或膜联蛋白V都不与包被了磷脂、但随后用含0.2。/。Tween的盐水漂洗过的ELISA平板结合，证实了它们是结合于所吸附的磷脂上。9D2和膜联蛋白V没有可检测到的与肝素、硫酸乙酰肝素或者双链或单链DNA的结合。2.9D2抗体和膜联蛋白V不会交叉阻断彼此与PS的结合为了检查9D卩抗体和膜联蛋白V是否竟争结合PS，在PS包被平板上用生物素化的蛋白质进行交叉封闭研究。生物素化的9D2抗体和膜联蛋白V分别被10倍摩尔浓度过量的未修饰9D2和膜联蛋白V封闭(表9)。然而，未修饰的膜联蛋白V不会影响生物素化9D2与PS平板结合的能力。同样的，添加未修饰的9D2抗体也不会改变生物素化膜联蛋白V结合PS平板的能力(表9)。表99D2和膜联蛋白V不会交叉阻断与PS的结合PS结合蛋白质竟争剂s结合(％对照)b生物素化膜联蛋白v膜联蛋白v8%生物素化9D2膜联蛋白v93%生物素化膜联蛋白v9D295%生物素化9D29D25%a将膜联蛋白V或9D2抗体以比生物素化的药剂10倍摩尔浓度过量的量预混合。用链霉抗生物素蛋白-HRP检测微量滴定板上生物素化药剂与PS的结合。b将缺乏竟争剂的条件下生物素化药剂的反应性作为100。/。。表中显示了三份试样测定的平均值。SD小于平均值的ioy。。这些结果表明，9D2抗体和膜联蛋白V不会交叉阻断彼此与PS包被平板的结合，这是因为它们或者识别PS分子上的不同表位，或者识别塑料上所吸附PS的不同构象。3.与细胞表面上的外在化阴离子磷脂的结合用小鼠bEnd.3内皮细胞或牛ABAE细胞检测9D2抗体和膜联蛋白V与细胞表面的结合。9D2或膜联蛋白V都不结合静止条件下任一细胞类型的未透化单层。这表明大部分质膜阴离子磷脂通常隐蔽于胞质结构域内。相反，当细胞在引起90-100%内皮细胞凋亡的条件下与TNFot和放线菌素D预孵育时，观察到强染色。为了证实9D2和膜联蛋白V结合于细胞表面上的磷脂，在存在或缺乏各种竟争性脂质体的条件下将经H202处理过的bEnd.3细胞与9D2抗体或膜联蛋白V—起孵育。在细胞用低于毒性浓度(100-200jaM)的&02预处理后，阴离子磷脂在未凋亡的存活bEnd.3细胞上变得暴露(Ran等，2002a)。9D2抗体与经H202处理过的bEnd，3细胞的结合被含阴离子磷脂的脂质体所抑制，但不被含中性磷脂的脂质体抑制。对9D2与细胞的结合发生抑制的幅度变化顺序为PA>PS>CL>PG>PI，与利用塑料固定化磷脂所获得的结果接近一致。类似地，膜联蛋白V与经H202的处理过的细胞的结合被含PS、PA、PE、CL和PI及PG的脂质体阻断，后两者的阻断程度较低一些。含SM或PC的脂质体不会阻断膜联蛋白V与细胞的结合，所有这些均与利用塑料固定化的磷脂获得的结果一致。这些结果证实了9D2与经11202处理过的内皮细胞中的阴离子磷脂相结合，而膜联蛋白除了阴离子磷脂外还与PE结合。4.体内在细胞上的外在化阴离子磷脂的检测将9D2或膜联蛋白V直接施加到冷冻组织切片上的直接免疫组化技术不能区别质膜内表面和外表面的阴离子磷脂。为了检测外部定位的磷脂，将9D2和膜联蛋白V静脉内注射入患肿瘤的小鼠并通过间接的免疫组化方法测定它们对肿瘤血管的定位。用9D2抗体或生物素化膜联蛋白V静脉内注射带各种类型实体瘤的小鼠，l小时后，给小鼠放血，切下肺瘤和正常组织并制备冷冻切片。将冷冻组织块切片并用被HRP标记的抗大鼠IgM或被HRP标记的链霉抗生物素蛋白进行染色，以确定9D2和膜联蛋白V在注射后结合到哪些细胞上。在连续切片上通过形态学和泛内皮细胞抗体MECA"的阳性染色对血管进行鉴定。5.携带肿瘤的小鼠中9D2抗体和膜联蛋白V的生物分布在此研究所包括的所有5种肿瘤中9D2抗体和膜联蛋白V都定位于胂瘤血管处(表IO)。这些肿瘤是SCID小鼠乳房脂垫中原位生长的人MDA-MB-231乳房肺瘤；皮下生长的人L540Hodgkin，s肿瘤；皮下生长的人NCI-H358NSCLC;皮下生长的小鼠B16黑素瘤和皮下生长的小鼠MethA纤维肉瘤。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table>a通过注射抗体(50^1g)、用盐水灌注小鼠的血循环系统并用抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测组织切片上的抗体来测定患肿瘤小鼠中9D2抗体和大鼠IgM对照的定位。结果表示为每个O.317mn^的视野内MECA32-染色血管的PS阳性血管平均(±SE)百分数。每种类型分析6个样品。对于MDA-MB—231、L540cy、H358、B16和MethA肿瘤来i兌，每个O.317mm2的一见野内MECA32-阳性血管的平均数分别为23、25、21、18和19土10个血管。b通过注射生物素化膜联蛋白V随后用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物检测冰冻切片来测定膜联蛋白V的定位。c在9D2和对照抗体接受者中都可见非抗原特异性小管染色。9D2和膜联蛋白V基本上有相同的染色模式。9D2抗体对肿瘤血管的定位是特异的，因为用无关特异性的大鼠IgM未观察到肿瘤内皮的染色。推测起来，大概是发生了某种程度的对照大鼠IgM从肿瘤血管中向外的渗漏，但血管外IgM的染色太分散或太弱以致不能被间接的免疫组化方法所辨别。在被检测的10种正常器官中有9种未观察到9D2抗体或膜联蛋白V的血管定位(表IO)。在肾中，观察到了非抗原特异性的小管染色。小管在9D2和对照大鼠IgM接受者中都被染色，大概是因为IgM或其代谢物通过此器官分泌。生理学上的血管发生部位卵巢则未检测。9D2和膜联蛋白V阳性血管的百分数包括从MDA-MB-23l肿瘤中的40%至H358肿瘤中的15%。阴离子磷脂阳性血管存在于肺瘤所有区域内毛细管和血管的内腔表面，但在坏死区内和周围尤其普遍。大部分阴离子磷脂阳性血管未显示出光学显微镜下明显的形态异常。偶发的血管，尤其是那些定位于坏死区的血管显示出形态退化的迹象。9D2抗体和膜联蛋白V也定位于坏死的和凋亡的肿瘤细胞处，而对照IgM的定位则检测不到(图4)。这些发现证实了阴离子磷脂存在于各种肿瘤血管内皮细胞内腔表面但不存在于正常组织中。6.双染色研究还进行了双染色研究，其中将生物素化9D2抗体、生物素化对照IgM或生物素化膜联蛋白V静脉内注射入带同位MDA-MB-231乳腺肿瘤的小鼠。l小时后，处死小鼠，切下肿瘤并对冷冻块进行切片。然后用Cy3-缀合的链霉抗生物素蛋白染色肿瘤切片来检测生物素化的蛋白质以及用FITC-缀合的MECA32染色来检测血管内皮。此检测方法用红色和绿色标记了生物素化蛋白质和血管内皮。其中生物素化蛋白质与内皮结合，合并的图像呈现出黄色。在这些研究中，生物素化9D2和膜联蛋白V似乎大部分与血管内皮结合，因为它们的染色模式与MECA32的模式合并在一起。约40%的MECA32阳性血管结合9D2和膜联蛋白V，与用间接免疫组化方法获得的结果接近一致。不过，通过双染色检测到了生物素化蛋白质向肿瘤间质组织内的渗漏，而用间接免疫组化方法则不明显。在少数(约5%)血管周围的血管内皮外可见生物素化的蛋白质。在来自注射了生物素化无关特异性大鼠IgM的小鼠的肿瘤中，生物素化IgM已渗漏入相似百分数(约5%)血管周围的肿瘤间质组织中，但通常未呈现出被血管内皮结合。推测起来，用双染色技术可以检测溢出的9D2和膜联蛋白V，但用间接的免疫组化技术则不可以，反映了前一种技术具有较高的灵敏度且更准确，从而可用于比较两种染色模式。未注射的对照肿瘤完全不被链霉抗生物素蛋白-Cy3所染色，这表明红色荧光相应于被定位的蛋白质。实施例VII肿瘤环境中阴离子磷脂膜的移位有关氨基磷脂和阴离子磷脂作为肿瘤血管内皮细胞独特的体内表面标记的发现促使发明者进一步研究肿瘤微环境对这些分子移位和外膜表达的影响。本实施例显示了将体外内皮细胞暴露于模拟肿瘤微环境的一定条件中再现了较早观察到的氨基磷脂和阴离子磷脂在完整、存活细胞中的表面表达。A.材料和方法1.膜联蛋白V的碘化从ET12a-P阴离子磷脂l质粒(获自J.Tait博士，华盛顿大学，西雅图)转化的大肠杆菌纯化重组人膜联蛋白V。分别在SDS-PAGE上和PS包被的塑料板上验证蛋白质的纯度和与PS的结合。用亲和纯化的兔多克隆抗膜联蛋白V抗体检测与PS结合的膜联蛋白V。如Bocci(1964)所述用氯胺T对膜联蛋白V进行mi放射标记。根据Bradford检测法(1976)所检测的，比活性约为lx106cpm/Mg蛋白质。2.内皮细胞的处理用表ll所列浓度的细胞因子或生长因子处理内皮细胞。所有试剂都稀释于含10%血清的培养基中，并在37。C与细胞一起孵育24小时。为了研究低氧的作用，将细胞接种于24孔板中并在潮湿的含氧量正常的空气(21%02，5%C02)中孵育48小时，然后转移至在一密封舱(BillupsRothenbergInc.,DelMar，Ca)中潮湿且含氧量低的空气(1%02，5%C02，94%N2)中。将细胞在低氧舱中37。C孵育24小时，然后转回到含氧量正常的环境中，37°C4小时。将此细胞与相同代数的同一天接种且完全保持于含氧量正常条件下的平行培养物进行比较。在某些研究中，在转移到低氧舱中之前将IL-1a(10ng/ml)和TNFa(20ng/ml)加入培养基中。为了检测酸性微环境的影响，将细胞暴露于缺乏碳酸氬盐的生长培养基中，用必需量的HCl调节成不同的pH(在7.3和6.2之间变动)。在缺乏C02的条件下37'C孵育细胞。确认培养基在24小时的培养期间保持给定的pH值。这些实验条件对牛或小鼠内皮细胞是无毒的，且对贴壁单层的细胞形态或生存能力是没有影响的。3.用1251-标记的膜联蛋白V检测在培养的内皮细胞上的PS用上述药剂处理后，将处理过的细胞和对照细胞与结合緩冲液中的7.1pmol1251-标记的膜联蛋白V(200jli1/孔)一起孵育。室温孵育2小时后，细胞经大量漂洗后溶于O.5MNaOH中。将总体积O.5ml转移至塑料管中并在Y计数器中计数。在存在5mMEDTA的条件下测定非特异性结合并从实验值中将其减去。结果表示为细胞结合型膜联蛋白V的净pmol值，标准化为每lx106个细胞中的值。在以;故线菌素D和TNFcx(各组分50ng/ml)同时处理的细胞上测定膜联蛋白V的最大结合。正如事先已报道的(Lucas等人，1998)，这些药剂在90-100。/。的内皮细胞中引起凋亡和PS暴露。在含10。/。血清的培养基中测定1251-膜联蛋白v与未处理细胞的基础结合。将与未处理培养物结合的1251-膜联蛋白V的量从处理过的培养物的结合值中减去。按照以下公式计算PS的暴露用实验条件下的细胞结合型膜联蛋白V的量(pmoles)除以最大膜联蛋白V结合量(pmoles)，乘以IOO。每一项研究都以双份试样进行并至少重复3次。计算平均值。从这些独立实验所得平均值的SE小于50/。。4.在培养的内皮细胞和MDA-MB-435肿瘤细胞上的PS检测HUVEC细胞和肿瘤细胞在8孔腔式载玻片上生长至大约70%汇合。为了诱导PS暴露，细胞用在无血清培养基中的HA(200jaM)于37。C处理1小时。细胞用DPBS洗涤并与在无血清培养基中稀释的2jig/ml3G4抗体一起在室温下孵育l小时。用DPBS轻柔洗涤后，细胞用在PBS中的4。/。(v/v)低聚曱醛固定15分钟。为了用经德克萨斯红标记的鬼笔环肽(MolecularProbes，Eugene,0R)共染色细胞骨架，细胞用在PBS中的O.1°/。Triton-X100渗透化处理5分钟。经德克萨斯红标记的鬼笔环肽(在包含1%BSA的PBS中1:50稀释)和经FITC标记的山羊抗小鼠抗体(在包含1%BSA的PBS中1:200稀释)在室温下孵育l小时。细胞核用DAPI复染。具有无关特异性的小鼠IgG3和单独的二抗在这些研究中用作阴性对照。每项研究都以双份试样进行并重复至少2次。在其他研究中，经11202处理的细胞用0.2"/。胰蛋白酶脱离，洗涤，在包含O.05%w/v叠氮化钠和2ng/ml3G4的冰冷DMEM中悬浮l小时。细胞粒状沉淀用包含1%BSA的PBS洗涤，并在包含经FITC标记的山羊抗小鼠抗体(l:200稀释)的相同緩冲液中悬浮30分钟。洗涤3次后，将细胞粒状沉淀悬浮在包含1%BSA和O.05%w/v叠氮化钠的PBS中。对于活/死的区别，在FACS分析前加入碘化丙锭。B.结果1.用跳诱导以50，000个细胞/孔的起始密度接种小鼠bEnd.3内皮细胞。24小时后将细胞与渐增浓度(从l0uM至500nM)的&02在37。C一起孵育孵育1小时或者不对其进行处理。在结束孵育后，用含O."/。明胶的PBS漂洗细胞3次并用0.25。/戊二醛固定。同样的孔用抗PSIgM染色或胰酶处理并通过TrypanBlue排斥试验评估存活力。为了进行抗PS染色，在用2%明胶封闭10分钟后，将细胞与2)ag/ml抗PS抗体一起孵育，随后用抗小鼠IgM-HRP缀合物进行检测。将内皮细胞暴露于高浓度的H2O2中会在约90。/。细胞中引起PS移位。另一方面，这伴随着细胞从基底上脱离且细胞的存活力下降到约50-60%。表面PS表达与细胞存活力下降之间的关联是可以理解的，尽管我们仍感兴趣的注意到观察到了约90%的PS移位，而细胞存活力只下降了50-60%。用较低浓度的H202导致了显著的PS表达，而细胞存活力没有任何可察觉的降低。例如，在用低达20jLiM的浓度的H2O2处理的所有孔中约50。/。细胞的表面检测到PS。值得指出的是，在这些低11202浓度下，细胞保持牢固地附着于塑料上以及牢固地相互结合，显示出无形态改变且没有细胞毒性的迹象。详细的分析揭示出基本上100%的细胞-细胞接触、正确细胞形状的保持和完整的细胞骨架。因此在细胞存活力与未处理细胞对照相同(即95%)的细胞群中观察到由低水平H2O2所诱发的50。/。PS表面表达。与高H202浓度相关的PS表达伴随着细胞损伤，而暴露于高H202浓度的PS阳性细胞脱离下来、漂浮着并具有被破坏的细胞骨架。在低浓度仏02存在条件下细胞存活力的保持与来自其他实验室的结果相符。例如，Schorer等人(1985)揭示了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用15jaM仏02处理后仍保持平均90-95%的存活力(据报道有5%-10%受损)，而暴露于1500uM11202中的那些细胞则只有0%-50%存活(50%-100%受损)。利用&02体外模拟肿瘤环境也是恰当的，因为其中肿瘤环境富含诸如巨谊细胞、PMNs和粒细胞等炎性细胞，它们产生&02和其他反应性氧类。尽管过去从未将其与稳定的肿瘤血管标记联系起来，现已知炎性细胞通过涉及反应性氧类且需要11202存在的机制介导了内皮细胞的损伤(Weiss等人，1981;Yamada等人，1981;Schorer等人，1985)。事实上，研究已显示了PMNs的体外刺激产生的H202浓度足以引起致死水平以下的内皮细胞损伤，而不引起细胞死亡(用铬释放检测法检测)或细胞脱离；且这些&02浓度是体内局部可达到的(Schorer等人，1985)。这些体外移位结果与显示抗PS抗体特异定位于体内胂瘤血管内皮细胞而不结合正常组织细胞的已有结果有关。体内类似浓度HA诱导PS转移至内皮细胞表面而不会破坏细胞完整性这一发现除了证实了最初的体内结果和发明者的治疗方法外，还具有重要的含义。已知人、牛和小鼠内皮细胞在正常条件下都是PS阴性的。任何过去证明的PS表达通常与细胞损伤和/或细胞死亡相关。这不是本研究中的情形，其中保持了正常的生存能力。这表明了肿瘤血管内皮中的PS移位是通过与细胞损伤无关的生化机制介导的。这被认为是形态完整的内皮细胞中PS表面表达的第一个证明和PS表达能与凋亡途径分离开的第一个指征。就本发明的可操作性而言，这些观察再次证实了PS是可维持的、而非瞬时的肺瘤血管标记物和干预治疗的适当候选剂。2.用凝血酶诱导还观察到凝血酶增加了PS的表达，尽管增加的程度与11202引起的不同。此数据还是本发明发明者开发的PS表达的肿瘤诱导模型中完整的一部分正常组织中凝血酶诱导的PS表面表达还将进一步诱导凝血，因为PS表达对凝血起始复合物的装配能起到协调作用。已知肿瘤环境是血栓形成前状态的，从而使肿瘤血管倾向于凝血(美国专利5，877，289)。因为凝血酶是凝血级联反应的产物，它存在于肿瘤血管中。事实上，凝血酶的存在诱导了VCAM的表达，使发明者能将VCAM开发成为肿瘤血管的可靶向标记(美国专利5，855，866;5，877，289)。因此目前显示凝血酶还诱导了PS表达的资料与用棵抗体和治疗缀合物靶向于氨基磷脂都相关，这还进一步解释了含组织因子的抗VCAM凝血配体的有利影响(实施例I)。3.氧化应激的其他药剂用存在于许多肿瘤微环境中的各种浓度的因子和条件处理体外小鼠bEnd.3或牛ABAE细胞24小时(Lichtenbeld等人，1996;Harris等人，1996),例如低氧/复氧、凝血酶、酸度、炎性细胞因子和过氧化氢(表ll)。通过检测mi-膜联蛋白V的结合对PS和阴离子磷脂的外在化进行定量。将膜联蛋白V结合的量与通过放线菌素D和TNFct的组合处理诱导了90-100。/。的细胞凋亡的细胞中的量相比较。放线菌素D和TNFcx在两种细胞类型上都诱导了每106个细胞上6.2pmol膜联蛋白V的结合(每个细胞结合3.8x106个分子)，与文献所报道的结果很相符(Rao等人，1992)。以此数值作为外在化阴离子磷脂的最高水平。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table>在表11中，所用细胞因子、生长因子和凝血酶的浓度是从文献值中选择的以便对人工培养内皮细胞具有最大刺激作用。由形态学上的外观、缺乏分离和缺乏台盼蓝的摄取判断这些浓度在试验期间(24小时)不会引起毒性。所用&02的浓度是在选定条件下不会引起细胞毒性的最大浓度。在只有生长培养基存在的条件下测定"I-膜联蛋白V的基本结合。在用放线菌素D和TNFoc联合处理诱导凋亡后测定最大PS暴露。显示了来自三项独立研究的双份试样的平均值。标准偏差小于5%。正如由膜联蛋白V或抗PS(9D2)抗体结合所判断的，未处理的细胞基本上无外在化的PS(表ll)。对于ABAE和bEnd.3细胞来说，单独存在生长培养基条件下的基本结合分别是O.44和0.68pmole1251-膜联蛋白V，这相当于ABAE和bEnd.3细胞最大结合的约7.1%和10.9%，与在相同条件下有约10。/。的细胞结合生物素化膜联蛋白V的有关发现一致。VEGF、HGF、FGF、TGF卜、PDGF、IL-6、IL-8和IL-10不将1251-膜联蛋白V的结合提高至未处理细胞的基础水平之上(表ll),GM-CSF也不。炎性介质(IL-la、IL-1p、TNFa和干扰素)引起了小的但可重复的PS和阴离子磷脂移位的增加，变动范围对于ABEB细胞来说是最高水平的5-8%，对于bEnd3细胞来说是最高水平的3-14%。低氧/复氧、凝血酶或酸性外部条件(pH6.8-6.6)诱导了中等高程度的PS和阴离子磷脂的外在化，变动范围包括对于ABEB细胞来说的最高水平的8_20%到对于bEnd3细胞来说的最高水平的17-22%。在用100-200jaM过氧化氢处理后观察到PS和阴离子磷脂移位的最大增加。正如用"5l-膜联蛋白V结合所进行判断的，此处理引起了PS在两种细胞类型中几乎完全(95%)的外在化(表ll)。按照免疫组化的判断，超过70。/。的ABAE和bEnd.3细胞结合生物素化的膜联蛋白V。用低氧/复氧、凝血酶、酸性、TNFa、IL-1或H202处理产生了PS和阴离子磷脂移位的内皮细胞在试验期间(24小时)保持附着于基质上，维持细胞-细胞接触，并保留了它们排除台盼蓝染料的能力。在诱导因子去除或培养条件回复正常后，在24-48小时后大部分细胞细胞中恢复了正常的PS和阴离子磷脂取向。这些结果表明，通过应用H力2直接产生或通过低氧/复氧、酸性、凝血酶或炎性细胞因子间接产生的中等氧化压力引发了PS和阴离子磷脂在存活内皮细胞上的瞬时移位。4.炎性细胞因子和低氧/复氧的組合作用在IL-1a或TNFa存在条件下将ABAE和bEnd.3细胞》丈在低氧/复氧环境中，观察到了PS和阴离子磷脂暴露的增加。在缺乏细胞因子的条件下，低氧/复氧使ABAE细胞上的PS暴露增加至用凋亡浓度的放线菌素D和TNFot处理细胞后所能达到的最高水平的15。/。-17.5%。在亚毒性浓度的IL-1oc或TNFot存在条件下，低氧/复氧使阴离子磷脂暴露分别增加到最大值的26%和33%(表ll)。与不存在低氧/复氧时细胞因子的作用的比较表明，细胞因子和低氧/复氧的联合对PS暴露具有大于简单加成的影响效果。在bEnd.3细胞中观察到相似的效果。因此，在肿瘤环境中，由低氧/复氧诱导的PS和阴离子磷脂的暴露可以通过炎性细胞因子和可能通过诸如酸性和凝血酶等这样的其他刺激所放大。嗜中性粒细胞在该过程中可能起着作用。这些体外研究显示了体内肿瘤内皮细胞上PS暴露的机制。它们表明了多种因子诱导了内皮细胞上PS暴露而不引起细胞毒性，它们摹拟了体内肿瘤中的条件。低氧随后复氧、酸性和凝血酶显著增加了存活内皮细胞上PS的暴露。炎性细胞因子(TNFoc和IL-lot)也引起了微弱但明确的PS暴露的诱发。这些条件有可能是体内肿瘤的主要诱发性刺激，因为i)PS阳性内皮在坏死区内和周围是普遍的，在此通常可以观察到低氧、酸性、形成血栓的血管和浸润的宿主白细胞；ii)低氧/复氧放大了TNFot和IL-1对体外内皮细胞的微弱PS暴露活性，此发现与肿瘤体内状况相关，其中低氧和分泌细胞因子的肺瘤和宿主细胞共存；iii)已报道低氧/复氧和凝血酶通过激活NADPH氧化酶样膜酶而在内皮细胞中产生了反应性氧类(R0S)(Zulueta等人，1995)。恶性细胞产生的ROS可能造成内皮细胞损伤(Shaughnessy等人，1989)。过氧化氢是目前研究中发现的人工培养内皮细胞上PS暴露的最强诱导剂，为ROS的参与提供了间接的支持。外在化的PS提供了一个凝血因子聚集和装配的阴性磷脂表面。这可能造成很久以来所认识到的肿瘤内皮上的前凝血状态。PS还为辅助白细胞浸润入肿瘤的循环性巨噬细胞(McEvoy等人，1986)、T淋巴细胞(Qu等人，1996)和多形核白细胞提供了附着位点。活化巨噬细胞、多形核白细胞和血小板对肿瘤内皮的PS的粘附可能导致了反应性氧种类的更多分泌，并进一步增强了PS的暴露。5.抗体与经仏02处理的HUVEC和MDA-MB-435细胞的结合通过流式细月包术来分析3G4抗体与经H202处理和未处理的HUVEC和MDA-MB-435细胞的结合(图5A)。如上文阐述的建立HA处理条件以诱导质膜外表面上的阴离子磷脂暴露。在用H力2处理前没有一种细胞类型结合可检测水平的3G4。在用H202处理后，用3G4染色随后用FITC-抗小鼠IgG染色的细胞的平均焚光强度比用BBG3处理随后用第二级试剂处理的细胞高大约10倍。经11202处理的细胞不被碘化丙锭染色，这表明它们的外膜是完整的。通过由阴离子磷脂制备的脂质体，而不是由中性脂质制备的脂质体，阻断了3G4结合，这表明3G4结合细胞的阴离子磷脂。为了确定3G4抗体在细胞表面上的分布，将经H202处理的HUVEC和MDA-MB-435细胞通过间接免疫焚光用3G4染色，并使用荧光显微镜术检查(图5B、图5C、图5D和图5E)。3G4抗体染色经HA处理的HUVEC和MDA-MB-435细胞的质膜的分散区域。细胞膜的染色区域出现小的表面泡(图5C、图5E),类似于在用11202处理的内皮细胞上观察到的"膜泡"(Hastie等人，1997;vanGorp等人，2002)。经仏02处理的细胞不被对照抗体BBG3染色(图5B、图5D),这显示3G4与细胞的结合是抗原特异性的。使用经FITC标记的膜联蛋白A5观察到相同的染色模式。当加入11202后l小时进行检查时，3G4阳性的经H202处理的细胞不显示核浓缩的形态学征兆，这与下述报道一致在内皮细胞中过氧化物诱导的膜起泡与谷胱甘肽氧化相关，而不是细胞凋亡，并且可以是可逆的(vanGorp等人，2000)。因此，这些发现表明，3G4抗体结合在HUVEC或MDA-MB-435细胞表面上通常不存在并且在用11202处理细胞时暴露在细胞表面上的阴离子磷脂。实施例VIII膜联蛋白缀合物的抗肿瘤作用氨基磷脂和阴离子磷脂是肺瘤血管系统的稳定标记物，这一惊人的发现意味着抗体-治疗剂构建体可用于癌症治疗中。除了利用抗体作为靶向剂之外，膜联蛋白和其他特异的结合蛋白质也可用于将治疗剂特异递送至肿瘤血管。以下结果显示了体内施用膜联蛋白-TF构建体所产生的抗肺瘤作用。A.方法制备膜联蛋白V-tTF缀合物并施用于患实体瘤的nu/nu小鼠。由人HT29结肠直肠癌细胞形成肿瘤，所形成的肿瘤至少约l.2cm3。静脉内施用膜联蛋白V-tTF凝血配体(1Qpg)并使其循环24小时。另外培养经盐水处理的小鼠作为对照动物。处理1天后，处死小鼠并放血，收获肿瘤和主要器官以供分析。B.结果发现膜联蛋白V-tTF缀合物在患HT29肿瘤的小鼠内诱发了特异的肿瘤血管凝血。在单次注射膜联蛋白V-tTF缀合物处理后的动物内约55%的肿瘤血管形成血栓。相反，在对照动物的肿瘤血管中只有极少血栓形成的迹象。实施例IX3SB抗PS抗体的抗肿瘤作用本实施例利用同种和异种肿瘤模型显示了抗PS抗体的抗肿瘤作用。此研究中所用的3SB抗体结合PS(和PA)，但基本上不与PE反应。此抗PS抗体引起肿瘤血管损伤，伴随着血栓形成和肿瘤坏死。首先利用3SB抗体在同种和异种肿瘤模型中检测抗PS抗体的作用。对于同种模型来说，将lx1(T个小鼠结肠直肠癌Colo26细胞(获自IanHart博士，ICRF,伦敦)皮下注射入BALB/c小鼠的右侧。在异种模型中，通过在雄性CB17SCID小鼠右侧皮下注射lx107个细胞产生人Hodgkin，s淋巴瘤L540异种移植物。在处理前使肿瘤长至约0.6-0.9cm3大小。将20pg3SB抗PS抗体(IgM)、对照小鼠IgM或生理盐水腹膜内注射入患肿瘤的小鼠(每组4只动物)。每隔"小时重复此处理3次。每天监测动物，检查肿瘤和体重。如实施例I所述计算肿瘤体积。当肿瘤长至2ci^时处死小鼠，或者如果肿瘤显示出坏死或溃疡的迹象则更早一些时间处死小鼠。用3SB抗PS抗体进行的处理有效抑制了同种和异种肿瘤的生长。抗PS抗体引起肺瘤血管损伤，伴随着血栓形成和胂瘤坏死。血凝块的出现和被堵塞血管周围肺瘤块的瓦解是明显的。定量地说，3SB抗PS抗体疗法在患大Colo26和L540肺瘤的小鼠内抑制了肿瘤的生长，抑制程度高达对照肿瘤体积的60%。在用盐水或对照IgM处理的小鼠中未发现肿瘤生长的延緩。在用抗PS抗体处理的小鼠内未观察到毒性，正常器官保持未改变的形态，与未处理的或盐水处理的小鼠无区别。在首次处理24小时后肿瘤开始消退，在接着的6天内肿瘤体积继续减小。在同种和无免疫应答的肿瘤模型中都观察到了此结果，表明这一作用是由不依赖于免疫状态的机制所介导的。而且，与患大于1500mi^的肿瘤的对照小鼠相比，肿瘤的减轻与动物警觉性的增加和通常的健康外观有关。肿瘤的再生长发生在首次处理7-8天后。用抗PS处理L540胂瘤获得的结果更多的是由以下原因造成的。值得注意地，尽管事实上在L540肿瘤中PS染色阳性的血管百分数小于在HT29和NCI-H358胂瘤中的，但在L540肿瘤处理中确实出现了肿瘤坏死。这意味着在处理其他肿瘤类型时可能产生更快速的坏死。此外，通常选择L540作为实验模型，因为它们提供了清楚的组织学切片且事实上已知它们对坏死具有一定的抗性。实施例X抗阴离子磷脂抗体(9D2)的抗肿瘤作用此实施例证实了可结合PS和其他阴离子磷脂的9D2抗体在体内抗肿瘤研究中的作用。将可结合阴离子磷脂的高剂量(>150|ag)大鼠抗体9D2注射入患H358肿瘤的棵鼠中。免疫定位研究显示了它强烈地定位于肿瘤内皮(4+)，尽管由于高剂量而观察到9D2与正常血管有某些低水平的非特异结合(正如对无关特异性对照IgM抗体所观察到的一样)。当将9D2腹膜内注射入患L540肿瘤的SCID小鼠中以产生腹水时，肿瘤坏死并分解。将对照抗体(MK2.7，大鼠IgG)注射入患L540肿瘤的SCID小鼠时，未观察到类似的效果。随后更精确地测定9D2抗-PS抗体对体内L540肿瘤生长的影响。当肿瘤达到200-250m1(0天)时开始进行处理。在第0天至第7天，将约150MgIgM(200iil上清液)或200ja110%DMEM腹膜内注射入小鼠。在第7天至第22天，将约300MgIgM(400jal上清液)或400jal10%DMEM腹膜内注射入小鼠。第22天是处理的最后一天，并在这天处死小鼠。如表12中所示，从第10天到第22天，肿瘤的生长通常被抑制约40%-50%。在结束研究的时候，被处理组中只有4只小鼠的肿瘤体积大于2000ial，而对照组中9只均如此。表12抗PS抗体对体内L54O肿瘤的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table>在另一体内实验中，在肿瘤细胞注射后45天内研究大鼠抗PS抗体对CB17SCID小鼠中的L540肿瘤生长的影响。每天用300jig抗PS抗体腹膜内注射处理这些患肿瘤的小鼠，或每天腹膜内注射300ja110。/oDMEM作为对照。与对照相比，被处理组中肿瘤治疗的各种参数明显较好(表13)。表13抗PS抗体对体内L540肿瘤的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table>'在治疗后的指定时间(60天与90天)内在经处理的小鼠中肿瘤太小以致不能检测2淋巴结中的转移在进一步的研究中，每周3次以100jLig的剂量将9D2抗体腹膜内注射入携带L540肿瘤的小鼠。每周两次用卡尺测量肿瘤的大小。与对照组相比较的所述抗肿瘤效果是显著的。实施例XI抗PS抗体3G4的抗肿瘤作用本实施例证实了利用抗PS抗体3G4在同种和异种肿瘤模型中另外的抗肿瘤效果。此研究中所用的3G4抗体是可结合PS和其他阴离子磷脂的IgG抗体(实施例IV)。A.动物肿瘤研究的方案在同种和异种肿瘤模型中检测3G4的作用。用于动物肿瘤治疗研究的一般方案进行如下。除非特别提及具体的差异，否则这就是本申请研究中所用的方案。动物获自CharlesRivers实验室。小鼠为4-5周龄，雌性，C.B-17SCID或FoxChaseSCID小鼠。将小鼠关在高压灭菌的笼子里，喂无菌食物和水，进行无菌处理。所有步骤都在层流净化罩内进行。让小鼠适应1周，然后做耳垂标记并从尾静脉处取血样(约75-lOO)a1)，用ELISA检查泄漏程度。任何在泄漏ELISA试验中失败的小鼠都不能用于实验中。在耳垂标记和取血样2-3天后将肿瘤细胞同位注射入小鼠乳房脂垫(MFP)或皮下注射入小鼠右侧。在同位模型中，通常将O.1mlDMEM中的1x107个细胞注射入麻醉小鼠的MFP处。腹膜内注射O.075ml小鼠混合物麻醉小鼠。小鼠混合物是5ml氯胺酮(100mg/ml)、2.5ml曱苯逸"秦(20mg/ml)、1ml乙酰丙溱(10mg/ml)、llml无菌水。剂量是每20-30克体重通过腹膜内途径注射O.1ml，持续时间为30分钟。一旦小鼠被麻醉，即通过它对脚趾/足钉无反应来检查，则使小鼠左侧位躺并用70%的酒精擦拭头正后方和右前臂/后背周围区域。在右前臂(侧胸)正后方开一2-3mm切口，揭开皮肤片就显露出白色的脂垫。用lml注射器和27号针头将0.1ml细胞注射入脂垫中，在脂垫中产生一大泡。用9mm的无菌伤口夹闭合切口。将小鼠放回笼子中并观察直至其从麻醉中苏醒并能活动。检测手术后的健康状况，如果观察到任何疼痛的迹象，在小鼠饮用水中添加对乙酰氨基酚(0.24mg/ml)和可待因(0.024mg/ml)。l周后去除伤口夹。使用此方法将细胞准确的放入选定的位置而不会进入皮下区域。在14-15天内肿瘤体积(LxWxW)将约为200ia1，收获率基本上为100%。在皮下模型中，通常用O.2ml中的lx107个细胞注射小鼠。不用麻醉小鼠，但通过牢固夹紧暴露右侧的小鼠皮肤而将束縛住。用lml注射器和23号针头将1x107个细胞(200p1)注射入小鼠皮肤正下方，然后将看到一大泡。看到少量的液体从注射位点处渗漏的现象并不罕见。在皮下注射退针时可以采用转动的方式来减少此渗漏。通过LxWxH检查肿瘤体积。在灌注方案中，用溶于O.2ml盐水中的1000U肝素静脉内注射小鼠。然后通过腹膜内注射O.1ml小鼠混合物使其安静。一旦小鼠足够安静(通过它对脚趾/足针刺无反应来检查)，即打开其胸腔以暴露心脏和肺。将附着于管子和灌注泵上的30号针插入左心室。将右心室剪开使血液能滴出来。以lml/分钟的速度泵入盐水12分钟。结束灌注后，取下针头和管子。切下组织以供进一步研究，可以是免疫组化或病理学研究。B.肿瘤治疗结果对于同种模型，使用MethA小鼠纤维肉瘤细胞。在一异种模型中，将人MDA-MB-231乳房肿瘤细胞接种于乳房脂垫中。在另一异种模型中，通过注射细胞并使肿瘤在处理前长到超过500mm3大小来产生大的人Hodgkin，s淋巴瘤L540异种移植物。将100jig3G4抗PS抗体(IgG)腹膜内注射入携带肿瘤的小鼠(每组10只动物)，与对照相对应。每周重复处理3次。每周监测动物两次以检查肺瘤的状况。用3G4抗PS抗体处理有效抑制了同种和异种肿瘤二者的生长。抗体引起了肿瘤血管损伤、局部的血栓形成和肿瘤坏死。同种MethA肺瘤细胞的治疗尤其成功，而对生长于乳房脂垫中的人MDA-MB-231乳房肿瘤细胞的处理也造成了肿瘤消退。即使在携带已知抗坏死的大L540肿瘤的小鼠内，与对照相比，3G4抗体治疗也抑制了肿瘤的生长。在对照小鼠中未发现肿瘤生长的延緩。在用抗PS抗体处理的小鼠中未观察到毒性。还用MD-MBA-435s细胞产生了肿瘤并如上所述进行处理。用3G4抗体处理也有效抑制了这些胂瘤的生长。对大的L540肿瘤，MDA-MB-231和MD-MBA-435s肺瘤细胞处理60天也是有效的。抗体引起了肿瘤血管损伤、血栓形成和坏死并延緩了肿瘤生长，且没有毒性的迹象MD-MBA-435slucerifase细胞获自AngelsSierraJimenez博士，Barcelona,西班牙，并培养于IO%DMEM中。如上所述将肿瘤细月包注射入小鼠，在注射2周后，检查肿瘤并记录体积。用按照实施例XIX产生的3G4抗体和嵌合3G4抗体对携带肿瘤平均体积(200mm3)相似的小鼠进行处理，与对照相对比。在第15天通过腹膜内注射(800jag)开始进行处理，每2-3天继续注射200Mg，直至最终在第35天注射400pg。在注射当天检查胂瘤体积和小鼠体重。处死小鼠并用盐水灌注12分钟。取下器官和肿瘤，在液氮中速冻并将肿瘤切片以供免疫组化分析之用。此研究显示了，与对照相比，3G4抗体和嵌合3G4抗体二者都有效地延緩了肿瘤的生长。实施例XII抗PS抗体针对CMV的抗病毒作用通过从肿瘤血管到病毒感染领域的惊人转变，发明者紧接着推断针对氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体还有可能发挥抗病毒作用。本实施例的确证明了这一点，首先将3G4抗体用于治疗巨细胞病毒(CMV)感染。A.方法1.受CMV感染的细胞的体外治疗如前文所述(Bresnahan等人，1996)，以感染复数为0.Ol用表达绿色荧光蛋白(GFP)的人CMVAD169感染6孔板中汇合的人二倍体包皮成纤维细胞(HHF-R2)单层。简而言之，以每孔lml的总体积将细胞与病毒在37t:孵育90分钟。在感染期间，每30分钟轻轻摇动平板一次。感染后，去除细胞上清液并在每个孔中加入DMEM/10o/QFBS/pen-strep(2ml/孔)。将3G4或同种型匹配的对照抗体GV39G(100jag/ml和50mg/ml)的稀释液加入孔中。将感染后的细胞在3rC孵育共19天。每3天更换一次各孔中的培养基和抗体。在第19天，收获各孔中的细胞和上清液并冻存于-80'C直至进行噬斑检测。2.荧光显微镜检查法重组CMV在SV40启动子调控下表达GFP。因此，在荧光显微镜下被感染的细胞呈现绿色。在这些研究中，在第2、3和9天用焚光显微镜观察经抗体处理的受CMV感染的细胞。3.噬斑测定法用标准方案进行噬斑测定法。简而言之，在37。C快速融化冻存细胞的悬浮液并在1000rpm离心l分钟去除碎片。将不同稀释度的细胞上清液加入6孔板中的亚汇合HHF-R2细胞单层上，并在37。C孵育细胞90分钟(每30分钟轻摇平板一次)。感染后，去除细胞上清液，并换入2mlDMEM/10%FBS。在第4天，去除各孔中的上清液，并用0.01%低熔点琼脂糖/DMEM/l(T/。FBS覆盖细胞。感染后将平板在37。C共孵育14天。在第14天，用10%緩冲福尔马林固定被感染的细胞单层，并用亚曱蓝染色使噬斑显现。B.结果1.3G4抑制CMV的病毒扩散为了研究3G4对CMV感染和复制是否具有抑制作用，在以低感染复数加入CMV之前用3G4预处理汇合的人成纤维细胞。这些研究中所用的CMV表达绿色荧光蛋白(GFP)。因此，在荧光显微镜下观察时被感染的细胞呈现绿色。在用50iag/ml和100jag/ml抗体处理的第3天，在未处理孔和用3G4或同种型匹配的对照抗体GV39G处理的孔中都有单个被感染的细胞。因此，用3G4处理成纤维细胞未显示出显著抑制病毒进入细胞。不过，在第9天，在3G4处理孔和对照GV39G处理孔之间被感染细胞数目有了显著的不同。当病毒传播至对照孔中约80%的细胞单层时，在3G4处理孔中病毒还局限于最初的个别被感染细胞内。因此，3G4限制了CMV从最初的^f皮感染细胞向周围细胞的传播。用100Mg/ml和50jjg/ml进行处理的细胞都观察到了病毒传播的这种抑制。2.病毒抑制是抗体浓度依赖型的为了确定在低感染复数下发挥抗病毒作用所必需的3G4浓度，用不同浓度的3G4和对照抗体GV39G处理被感染的细胞。用100jag/ml和50iug/ml3G4观察到细胞间传播的完全抑制。当用25、12.5和6.25ng/ml3G4处理细胞时，有渐增数目的GFP阳性受CMV感染的细胞。尽管在这些低浓度下3G4不会完全阻止病毒从原来的被感染细胞中向外传播，它仍然具有有意义的抗病毒作用，因为与GV39G处理的对照孔相比，在3G4处理孔中观察到较少的GFP-阳性受CMV感染的细胞。3.低感染复数下病毒负荷的定量通过进4亍噬斑测定法测定抗体处理后的病毒负荷来对3G4的抗病毒作用定量。对照包括未处理细胞、GV39G抗体和利用C44抗体(抗秋水仙碱的小鼠IgG2a同种型抗体)的附加抗体对照。用100ug/ml3G4处理被感染的细胞(感染复数-0.01pfu/细胞)导致病毒滴度与对照(经GV39G处理的细胞)相比显著下降6个log！。。此抑制作用说明约99.9999%的病毒复制被抑制。在浓度为50jag/ml时，用3G4处理导致了与GV39G-处理相比病毒滴度下降3.5个log:。。使用25mg/ml和12.5jag/ml3G4，结果仍然是显著的，甚至在6.25jag/ml时仍能观察到抑制作用。4.高感染复数下病毒负荷的定量对以高感染复数3被感染的成纤维细胞进行3GA处理还导致了病毒滴度显著下降。在浓度为100iag/ml时，用^4处理导致了与对照(经GV39G处理的细胞)相比病毒滴度显著下降5个logi。。在浓度为S0pg/ml时，与GV39G相比3G4抑制病毒复制3个log10。5.晚期复制的抑制为了确定CMV复制周期的哪一个阶段被3G4阻断，进行定时的附加研究。为此，在感染后不同的时间点将3G4添加入以高感染复数被感染的成纤维细胞中。用标准噬斑测定法对病毒负荷(在细胞和上清液中)定量。感染长达24小时后添加3G4导致病毒滴度有5-6个log!。的下降。不过，当3G4的添加延迟至48小时时，3G4的抑制作用降低到2个logm而当添加延迟至72-96小时时，抑制作用进一步降低。这表明3G4干扰了在感染后24-48小时之间发生的CMV晚期复制。因此，3G4未显著干扰感染或者早早期或早期基因表达。它在稍晚的病毒复制中发挥作用，如在晚期基因表达、病毒DNA合成、病毒包装或流出中。实施例XIII抗PS抗体针对RSV的抗病毒作用除了实施例XII中所显示的针对CMV的显著抗病毒作用外，本实施例证明了可使用三种不同的抗PS抗体抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的复制。A.方法1.受RSV感染的细胞的体外治疗将A-549细胞在三个Costarl2孔组织培养板中培养至10()o/Q汇合。将200uL极限必需Eagle培养基加入所有的孔中。在各板的9个孔中加入抗磷脂抗体(Ab)(100jLig/100pl)，30分钟后以感染复数为1用RSV长链100Ml感染最初9个孔中6个孔的细胞。剩下3个孔作为未感染的、抗体处理孔。以上述相同感染复数的RSV感染无抗体的另三个孔。各板用于检测三种不同的抗体3G4、3SB和1B9(实施例IV)。将细胞在5。/。CO2中40X:孵育2小时，然后在各个孔中加入600jal培养基至完整的lmL体积。在同一条件下保持A-549细胞平板作为对照。在感染后4、24和72小时收集上清液。在各时间点，从各板的4个孔采样一个孔中为只用抗体处理的细胞，两个孔具有经抗体处理/受RSV感染的细胞，而另一个孔中仅有被RSV感染的细胞。将样品冻存于-80X:直至噬斑测定法。2.噬斑测定法如前所述进行噬斑测定法(Kisch等人，1963;Graham等人，1988)。简而言之，将冻存细胞的细胞上清液在37。C迅速解冻。从未稀释的细胞上清液制备三份10倍稀释液10—\10-2和10—3。将各稀幹液100m1加上未稀释样品接种于80。/。汇合的Hep-2细胞系平板中，均一式三份。将平板放置于5%(:02、4(TC培养箱中5天。在第5天，将平板显色并用苏木精和伊红染色来展现各个孔中的噬斑。用解剖显微镜对噬斑进行计数来计算RSV病毒负荷pfu(噬斑形成单位)/mL。B.结果用3SB或1B9处理受RSV感染的细胞导致病毒复制发生对数式减少。用3G4处理感染细胞时，抗病毒效果更显著。用3G4处理导致了病毒滴度降低2个log！。。抑制作用比用CMV观察到的低，这很可能是因为3G4浓度低之故(25-50Mg/ml)。实施例XIV单链抗PS抗体鉴于本文所述的抗PS抗体的许多用途，包括单独作为抗肿瘤剂、作为靶向剂将附着的治疗剂递送至肿瘤以及作为抗病毒剂，本实施例描述了适于产生单链(scFv)抗PS抗体的技术，即其中vh和v:^结构域存在于单一多肽链中，通常通过肽接头连接。A.噬菌体抗体文库的制备将细菌文库(约lx1(T个克隆)的次级原种接种于含IOOjLig/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的100ml^TY中。在"。C振荡培养至600nm的OD值达到O.5。加入1013pfu的M13K07辅助噬菌体，在不摇动的条件下于37。C水浴中孵育30分钟。将被感染的细胞在3S00g离心10分钟。将沉淀重悬于含100ng/ml氨千青霉素和75pg/ml卡那霉素的200ml2xTY中并于30'C振荡培养过夜。将培养物于IO，800g离心10分钟。向上清液中加入1/5体积的PEG/NaCl，混合均匀并在4。C放置1小时。然后IO，800g离心30分钟。将沉淀重悬于40mlPBS中并加入8mlPEG/NaCl。混合并在fC放置20分钟。然后将其于10，800g离心10分钟以并吸出上清液。沉淀重悬于2ml10%人血清中，在微量离心管中ll，600g离心10分钟以去除大部分残留的细菌碎片。为了进行预淘选，将10。/。人血清中的噬菌体抗体文库加入用PC包被的平亚中并室温孵育60分钟。B.生物素化脂质体的选择将2Qlamol磷脂酰肌醇和20iimol生物素化磷脂酰丝氨酸溶于lOml己烷中。用旋转蒸发器干燥此溶液使其在烧瓶表面形成一薄层。加入2mlPBS并于4。C水浴超声处理30分钟。然后在存在10。/。人血清的条件下混合100m1噬菌体scFv和100m1生物素化脂质体，并在室温轻轻旋转l小时。通过加入600jul2.5%酪蛋白/O.5。/。BSA用100jal链霉抗生物素蛋白M-280dynabeads于室温进行封闭30分钟。用MPC-E(磁性颗粒浓缩仪，来自Dynal)4-5分钟使珠子从封闭緩冲液中分离出来。将珠子重悬于100ulpbs中。将ioojjl封闭后的链霉抗生物素蛋白Dynabeads加入结合了生物素化抗原的噬菌体中并于室温轻轻旋转15分钟。用MPC-E5分钟完成分离并倒出上清液。用lmlPBS漂洗5次。每一次漂洗时，都将珠子重悬浮并用MPC-E沉降。最后，通过重悬于300p1100mM三乙胺中30分钟将噬菌体从珠子上洗脱下来。加入150iLi1lMTrispH7.4中和。用MPC-E再次分离珠子。用150jal噬菌体上清液感染10ml对数期的TGl细菌。在20jig/ml氨苄青霉素存在的条件下将IOml培养物于3rc振荡培养l小时。加入氨苄青霉素至终浓度50Mg/ml并再振荡培养l小时。在此培养物中加入1013pfuM13辅助噬菌体,转移到含IOO|ig/inl氨苄青霉素的100ml2TY培养基中并于7。C振荡培养1小时。加入卡那霉素至终浓度IOOjag/ml并于3(TC振荡培养过夜。再重复噬菌体制备步骤和选择步骤3-4次。C.单克隆单链抗体ELISA将平板上的HB2151单菌落(经过4轮筛选后)接种于96孔板中含100lag/ml氨节青霉素和l。/。葡萄糖的500ja12xTY培养基中并于37'C振荡(300rpm)培养过夜。从此平板中取5jal转移到每孔装有含100jug/ml氨苄青霉素的500u12xTY培养基的另一96孔板中并于37'C振荡培养3小时(0副0=0.9)。在各孔中加入含IOOmg/ml氨千青霉素、10mMIPTG(终浓度lmM)的50jal2xTY培养基，30。C振荡培养过夜。1800g离心10分钟，并将100ju1上清液用于以下ELISA中。用以10jug/ml浓度(P664110rag/ml，溶剂是氯仿甲醇95:5)溶于乙醇中的PS包被96孔板(DYNEXIMMUL0N1B)。以相同方式用IOjjg/mlPC包被。这些平板在冷室内4。C挥发。在各孔中加入250ia12.5°/。酪蛋白，盖上平板并在37'C封闭1小时。用pbs漂洗孔3次，加入10。/。人血清100jj1/孔和含可溶性scFv的上清液100n1/孔并在37。C孵育60分钟。弃溶液并用PBS洗6次。在各孔中加入溶于5%酪蛋白/0.5%bsa-pbs(l:5000稀释)的9E10100jj1，37。C孵育1小时并用PBS洗6次。在各孔中加入100plHRP-山羊抗小鼠抗体(1:IOOOO稀释)，37。C孵育1小时并用PBS洗S次。在各孔中加入0.05%0PD100nl并显色5分钟。加入100jal0.18M112304终止反应并在O.D.490读数。将抗原阳性克隆在2xTYAG平板上划线并30'C培养过夜。挑出阳性单菌落接种于3ml2xTYAG培养基中并在3X:培养i:2小时。提取质粒并通过酶消化和PCR检查scFv基因插入片段。对具有正确大小插入片段的菌落进行测序。将具有正确大小插入片段的菌落培养于100mlhTYAG培养基中并37°。振荡培养至00600=0.5。将它们转移入900ml2xTYA中并培养至OD600=0.9。加入lMIPTG至终浓度1mM并于30。C振荡培养过夜。用如前所述的相同ELISA方法检查上清液。用Ni++-琼脂糖亲和层析从周质部分纯化scFv蛋白质。D.结果淘选4轮后，以下克隆在PS平板上给出了有希望的ELISA信号并且具有正确大小的插入片段3E5、3A2、G5、C8、E4和4D5。这些克隆已被亚克隆，其中E4给出了5个阳性亚克隆，而4D5给出了5个阳性亚克隆(表14)。表14PS平板上的ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table>阳性克隆一旦被确定，就进行测序。克隆3A2的scFv核酸和蛋白质序列分别见SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。大量培养阳性克隆并用镍琼脂糖亲和层析纯化scFv。已用Phast-凝胶电泳法获得了纯化的scFv。实施例XVPE结合性肽衍生物的合成本发明涉及用于治疗肿瘤和病毒疾病的示范性PE结合肽衍生物和缀合物的设计和合成。示范性耐久霉素衍生物的结构通过下列描述产生。A.DLB将溶于O.387ml0.1MNaHC03水溶液的0.5mg(0.25pmole)耐久霉素加入O.113mg(0.25nmole)NHS-LC-生物素(Sigma)中。将反应混合物于室温孵育1小时然后4'C过夜。将样品加到氧化硅柱上，用O.1%三氟乙酸(TFA)清洗，用O.1%TFA和70。/。CH3CN洗脱。收集洗脱液并离心浓缩。总产量是O.5mg。B.DIB将溶于O.286ml0.1MNaHC03水溶液中的0.5mg(0.25jumole)耐久霉素加入O.034mg(0.25jamole)盐酸2-亚氨基石克杂环戊烷(2-IT)中。将反应混合物室温孵育l小时。加入0.13mg(0.26jamole)碘乙酰-LC-生物素(Pierce)并将反应液室温孵育1小时并4。C过夜。将样品加到氧化硅柱上，用0.1%TFA清洗，用0.1%TFA和70。/。CH3CN洗脱。收集洗脱液并离心浓缩。总产量是O.5mg。C.(DLB)4NA将l.9mg(0.94jLimole)耐久霉素溶于O.5ml0.1MNaHC03水溶液中。在其中加入溶于200jnl二曱基曱酰胺(DMF)的0.4mg(0.88jamole)NHS-LC-生物素(Sigma)中。将混合物室温赙育4小时。将lml中的10mg(0.17inmole)中性抗生物素蛋白(NA)加入反应混合物中，室温孵育2小时并4。C过夜。将反应混合物加到PBS緩冲液平衡的G25柱(体积50ml)上。收集各级分并用SDSPAGE(phast凝胶)进行分析。将含蛋白质的级分(7-16)合并在一起，通过O.22jLim滤器过滤除菌并通过检测280nm处的吸收值测定浓度。总产量是5.1mg。然后用FPLC分部收集样品。收集相应于以下级分的三个峰峰l:[(DLB)4NA]3(级分17-23);峰2:[(DLB)4]2(级分24-33);和峰3:(DLB)4NA(级分35-48)。所有这些样品均通过O.22jam滤器过滤除菌。获得的终产量是0.34mg[(DLB)4NA]3;0.59mg[(DLB)丄;和l.41mg(DLB)贝。D.(DLB)4NA-F将PBS緩沖液中的O.61mg(DLB),NA加入溶于DMF的O.005mgN-羟基琥珀酰亚胺荧光素(NHS-荧光素)(Sigma)中。将混合物室温孵育l小时。然后将反应混合物分级分离于PD10柱(10ml)上。(DLB),M-F洗脱于含蛋白质的级分(3-4)中，将它们合并在一起并通过O.22mm滤器过滤除菌。总产量是O.5mg。E.(DIM)nHIgG人IgG(HIgG)首先如下纯化:将l.3mlHIgG(包括IOOmg/mlHIgG、22.5mg/ml甘氨酸和3mg/ml清蛋白，溶于含lmMEDTA的硼酸盐緩沖液中，pH9)加到FPLC(S200，250ml)柱上。收集级分并在phast凝胶上用SDSPAGE进行分析。将含单体^0的级分(21-32)合并在一起，通过O.22ym滤器过滤除菌。按280nm处的吸收值测定的总产量是lllmg。将纯化的HIgG(55mg溶于13ml硼酸盐緩沖液中，pH9)加入溶于DMF的1.003mgSMCC(Pierce)0.5ml中。混合物室温孵育l小时。同一时间，将含6mg耐久霉素的另一反应混合物(3lamole，溶于O.5ml0.1MNaHC03中)和O.413mg2-IT(3jamole;在O.1MNaC03中)室温孵育1小时。反应结束后，将两反应混合物合并并室温孵育2小时，4。C过夜。反应产物在phast凝胶上用SDSPAGE进行分析。将反应产物加样到硼酸盐緩沖液(pH9)中的FPLC柱上。合并相应于三体(5-14)、二体(15-24)和单体(25-37)的FPLC级分并通过O.22jam滤器过滤除菌。单体的总产量是54.6mg。在每个HigG分子上附着了5-7个耐久霉素基团。F.(DIMLHIgG-F将lmg(DIM)nHIgG(0.7ml)加入溶于DMF的NHS-荧光素5|i1中。反应混合物室温孵育1小时并用PD-IO柱脱盐。合并含蛋白质的级分(2-3)并通过O.22ym滤器过滤除菌。总产量是O.9mg。G.(DIM)nHlgG-B和[(DIM)nHIgG]2—B为了合成生物素化的[(DIM)JHgGL衍生物，将O.66mg(lml)[(DIM)JHgG]2加入溶于DMF的lmg/mlNHS-LC-生物素8|i1中。反应混合物室温孵育1小时并用PD-10柱脱盐。合并含蛋白质的级分(3和4)并通过O.22jim滤器过滤除菌。终产量是O.46mg。以相同方式进行单体(DIM)JIIgG的生物素化。简而言之，将l.06mg(0.75ml)(DIM)JIgG加入溶于DMF的lmg/mlNHS-LC-生物素12p1中。反应混合物室温孵育l小时，然后用PD-10柱脱盐。合并含蛋白质的级分(3和4)并通过O.22jnm滤器过滤除菌。终产量是O.62mg。H.(DIB)4NA将2mg(0.99jumole)耐久霉素溶于O.5ml0.1MNaHC03水溶液并加入O.136mg(0.99ymole)2-IT中。将反应混合物室温孵育l小时。之后，力口入O.483mg(0.95jamole)硪乙酰-LC-生物素(Pierce)并将反应液室温孵育l小时。加入溶于lml水中的10mg(0.17pmole)中性抗生物素蛋白并4。C孵育过夜。用FPLC分部收集反应混合物。收集并合并三个不同的峰峰l:[(DIBhNA]3(级分17-23);峰2:[(DIBhNAL(级分24-33);和峰3:(DIB)4NA(级分35-48)。所有这些样品均通过O.22nm滤器过滤除菌。获得的总产量是0.87mg[(DIB)贝]"1.25mg[(DIB)4NA]2;和l.83mg(DIB)贝。I.(DIBhNA-B将O.023mg(0.3|imole)(DIB)贝加入O.9ygNHS-LC-生物素(Pierce)中。反应液室温孵育l小时，然后用PD-10柱脱盐。总产量是O.04mg。J.DS-1将溶于O.5ml0.1MNaHC03水溶液的5mg(2.5jumole)耐久霉素加入O.319mg(2.6Mmole)1，3丙磺酸内酯中。将混合物4。C孵育过夜。将样品加到二氧化硅柱上，用O.1%TFA清洗，用0.1%TFA和70%CH3CN洗脱。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是5mg。K.DS-2将溶于O.3ml0.1MNaHC03水溶液的lmg(0.497jumole)耐久霉素加入O.072mg(0.523nmole)2-IT中。将反应混合物室温孵育l小时。力口入O.125mg(0.49ymole)SBF-氯化物(Pierce)。反应混合物室温孵育1小时并4。C过夜。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是lmg。L.DS-3将溶于O.4ml0.1MNaHC03水溶液的lmg(0.497jamole)耐久霉素加入O.109mg(0.592jamole)2-磺基苯甲酸环酸酐中。将反应液室温孵育1小时并4。C过夜。在二氧化硅柱上纯化得到的肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是lmg。M.DS-4将溶于O.5ml0.1MNaHC03水溶液的0.25mg(0.124jumole)耐久霉素加入O.017mg(0.124jamole)2-IT中。将反应混合物室温孵育1小时。然后将混合物加入O.049mg(0.124jamole)Ellman，s试剂中。反应混合物室温孵育2小时并4。C过夜。将250ju11mg/ml4-氨基-5-羟基-2，7-萘二磺酸单钠盐水合物加入100ju11mg/ml2-IT中。反应液室温孵育l小时。将50jlil此反应混合物加到前述反应液中并室温孵育1小时。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。N.DS-5将溶于O.5ml0.1MNaHC03水溶液的5mg(2.5iamole)耐久霉素加入O.356mg(2.6ymole)1，3-丙磺酸内酯中。将混合物4。C孵育过夜。将样品加到二氧化硅柱上，用0.1%TFA清洗，用O.1%TFA和70%CmCN洗脱。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。总产量是5mg。0.DC-1将溶于O.5ml0.1mNaHC03水溶液的0.25mg(0.124mmole)耐久霉素加入O.017mg(0.124mmole)2-IT中。将反应混合物室温孵育1小时。然后将混合物加入O.049mg(0.124|imole)Ellman，s试剂中。混合物室温孵育2小时并4'C过夜。在二氧化硅柱上纯化肽。收集洗脱液并在减压的条件下离心浓缩。实施例XVI耐久霉素衍生物特异性结合PE本实施例证明了实施例XV中合成的耐久霉素衍生物对PE是特异的，因此通过与细胞不渗透剂连接可用作特意的靶向剂或抗病毒剂并用于肿瘤和病毒疾病的治疗中。为了测试耐久霉素衍生物的特异性，尤其是与其他磷脂相比优先结合PE的特异性，进行了一系列的竟争性ELISAs。用以下方法测试耐久霉素衍生物与DIB或DLB竟争结合PE的能力。将PE和PC分别溶于乙醇中。终浓度为5iag/ml。将100jal加到96孔板(DYNEXIMMUL0N1B)的各孔中。使这些平板在冷室内4。C挥发。在各孔中加入250ia12.5%酪蛋白，盖上平板并在37。C封闭1小时。弃封闭緩沖液并在各孔中加入100y12.5%酪蛋白。在平板上加入耐久霉素化合物的系列稀释液，例如(DIM)JIgG、(DIBhNA、(DLB)JA、DS、耐久霉素和DIB。(DIM)JHgG起始浓度是l.4mg/ml，(DIB)^A起始浓度是800Hg/ml，而(DLB)4M的起始浓度是800ug/ml。将它们37°C孵育l小时并用PBS洗5次。在各孔中加入IOOia1HRP-链霉抗生物素蛋白(1:5000稀释)，37。C孵育1小时并用PBS洗5次。在各孔中加入O.05%OPD100Ml并显色5分钟。加入100y10.18MH2S04终止反应并在0.D.490读数。将得到的数据制表，然后作图。渐增浓度的耐久霉素衍生物使490nm处的吸收值下降，这表明耐久霉素衍生物与DIB和DLB竟争性结合磷脂酰乙醇胺。用进一步的ELISAs证实耐久霉素构建体的磷脂结合特性。将各试验脂类PS、PE、PI、CL、PC、PG、SM和胆固醇分别溶于乙醇中并用于包被ELISA平板。将耐久霉素化合物系列稀释液加到平板上。孵育和漂洗后，在各孔中加入次级检测药剂并用上述比色方法测定反应性。将耐久霉素生物素衍生物DIB和DLB的代表性磷脂结合特性作图。它显示出DIB和DLB对PE特异，而与PS、PI、CL、PC、PG和SM的结合是可忽略的或检测不到的。(DIM)nHIgG-B和[(DIM)nHIgG]2-B具有与DLB基本上相同的结合特性。尽管在高浓度DIB下只观察到极微弱的与PS的结合，这在本研究的范围内并没有很大的意义，因为在饱和及达到最大PE结合一半时的DIB浓度下未检测到与PS的结合。因此，耐久霉素构建体特异结合磷脂酰乙醇胺。还显示了血清对于耐久霉素衍生物与PE的结合没有显著的影响。这是通过在血清(BSA)存在和缺乏条件下耐久霉素生物素衍生物DLB与PE包被ELISA平板的结合来举例说明的，其中的结合特性未显示出明显的差异。实施例XVIIPE结合性肽衍生物的抗病毒作用除了如实施例XII和实施例XIII中所示的抗PS抗体介导的抗病毒作用外，本实施例证明了特异结合另一常见氨基磚脂(PE)的肽衍生物的抗病毒作用。A.方法1.受CMV感染的细胞的体外治疗如实施例XII中所述(Bresnahan等人，1996)以感染复数O.Ol用表达绿色荧光蛋白(GFP)的人CMVAD169感染汇合的人二倍体包皮成纤维细胞(HHF-R2)单层。以每孔1.5ml的总体积将细胞与病毒在37。C孵育90分钟。在感染期间，每30分钟轻轻摇动平板一次。感染后，去除细胞上清液并在每个孔中加入匿M/10o/oFBS/pen-strep(2m1/孔)。在添加病毒之前，将耐久霉素衍生物(DLB)4NA、(DIM)JHgG、DS-1、DS-2、DS-3和DC-1的不同稀释液加入孔中，然后进行感染。将感染后的细胞在37。C孵育共14天。每3天置换一次各孔中的培养基和耐久霉素二好生物。2.荧光显微镜检查法如同在实施例XII中一样，重组CMV在SV40启动子调控下表达GFP。因此，在荧光显微镜下被感染的细胞呈现绿色。在这些研究中，在第4和6天用荧光显微镜观察用耐久霉素衍生物处理过的受CMV感染的细胞。B.结果在第4天，在未处理孔和用(DLBhNA和(DIM)jngG处理的孔中都有个别被感染的GFP阳性绿色细胞。因此，用这些耐久霉素衍生物处理HHF-R2细胞似乎不会抑制病毒进入细胞。有一些初步的迹象表明耐久霉素衍生物DS-1、DS-2和DS-3抑制病毒进入细胞。在用(DLB)4M和(DIM)nHIgG处理后的第6天，在未处理孔和耐久霉素衍生物处理孔之间被感染的GFP阳性细胞数目有了显著的不同。到第6天，未处理孔中的病毒已从第4天所观察到的个别被感染细胞传播至周围细胞。不过，第6天，在用(DLB),NA和(DIM)JIgG处理过的孔中，病毒仍局限于最初的个别被感染细胞中。因此，(DLB)AA和(DIM)JIgG限制了CMV从最初的被感染细胞向周围细胞的传播。用不同浓度的(DLB)4NAU00iag/ml和50jag/ml)和(DIM)JIgG(200jjg/ml和100jag/ml)处理细胞都观察到了对病毒传播的这种抑制。实施例xvni3G4抗体的优势如实施例IV中所述，用发明者独一无二的方案所开发出的3G4抗体具有许多优越于文献中的抗PS抗体的特点，包括著名的抗PS抗体3SB(Rote等人，(1993))。本实施例描述了其中的某几个优点。A.种类和特异性3G4是IgG抗体，而3SB是IgM。IgG类抗体具有许多优越于IgM之处，包括更高的亲和力、体内的清除率较低以及纯化、修饰和处理的简便性。将lgM抗体3SB与3G4和另一IgG抗体的PS结合之间的比较作图。3G4与阴离子磷脂PS、PA、PI、PG和CL以大约相同的强度强反应，而与氨基磷脂PE的结合则没有这么强。它与PC和SM无反应性，结合特异性趋势如下PS=PA=PI=PG>CLPE(实施例IV;表4)。3G4与肝素、硫酸乙酰肝素或者双链或者单链DNA没有可检测到的结合，在蛋白质印迹检测中，与提取自bEnd.3细胞的细胞蛋白质也没有可检测到的结合。3G4的结合不受5mMEDTA存在的影响，表明3G4与阴离子礴脂的结合不需要Ca"。3G4不与已包被了磷脂但随后用O.2%Tween20的盐水溶液漂洗过的ELISA平板结合，证明了结合的是被吸附的磷脂。被3G4所识别的表位看起来位于阴离子磷脂的磷酸甘油核中，它在所有哺乳动物物种的磷脂中是相同的。因此抗体与小鼠和人二者的磷脂都反应，这对于临床前和临床开发都很重要。3G4对阴离子磷脂比对天然配体膜联蛋白V更特异。与3G4不同，在生理浓度Ca"中膜联蛋白V还强烈结合中性磷脂。3G4对阴离子磷脂的特异性通过下述试验得到证实，其中将由不同磷脂形成的脂质体用于与3G4竟争结合固定化的PS。脂质体是由5mg单一磷脂在氯仿中形成的溶液制备的。将溶液在氮气中干燥，使其在圆底玻璃烧瓶中形成一薄层。然后加入10mlTris緩冲液(0.1M，pH7.4)，并将烧瓶超声处理5次，每次2分钟。将3G4抗体(0.lug/ml)加入緩冲液或不同的磷脂脂质体中，并室温预孵育30分钟。将混合物加入PS包被的平板(在标准封闭后)，孵育l小时，洗涤并添加二抗。l小时后，漂洗平板并用0PD显色5分钟。如实施例IV中所示，3G4可结合固定化的PS、PA、PI、PG和CL，而以较低程度结合固定化的PE，但不与固定化的PC结合。在存在或不存在不同脂质体的条件下3G4与固定化PS结合的能力如图3所示。来自这些脂质体竟争性试验的结果表明，3G4与吸附于ELISA平板上的PS的结合被由PS、PA、PI和CL制备的脂质体阻断，但由PE和PC制备的脂质体则不导致3G4结合有可检测到的减少(图3)。此外，SM脂质体也不是抑制性的。B.细胞增殖的抑制3G4结合将PS和其他阴离子磷脂外在化的活化、分裂、损伤、凋亡和恶性细胞。3G4抗体抑制了内皮细胞的体外增殖，并显示出对分裂着的内皮细胞有明显的选择性抑制作用，这与静止细胞的情形相反。测定抗PS抗体3G4、9D2、3B10、1B9、2G7、7C5和3SB对bEnd.3细胞体外生长的影响。将bEnd.3细胞(10000/孔)接种于48孔平板中并使其附着。接种后4小时只加入20。/。DMEM(对照)或含抗体(20"g-40pg总IgG/孔)的20%DMEM。每个克隆均在两个独立平板上以三份试样进行检测。48-96小时后使细胞分离，对各个孔测定细胞计数，并计算每次处理的平均细胞数目。3G4和9D2抗体尤其有效，然后是3SB和3B10,而1B9、2G7和7C5具有较小的抑制作用。各抗体显示出对分裂着的(亚汇合)内皮细胞有明显的选择性抑制作用，这与静止细胞的情形相反。在比较性研究中，3G4显示了最大的抑制作用，然后是9D2，它们的抑制性都强于3SB。C.抗肿瘤作用3G4可结合体内胂瘤血管内皮细胞的表面。在静脉内注射入患各种肿瘤的小鼠内后，3G4特异性并一致地定位于肿瘤，但不定位于正常器官。在肿瘤血管内皮、坏死区和单个恶性细胞上观察到染色。在肿瘤中有3G4的多结合位点，这使其能同时靶向于胂瘤内皮和胂瘤细胞。3G4抑制了体内血管发生和肺瘤生长，并且在患肿瘤的小鼠中显示出无可检测到的器官毒性。在最初的研究中，3G4已在同种和异种胂瘤模型中显示出给人深刻印象的抗胂瘤作用，其中抗体造成了肿瘤血管的损伤、血管供应的减少和肺瘤坏死(实施例XI)。在被处理动物中有30%-50%观察到已产生的肿瘤的衰退。在重复的研究中已观察到3G4抗体的抗血管发生和血管靶向作用。与用对照抗体处理相比，对来自带有MDA-MB-231同位肿瘤并已用3G4处理的棵鼠的肿瘤切片的分析证明了在所有被处理的肿瘤中有抗血管发生作用。对照肺瘤显示出无坏死的迹象且高度血管化，正如肿瘤血管上检测的泛-内皮细胞标记CD31所证实的。相反，用3G4处理过的小鼠肿瘤有80-90%的坏死和CD31阳性结构的几乎完全消失，表明此处理产生了实质性的抗血管发生作用。3G4抗癌活性的另一方面是诱导肿瘤血管的损伤。这通过如下来举例说明对照肿瘤中的血管灌注良好、形态完整且周围是存活的正分裂的肿瘤细胞，而经3G4处理的动物内的血管被频繁观察到具有正在瓦解的内皮层且被脱离的内皮细胞堵塞，并有可能被吸附至棵露血管的宿主细胞堵塞。经3G4处理的肿瘤内的血管清楚地显示出功能丧失，由坏死前的周围肿瘤细胞层可显示出这一点。这些研究还显示，用3G4处理引起白细胞浸润入肺瘤中(图l)。在这些研究中，用3G4处理具有正位MDA-MB-231肿瘤的小鼠还减少了血浆容量并降低了肿瘤中的血管密度。根据血浆标记物FITC-葡聚糖减少所判断的，观察到经3G4处理的小鼠的总肿瘤血浆容量与经BBG3处理的小鼠相比减少了60%。在来自经3G4处理的小鼠的肿瘤中每平方毫米的CD-31阳性血管的平均数目是50土15，而在来自经BBG3处理的小鼠的胂瘤中为160士20,这表示肿瘤血管供应(vascularity)在3G4处理后减少了大约70%。总之，用3G4处理同位MDA-MB-231肿瘤后进行的组织学检查显示1)在约50%肿瘤血管中血管内皮分解；2)白细胞附着于胂瘤内皮且单核细胞浸润入肿瘤间质组织；3)肿瘤血管被血小板聚集物和红细胞堵塞；4)与未处理小鼠相比，经3G4处理的小鼠中肿瘤内微血管密度下降70%;以及5)肿瘤中心坏死，肿瘤外围边缘细胞存活，这是VTA的典型特征。因此，3G4抗体通过对肺瘤血管产生影响来发挥其主要的抗肿瘤作用。其他的机制，尤其是针对肿瘤细胞本身的抗体依赖型细胞毒性，有可能也造成抗胂瘤作用。这一点是重要的，且可能可以杀死更多的肿瘤细胞，包括外围边缘的肿瘤细胞。在进一步的研究中，在其他小鼠模型上检查3G4对肿瘤生长的影响，所说的肿瘤模型包括同种(小鼠MethA纤维肉瘤)、皮下异种移植物(L540人Hodgkin，s淋巴瘤)和同位肿瘤(人MDA-MB-231乳癌和人MDA-MB-435乳癌)。用3G4抗体处理小鼠分别导致了这些肿瘤有90%、65%以及50%和70%的生长延緩。小肿瘤(直径O.1cm)和生长良好的肿瘤(直径0.3cm，200mm3)都同样被抑制。抗PS疗法导致在50。/。的患MethA肺瘤小鼠和30%的患MBA-MD-231肿瘤小鼠中长期的完全的症状緩解。3G4在免疫活性小鼠中具有最高的抑制作用。将人乳房肿瘤生长于小鼠乳房脂垫中的人乳房肿瘤(MDA-MB-231和MDA-MB-435)的同位模型尤为重要，因为这些是生长于人乳房中的人乳腺癌的实用和现实模型。D.安全特性3G4抗体与文献中所述的抗磷脂抗体不同。通常地，抗磷脂抗体被认为是会干扰凝血级联反应的致病抗体。它们会抑制体外凝血反应，并引起体内血栓形成。相反，3G4、9D2和类似抗体是无致病效果的治疗用抗体。1.凝血3G4、9D2和类似抗体的重要方面源自发明者能够制备不与抗磷脂综合征或相关病理学相关联的抗体。在体外血液凝结研究中，用高剂量3G4抗体观察到对组织因子(TF)诱发的凝血有微弱抑制作用。在使用较低剂量的别的研究中，在组织因子存在下，经3G4处理的小鼠的再钙化血浆与来自经BBG3处理的小鼠的再4丐化血浆以相同的速率凝结。此外，添加100jig/ml3G4至体外细胞和组织因子中不影响凝血因子Xa在proplex(外在凝血途径)中的产生速率。尽管体外高抗体水平对TF诱导的凝血具有微弱的抑制作用，还在体内检测了3G4抗体，它不会在正常或携带肿瘤的小鼠中引起血栓形成并发症(如参见实施例XI)。在猴子体内也测试了3G4抗体，观察到无显著的副作用。2.低或无毒性的其他指示剂3G4在小鼠内没有毒性或只有低毒性的第一个证据来自3G4作为杂交瘤在小鼠内生长时无毒性迹象的有关发现。此外，在腹膜内注射lmg纯3G4时，没有观察到毒性。现在还进行了全身性的体内研究，其中对每组三只8周龄BALB/c小鼠，用100ing纯化的3G4或同种型匹配对照IgG3(BBG3)每周三次腹膜内注射小鼠，持续2-4周。未观察到毒性体征，且在3G4处理小鼠的主要器官切片中未检测到器官毒性的组织学迹象或形态异常。特别检查了以下参数。在体重方面，经3G4处理的小鼠与经BBG3处理的小鼠以相同速率增加体重。在早期研究中未观察到体重下降。没有毒性体征，如脱发、无食欲等，并且与对照动物相比较，身体活动性是正常的。与对照动物相比没有鉴别出血液学毒性的证据。外周血液组成是正常的(基于全血细胞分类计数的测量结果)；红细胞形态学评估显示没有血管内溶血的证据(即不存在裂红细胞)；所有血液凝固参数(PT、APTT、D-二聚体)都是正常的。血细胞计数无变化，包括红细胞、血小板、白细胞、绝对的淋巴细胞计数或绝对的嗜中性粒细胞计数。骨髓的细胞构成和组成是正常的。为了分析骨髓的细胞构成，检查来自经3G4或BBG3处理的小鼠(6次注射，100jag)的骨髓石蜡切片的总细胞含量和细胞组成。被处理动物内的骨髓基本上完全是细胞的(正如对年轻哺乳动物所预期的一样)。红血球、粒细胞、淋巴细胞前体和巨核细胞都以正常数目存在。正如通过肺、肝、心脏、脑、肠、胃和肾的死后检查而评估的，不存在其他器官毒性。总之，在持续2-4周、每周用高剂量3G4(0.lmg)处理3次的200多只小鼠中，或者在大鼠中，未观察到毒性情况的发生。即使剂量高达2mg，也未观察到毒性迹象。小鼠保持正常的体征、骨髓细胞构成、白细胞计数、组织学和凝血功能。在进一步的研究中，一组5只不具有肿瘤的小鼠接受单次腹膜内注射2mg3G4,或者腹膜内以每日O.5mg3G4重复注射并持续14天(7mg总剂量)，这些组没有显示出毒性体征。还在小鼠中进行了血液清除的动力学研究。用BoltonHunter试剂对3G4进行放射性碘标记，并静脉内注射入小鼠(25g)。在多个稍后的时间点从尾静脉取血样。3G4的血液清除速率是小鼠中小鼠IgG的特征性方式。清除的ot-阶段中的半衰期是3小时，而P-阶段中的半衰期是5天。分布体积是正常的(100ml/kg)。这些研究表明3G4不与正常的宿主组织相互作用，导致其清除加速。3.猴安全性研究人源化3G4抗体(参见下文实施例XIX)还已在安全性研究中施用给猴，并且没有观察到显著的副作用。人源化3G4抗体作为高达100mg/kg的快速灌注剂施用给猕猴。这是计算出的治疗剂量(1mg/kg)的100倍。在重复给药中无不良反应水平(N0AEL)是大约IOmg/kg/周。在10-100mg/kg的剂量上，APTT和PT有短暂的延长。在血管细胞计数(包括白细胞、红细胞和血小板)或其他临床化学中没有显著改变。E.抗病毒作用3G4抗体还发挥了显著的抗病毒作用。如实施例XI11中所观察到因此这些结果突出了3G4抗体超过文献中著名的抗PS抗体3SB(Rote等人，1993)的优越之处。3G4抗体还显示出对抑制CMV非常有效，在体外(实施例XII)和在增加体内mCMV感染小鼠的存活力(实施例XXI)中都是如此。此外，3G4抗体还显示出抑制皮钦德病毒感染，此病毒是拉沙热的传染物(实施例XXIV)。此处显示的病毒感染后的细胞表面PS暴露以及3G4抗体结合受牛痘病毒感染的细胞的能力(实施例XXIII),表明了3G4抗体具有作为广谱抗病毒剂的巨大潜能。实施例XIX3G4抗体、CDR序列和嵌合体因此，3G4抗体具有抗血管发生、抗肿瘤血管和抗病毒剂的联合特性。3G4对细胞分裂、血管发生、肿瘤生长和病毒传染性的抑制活性以及无明显的毒性，显示出此抗体有广泛的治疗性指征，包括治疗血管发生紊乱、癌症、糖尿病和病毒感染。可产生与3G4抗体基本上识别相同表位的抗体，以用于抗血管发生、抗肿瘤血管和抗病毒治疗中的一种或多种中，如通过免疫接种并用抗体竟争性试验证实。还可从本文提供的有关3G4抗体序列的知识产生与3G4抗体基本上结合相同表位的抗体。本实施例提供了3G4抗体互补性决定区(CDRs)的序列以及此序列信息的用途。A.3G4抗体序列获得的，并验证了该序列。3G4抗体CDR1-3重链(Vh)可变区的核酸序列和氨基酸序列分别以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2表示。如图2A中所示，SEQIDNO:l和SEQIDNO:2包括部分小鼠前导序列和恒定链序列。前导序列为SEQIDNO:2的第l位到第19位氨基酸，成熟蛋白的起点如图2A中箭头所示。成熟蛋白质序列至完成VSS的序列部分包括足够的互补性决定区序列信息，其后的氨基酸序列就不是抗原结合所必需的了。因此，核酸序列中的BstEII位点可用作制备功能性小鼠可变区的方便的位点，例如用于移植到人的恒定区上(图2A)。实践中，利用LonzapEE载体在BstEII位点已将3G4-2BVH序列移植入人Yl恒定区上。产生的产物包含小鼠前导序列，且其VH以图2A中所示的方式与人CH1序列连接，其中的ASTLGPSVFPLAPSSKSTSG(SEQIDNO:7)代表人CH1序列的第一部分。3G4抗体CDR1-3轻链可变区(Vk)的核酸序列和氨基酸序列分别用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4代表。如图2B中所示，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4还包括部分小鼠前导序列和恒定链序列。前导序列为SEQIDNO:4的第l位到第22位氨基酸，成熟蛋白的起点如图2B中箭头所示。成熟蛋白质序列至完成TVF的序列部分包括足够的互补性决定区序列信息，其后的氨基酸序列就不是抗原结合所必需的了。因此，核酸序列中的BbsI位点可用作制备功能性小鼠可变区的方便的位点，例如用于移植到人的恒定区上(图2B)。实践中，利用LonzapEE载体在BbsI位点已将3G4-2BVL序列移植入人k恒定区上。产生的产物包含小鼠前导序列，且其VL以图2B中所示的方式与人CL1序列连接，其中的IFPPSDEQLKSGTAS(SEQIDNO:8)代表人k恒定区序列的第一部分。B.3G4人嵌合抗体的产生和表征已产生了含小鼠互补性决定区和人恒定区的嵌合构建体(ch3G4),并显示出其表现基本上与原始小鼠抗体相同。将鼠类3G4抗体转变成人-小鼠嵌合抗体(Avanir(Xenerex)Biosciences,SanDiego,CA)。克隆鼠类vh并在Lonza2BVH载体的BstEII位点接枝至人的yl恒定区上。克隆鼠类VK并在Lonza2BVL载体的BbsI位点接枝至人的k恒定区上。验证序列。整个构建体在CHO细胞中表达并纯化。该人-小鼠嵌合("人源化")抗体已被称为"Tarvacin"。产生的ch3G4至少与小鼠类3G4同样优良地结合磷脂包被的ELISA平板。嵌合3G4与多种磷脂的体外结合概况如图4所示，其中与PS、PA、CL和PI的结合显得相似。结合是抗原特异性的，因为未观察到与无关特异性的对照抗体的结合。在某些试验中，观察到嵌合3G4有明显高于3G4抗体的结合；这可能是由于二抗的良好结合所造成的。C.所述人源化抗体的抗肿瘤作用在体内，ch3G4定位于肿瘤血管内皮且发挥抗肿瘤作用。ch3G4在生长于小鼠内的MDA-MB-435人乳癌细胞中的抗肿瘤作用如实施例XI中所述。与对照相比，用嵌合抗体治疗患MDA-MB-435胂瘤的小鼠有效延緩了胂瘤的生长。在小鼠中生长的MDA-MB-435人乳癌细胞中检查ch3G4的定位。将生物素化的ch3G4或无关特异性的对照IgG静脉内注射入小鼠。l小时后，处死小鼠，摘除肺瘤，冷冻切片。使生物素化药剂首先与链霉抗生物素蛋白-Cy3缀合物一起孵育，用PBS洗，然后与MECA32抗体孵育，再与经FITC标记的二抗孵育。分别用针对Cy3(红色)和FITC(绿色)的适当滤镜通过数码相机拍摄单一图像并传送到计算机上。借助Metaview软件将显示黄色(融合绿色和红色荧光的产物)的会聚图像叠加。在此双染色方法中，生物素化蛋白质和血管内皮被红色和绿色所标记。其中生物素化蛋白质与内皮结合，会聚的图像呈现黄色。生物素化的ch3G4结合肺瘤血管内皮，因为此染色模式汇合了MECA32的染色模式。Tarvacinii已进行放射标记，并且显示出朝向大鼠中同系的前列腺肿瘤。在具有肿瘤、用Tarvacir^处理的大鼠中还，见察到肿瘤灌注减少。D.3G4的重组IgG2a同种型的产生和表征鼠类3G4抗体的人嵌合体(ch3G4)是人IgG洞种型(hlgGj。ch3G4的鼠类IgG同系物要求小鼠IgGh同种型(mIgG2a)。制备并测试这种构建体，并显示出具有与亲本抗体基本上一样的表现。Lonza表达载体pEE12.4和pEE6.4经由与PeregrinePharmaceuticalsInc.的协议从LonzaBiologics获得。根据LonzaBiologics的"OperatingProceduresforusewith:NSOMyelomaeelIs"进行载体的使用、转染和转染的NSO小鼠骨髓瘤细胞的筛选。简言之，通过RT-PCR从由3G4杂交瘤细胞系中分离的总RNA扩增3G4轻链编码序列。这样设计RT-PCR引物，即从而使得扩增的片段在扩增产物的任何一端包含XmaI和EcoRI限制性内切酶酶切位点，以克隆到LonzapEE12.4载体中。通过RT-PCR从由3G4杂交瘤细胞系中分离的总RM扩增3G4重链的可变区。这样设计引物，即从而使得扩增的片段在扩增产物的任何一端包含HindIII和XmaI限制性内切酶酶切位点，以克隆到LonzapEE6.4载体中。通过PCR从由Dr.ShozoIzui提供的质粒载体扩增鼠类IgG2a恒定区。这样设计PCR引物，从而使得在扩增产物的任何一端具有BstII和EcoRI限制性内切酶酶切位点，以克隆到pEE6.4+3G4VH载体中。重要地，将BstlI位点设计成按读码框与3G4VH可变区序列上游融合在一起。通过用SalI和NotI切割这两种载体将重链和轻链构建体组合到单个双基因载体(12.43G4IgG2a)中。通过在UTSouthwestern测序中心i殳施上进行测序来验证重链和轻链编码区。通过电穿孔将12.43G4IgG2a载体转染到NS0细胞中。转染后，将NS0细胞稀释并在缺乏谷氨酰胺的培养基中铺板到96孔板中。只有用这种构建体(其包含用于阳性选择的谷氨酰胺合酶基因)转染的细胞可以在缺乏谷氨酰胺的情况下生长。在接下来的2个月中，鉴别各种转染子，通过PS-ELISA就抗体分泌进行筛选。分泌最高量抗体的那些转染子在大量培养中生长以产生纯化的抗体。使用与用于3G4抗体一样的纯化方案来纯化抗体。如图2C和图2D中所示，IgG2a重链和3G4轻链(Ck)的氨基酸序列分别由SEQIDNO:IO和SEQIDNO:ll表示。如所预期的，纯化的2aG4抗体在SDS-PAGE凝胶上作为150kDa条带迁移，并以基本上与3G4—样的亲和力和特异性结合PS-ELISA中的PS。因此，2aG4以与3G4—样的特性结合阴离子磷脂(参见上文表4)。主要产生小鼠IgG2a同种型以提供用于人嵌合体ch3G4(Tarvacin)的更佳模型。还认为小鼠IgGh同种型比小鼠IgG3(目前的鼠类3G4抗体的同种型)更稳定。2aG4抗体经由增强的ADCC可以产生比3G4IgG;更强的抗肿瘤效应。已在初步研究中，在小鼠WiDr(结肠癌)模型中检测了2aG4抗体，连同3G4和ch3G4抗体一起，而C44抗体作为对照。处理在第5天当肺瘤很小时开始(10只小鼠/组)。100jLig的每种抗体一周注射3次，并监控肿瘤生长。所有3种测试抗体减緩了肺瘤生长至基本上相同的程度。实施例XX与疗法(包括多西他赛)相组合的3G4抗体本实施例涉及将3G4抗体和化疗药物多西他赛联合用于肿瘤治疗的疗法。这些药剂被设计成攻击肿瘤血管系统的内皮细胞和肿瘤细胞区室，产生协同疗法，同时毒性较低。结果显示此组合疗法确实显著增强了疗效。A.Fc结构域介导的抗肿瘤作用检测3G4抗体在体外肺瘤细胞上的抑制作用。未观察到对肿瘤细胞有直接的抑制作用。因此，有可能3G4抗体的抗肿瘤作用涉及Fc介导的免疫效应器功能的增强，例如抗体介导的吞噬作用、ADCC、CDC和细胞因子产生的刺激作用或这些机制的联合。已检测了3G4对巨噬细胞吞噬PS阳性细胞的影响作用。用&02处理焚光肿瘤细胞以诱导PS暴露。然后收获处理和未处理的细胞，并与3G4抗体或对照抗体(BBG)接触。然后加入小鼠骨髓巨噬细胞，用荧光显微镜分析巨噬细胞吞噬荧光肿瘤细胞的能力。经测定，3G4能将巨噬细胞对PS阳性细胞的吞噬作用提高3倍以上。此发现支持了发明者的推论，即3G4抗体的Fc结构域有助于抗体的抗肿瘤效用。也就是说，Fc结构域激活了宿主的免疫效应物功能，然后后者发挥了抗肿瘤作用。因此3G4抗体增强了NK细胞的溶胞活性，导致了更有效的ADCC。B.多西他赛诱导内皮细胞和胂瘤血管上的PS暴露通过FACS分析体外检测亚临床浓度的多西他赛对内皮细胞上PS暴露的诱导。用10nM多西他赛处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HMVEC)24小时，然后进行FACS检测。与未处理细胞相比，处理过的HUVEC和HNVEC二者都显示出3G4结合的显著增加。还进行了48和72小时的多西他赛孵育。在体外用浓度为20pM的多西他赛处理HUVEC细胞也引起了阴离子磷脂外在化而不引起调亡。C.多西他赛诱导肿瘤细胞上的PS暴露还利用一组肿瘤细胞系通过FACS检测了亚临床浓度多西他赛在体外对PS暴露的诱导。用IOnM多西他赛处理小鼠lewis肺癌3LL、小鼠结肠癌Colo26和人乳癌MDA-MB-435细胞24小时，然后进4亍FACS检测。与未处理细胞相比，所有测试肿瘤细胞系都显示出3G4结合的显著增加。还进行了48和72小时的多西他赛孵育。进一步检查了小鼠黑素瘤B16和小鼠纤维肉瘤MethA肿瘤细胞系，与未处理细胞相比，它们也显示出3G4结合的显著增加。用10nM多西他赛处理人乳癌MDA-MB-231细胞24小时，并与嵌合3G4抗体(ch3G4)或对照(人IgG)—起孵育，然后进行FACS检测。这些结果显示了抗体结合的显著增加是抗原特异性的，且嵌合抗体的表现与亲本3G4抗体相似。D.多西他赛诱导肿瘤血管上的PS暴露来自对照研究的结果还显示，多西他赛增加了肿瘤血管上的PS暴露。在此类研究中，用多西他赛处理小鼠使暴露阴离子磷脂的肿瘤血管的百分比从35%增至60%。即使在用多西他赛全身治疗后，在正常组织血管上也没有观察到PS的诱导。E.3G4和多西他赛的协同肿瘤疗法发明者由此证明了用亚临床浓度的多西他赛处理内皮细胞和肿瘤细胞显著增强了3G4的结合。他们还证明了3G4抗体促进了巨噬细胞介导的对PS暴露于其表面的肿瘤细胞的吞噬作用。因此，由多西他赛介导的3G4结合的增加增强了肿瘤细胞的吞嗟作用和由3G4抗体Fc结构域介导的其他抗肿瘤作用，例如提高了NK细胞的裂解活性，从而导致更有效的ADCC。其他研究也显示出用多西他赛治疗乳癌患者导致了血清IFN-y、IL-2、IL-6和GM-CSF细胞因子水平的增高和NK及LAK细胞活性的增强(Tsavaris等人，2002)。因此，在携带人MDA-MB-435乳癌的SCID小鼠的同位模型中检测3G4与多西他赛组合疗法的抗肿瘤作用。将3G4单独(100pg/剂)、多西他赛单独(10mg/kg)或3G4与多西他赛联合(分别为100mg/剂和l0mg/kg)经腹膜内途径治疗携带同位人MDA-MB-435乳房肿瘤的小鼠，持续3周，每周施药3次。在肿瘤细胞植入6天后开始治疗。这些研究显示，用3G4加上多西他赛治疗具有正位MDA-MB-435人乳腺肿瘤的小鼠抑制了93%的肿瘤生长。用3G4加上多西他赛治疗具有散布的MDA-MB-435肿瘤的小鼠使肺中肿瘤集落的平均数目减少了93%，并且一半的动物没有发展出肿瘤。在这两个肿瘤模型中，组合的抗肿瘤效应在统计学上优于单独的多西他赛或3G4(p<0.01)。组合疗法以比单独的药物更大的程度减少了肿瘤血管密度和肿瘤中的血浆容量。组合疗法并不比单独的多西他赛对小鼠更具毒性。这些结果表明，作为佐剂疗法，3G4可以增强多西他赛在乳腺癌患者中的疗效。F.3G4增强顺柏针对抗药性乳腺肿瘤的活性3G4抗体还在动物中增强顺铂针对抗药性乳腺肿瘤的活性。小鼠净皮接种抗药性乳腺肿瘤，并在第20天后进行治疗。治疗组是单独的顺铂、单独的3G4抗体、同种型匹配的对照抗体(BBG3)或与3G4抗体组合的顺柏。在对照动物中的肿瘤继续快速生长。在用单独的顺铂或单独的3G4抗体治疗的小鼠中，肿瘤生长减慢。组合治疗组(顺铂和3G4抗体)显示出最佳的抗肿瘤应答。因此，抗体例如3G4增强化学治疗药物例如顺铂的功效，甚至是针对抗药性肿瘤。G.胰腺癌的组合疗法迫切需要关于胰腺癌的改进疗法。在人中，具有胰腺癌的患者的总体长期存活少于4%。大约70-80%的胰腺癌患者由于转移至肝而无法治疗，并且目前没有对于转移疾病的有效疗法。将Pan02小鼠胰腺腺癌细胞注射到具有免疫能力的C57BL/6小鼠的胰腺中。治疗在肿瘤细胞注射后第5天开始。治疗组是作为对照的PBS、单独的3G4抗体(lOOing)、单独的吉西他滨(3.5mg)、或与吉西他滨组合的3G4抗体(3G4抗体为100jug,和吉西他滨为3.5mg)。吉西他滨是嘧啶抗代谢物。在肺瘤细胞注射后第22天处死动物，并测定肿瘤重量。在这些研究中，吉西他滨和3G4抗体都显示出显著的抗肿瘤效应。用与3G4抗体组合的吉西他滨治疗的动物显示出显著增强的、超过每种单独试剂的抗肿瘤效应，没有副作用，例如体重减轻。在用吉西他滨或3G4抗体单独治疗中，结节、腹膜和肝转移也显著减少。此外，当与每种单独的试剂比较时，用与3G4抗体组合的吉西他滨治疗的动物显示出结节、腹膜和肝转移显著减少。重要地，在用吉西他滨和3G4抗体的组合进行治疗的动物中，没有检测到至肝的转移。这是重要的，因为在人中，转移至肝是在胰腺癌诊断后最常见的死亡原因。这些研究还显示，在组合处理组中巨噬细胞显著浸润到肿瘤中。在用单独的3G4抗体以及用与吉西他滨组合的3G4抗体治疗后，微血管密度减少。H.用放射和3G4治疗肺癌在具有肺癌的小鼠的研究中，如在双重标记研究中所示，10Gy局部辐射诱导肿瘤血管内皮上的PS暴露。在治疗阶段，单独的辐射和3G4抗体均显示抗肿瘤效应。此外，组合治疗形式，即辐射和3G4抗体，显示出最大的抗肿瘤效应。I.3G4将凋亡的肿瘤细胞靶向于树突细胞上的FcyR与对照肿瘤相比，来自用3G4加多西他赛处理后的小鼠的肿瘤还包含不常见量的淋巴细胞。尽管此现象可能代表了典型的分解胂瘤细胞对免疫细胞的化学引"^秀作用，它可能还反映了通过Fc结合免疫效应细胞上的Fcyr而介导的3G4对免疫系统的活化。为了鉴定施用3G4和多西他赛对肿瘤内免疫细胞浸润的影响，可以利用针对巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、NK细胞和活化淋巴细胞特异性标记的抗体通过对肿瘤组织的水冻切片和/或石蜡切片的免疫染色鉴定这些浸润物中存在的细胞类型(Pharmingen,SanDiego，CA)。可以将此浸润物的程度、表型和活化状态进行分级。由浸润的免疫细胞产生的细胞因子，包括IL-2和INF的量，还可通过免疫组化技术进行分析。血清细胞因子水平可通过ELISA进行评估，可用细胞内染色鉴定负责细胞因子产生的特殊细胞区室。因此可以全身性的评估浸润免疫细胞对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。根据前述资料，发明者进一步考虑了增强乳癌免疫疗法效力的方法，即通过3G4介导的将凋亡肿瘤细胞靶向于树突细胞上的Fcy受体(Fc(Y)R)。诱导有效的细胞和体液免疫反应的有效抗原呈递对于开发肺瘤疫苗和免疫疗法是重要的。树突细胞(DC)是引发抗肿瘤相关抗原的细胞毒性T淋巴细胞的最强的抗原呈递细胞(APC)。树突细胞(DC)对肿瘤抗原呈递的促进应会导致开发出更强的肿瘤疫苗。通过Fc(y)r受体介导的内在化来进行的dc抗原呈递与流态抗原胞饮作用相比可提高达1000倍。凋亡肿瘤细胞(ATC)是树突细胞负载抗原的极好来源，因为多种肿瘤特异性抗原(已知和未知的)可有效呈递于天然T细胞上，由于封闭了某些表位而降低了出现免疫逃逸变体的可能性。在动物实验中，用ATCs脉冲的DCs已显示出在体外和体内产生了强的抗肿瘤免疫力。不过，最近的资料已证实单独使用ATCs在某种程度上对激活抗肿瘤免疫力无效，可能是由于它们的摄取不足且不能诱导DC成熟。最近的研究还证明了通过抗肿瘤抗体与凋亡肿瘤细胞的结合所形成的ATC-免疫复合物可被靶向于DC上的Fc(Y)R。与单独使用ATC相比，atc-免疫复合物更有效的被dc内在化，更有效的诱导dc活化和成熟，更重要的是，ATC-免疫复合物能显著增加MHCI和II限制性抗原呈递，因此诱发了强的抗肺瘤T辅助物和CTL免疫力。发明者因此设想用本发明的抗PS抗体增强体液和细胞的抗肿瘤免疫力，并提高基于ATC的DC肿瘤疫苗的效力。由于PS是凋亡肿瘤细胞上普遍的和最丰富的特异标记，本发明的抗体组，尤其是3G4，可结合ATC上的ps。发明者还证明了通过Fc(y)r介导的3G4-ATC复合物的内在化，3G4可以增加DC对凋亡肿瘤细胞的摄取达300。/。。通过增强Fc(Y)R介导的DC对ATC的摄取，可以推断3G4和类似抗体能大大增强MHCI和II限制性抗原呈递，诱导强的体液和细胞抗肿瘤免疫力，并提高基于ATC的DC肿瘤疫苗的效力。这可以通过测定负栽了3G4-ATC免疫复合物的DC诱导Thl、CTL和体内抗体反应的效力，以及测定用负载了3G4-ATC免疫复合物的DC进行体内免疫所诱导的抗胂瘤免疫力的效力来加以证实。实施例XXI抗PS抗体治疗体内CMV感染在实施例XII中所示的体外针对CMV的抗病毒作用之后，本实施例证明了感染小鼠型CMV病毒(mCMV)的小鼠存活率的提高。用5xi05pfu的mCMVRVG102经腹膜内感染Balb/C小鼠(6周龄，每组5只小鼠)。在第l天用3G4抗体(1mg/只小鼠)或上述人-鼠嵌合抗体ch3G4(lmg/只小鼠)腹膜内注射小鼠。未处理的小鼠用作对照。之后每4天以0.5mg/只小鼠的量用抗体或嵌合抗体处理小鼠，直至第26天。感染后90天监测小鼠的存活。用亲本和嵌合形式的3G4抗体进行处理导致mCMV感染小鼠成活率的提高。用3G4或ch3G4处理的小鼠存活率分别为100。/。和80。/。，与之相比，未处理小鼠中只有25%的小鼠在感染中存活。实施例XXIIPE结合性肽衍生物治疗体内CMV感染除了实施例XVII中所示的针对CMV的体外抗病毒作用夕卜，本实施例证实了耐久霉素-生物素衍生物DLB提高了被mCMV感染的小鼠的存活率。用5xl05pfu的mCMVRVG102经腹膜内感染Balb/C小鼠(6周龄，每组5只小鼠)。在第l天和每4天用20ng/只小鼠剂量的耐久霉素衍生物DLB腹膜内注射小鼠。未处理的小鼠用作对照。感染后90天监测小鼠的存活率。用耐久霉素-生物素衍生物DLB进行的处理提高了mCMV感染小鼠的存活率。用DLB处理的小鼠存活率为100。/Q，与之相比，未处理小鼠只有25%的小鼠在感染中存活。实施例XXIII抗PS抗体与受病毒感染的细胞相结合本实施例显示了病毒感染诱发了PS在细胞表面的暴露且抗PS抗体结合受病毒感染的细胞。正如FACS分析中所证实的嵌合抗体与细胞表面结合的增加所显示的，感染了牛痘病毒的细胞变成PS阳性。以2的高感染复数用经胰酶处理的牛痘病毒感染U937细胞。简而言之，用等体积的胰酶O.25mg/ml在37X:处理牛痘病毒30分钟。将病毒加入U937细胞中，总体积O.5ml。1.5小时后，将新鲜的培养基加入细胞中，并在T25烧瓶中37'C孵育细胞2天。未感染的细胞用作对照。用一抗对感染和未感染的U937细胞染色，并用嵌合3G4抗体(ch3G4)或用人IgG(HIgG)作为对照。漂洗细胞，用正常的小鼠血清封闭，然后用一抗在冰上染色45分钟。漂洗3次后，用1:400稀释的缀合有FITC的山羊抗人二抗对细胞染色并在FACScan上进行分析。FACS分析的结果显示，与在未感染的U937细胞上获得的结果相比，被牛痘病毒感染的U-937细胞上的ch3G4有显著的改变。因此此试验显示了，用牛痘病毒感染细胞导致了细胞表面上的PS暴露，并且嵌合形式的抗PS抗体3G4能结合这些受病毒感染的细胞。实施例XXIV抗PS抗体针对皮钦德病毒的抗病毒作用除了针对CMV和RSV的抗病毒作用外，本实施例进一步证明了抗PS抗体体外抑制皮钦德病毒感染。皮钦德病毒是新世界沙粒病毒，它在人类中是非致病的，并用于拉沙热的动物模型中。以O.01pfu/个细胞的低感染复数用皮钦德病毒感染后，用3G4抗体或同种型匹配的对照抗体GV39G处理汇合的Vero细胞单层。简而言之，将细胞与病毒以lml/孔的总体积于37。C孵育90分钟。感染期间，每30分钟轻轻旋转平板一次。感染后，去除细胞上清液并将DMEM/10D/oFBS/pen-strep加入各孔中(2ml/孑L)。第2天，用胰酶消化收获细胞并使其贴附于Biocoat容器栽片上。将栽片固定，用多克隆兔抗PIC血清及随后加入的生物素缀合的山羊抗兔二抗染色(单独使用二抗不产生染色)。对每100个细胞的视野对被感染细胞的数目进行计数。在用3G4处理过的细胞内，病毒局限于染成黑红色的单个细胞中，数量大约是100个细胞中有1个。这些可能是最初被病毒感染的细胞，如用CMV所观察到的一样(实施例XII)。不过，在用对照GV39G抗体处理的细胞中，病毒扩散且感染了所有细胞。此病毒复制的抑制模式类似于当用3G4处理受CMV感染的人成纤维细胞时所观察到的。因此，抗PS抗体3G4有效地并可定量地阻止了皮钦德病毒在细胞间的传播。实施例XXV用PE结合性肽衍生物进行肺瘤治疗除了耐久霉素衍生物在体外和体内的抗病毒作用外，本实施例还证明了耐久霉素^f生物对肿瘤血管系统的定位和相关的抗肿瘤作用。A.用耐久霉素-HuIgG缀合物进行肿瘤治疗首先如实施例XV所述纯化人IgG(HIgG)。用SIAB接头连接纯HIgG和耐久霉素，并纯化产生的(D-SIAB)JHgG缀合物。培养小鼠纤维肉瘤细胞系MethA，在对数期收获并重悬于DPBS中。将约l(T个MethA胂瘤细胞皮下注射入6-8周龄BALB/c雄性小鼠背中部。植入5天后，将小鼠随机分成两组(n=15)。从第10天开始，一组持续2周通过腹膜内注射接受150yg耐久霉素-HuIgG缀合物。另一组接受相等量的HuIgG作为对照。每周两次检查肿瘤体积并用公式l/2ab2(其中"a"是肿瘤的长轴，而"b"是短轴)计算。待肿瘤长至约1400mm3大小时处死小鼠。与人IgG对照相比，耐久霉素-HIgG缀合物在150jag/天的剂量下抑制了BALB/c小鼠中MethA胂瘤的生长。B.耐久霉素-HuIgG缀合物定位于肿瘤血管系统利用与上文相同的MethA小鼠肺瘤模型，当肿瘤大小达到500mm3时，通过尾静脉注射溶于100ia1PBS中的100jag(D-SIAB)nHIgG。注射相同量的人IgG作为对照。4小时后，处死小鼠并用正常的盐水灌注5分钟并用1%的低聚甲醛灌注10分钟。切下肿瘤和其他主要器官并在液氮中速冻。用OCT包埋后，将组织冰冻切片成10iam厚度的切片并放置于硅烷化的载片上。在冷丙酮中固定10分钟后，栽片用标记了过氧化物酶的山羊抗人IgG染色，以检测耐久霉素-HuIgG的生物分布。用Meca32和标记了过氧化物酶的山羊抗大鼠IgG检测组织的血管系统。此研究表明，耐久霉素-HIgG缀合物定位于经处理的动物的肿瘤血管系统。实施例XXVI耐久霉素缀合物的生物分布和特性本实施例证实了细胞不透性耐久霉素衍生物在体外无毒性、体内给予的耐久霉素衍生物的生物分布和耐久霉素抗体缀合物增强巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用的能力。A.耐久霉素-生物素缀合物是无细胞毒性的本发明的耐久霉素衍生物和缀合物被设计成使亲本耐久霉素分子的非特异性毒性影响最小化的形式。在许多实施例中，通过将耐久霉素与细胞不透性基团连接来达到此目的(实施例XV)。如实施例XV所述制备生物素化的耐久霉素构建体DLB。用MTT检测法测试未修饰的耐久霉素化合物和DLB对HUVEC的细胞毒性作用。未修饰的耐久霉素显示出剂量依赖型毒性，而DLB是无毒性的，与未处理对照相符。B.耐久霉素-生物素缀合物定位于肺中的巨噬细胞培养人乳癌细胞系MDA-MB-435，在对数期收获并重悬于DPBS中。将约107个细胞注射入6-8周龄雌性ethylic棵鼠的乳房脂垫中。通过尾静脉注射溶于100ju1PBS中的100jug耐久霉素-生物素。4小时后，处死小鼠，用正常的盐水灌注5分钟并用1%的低聚甲醛灌注10分钟。切下包括心、肺、肝、肾、脑、肠、睾丸和脾在内的主要器官并在液氮中速冻。用OCT包埋后，将组织冰冻切片成10jum厚度的切片并放置于硅烷化的载片上。在冷丙酮中固定10分钟后，载片用标记了Cy3的链霉抗生物素蛋白染色以检测耐久霉素-生物素构建体的生物分布。用Meca32和FITC标记的山羊抗大鼠IgG检测组织的血管系统。将耐久霉素-生物素缀合物静脉内注射入携带MDA-MB-435肺瘤的棵鼠导致了药物在肿瘤细胞、肾小管和肺内巨噬细胞中的沉积。在肝中沉积最少，而在脑、肠、睾丸中无可检测到的分布。对肺内巨噬细胞的定位可应用于本发明的抗病毒实施方案中。C.耐久霉素-抗体缀合物增强对凋亡细胞的吞噬作用然后对耐久霉素-抗体缀合物(耐久霉素-C44，DuC44)增强吞噬凋亡细胞的能力进行了研究。从小鼠骨髓中分离巨噬细胞并进行人工培养。用于BM巨噬细胞分离、培养和刺激的培养基是含2mM谷氨酰胺、0.37%(w/v)NaHC03、10%(v/v)热灭活FCS和O.5ng/ml小鼠GM-CSF的DMEM。通过25号针头用完全培养基直接冲洗从切下的股骨中洗下骨髓细胞。然后在完全培养基中将细胞调整成约3x1(T个细胞/ml的密度，并在8孔腔式载玻片中分配成O.5ml的等份。将细胞于37。C在含5。/。C02的潮湿容器内培养，以使巨噬细胞粘附并铺展。通过下述方法去除未贴附的细胞在每孔中加入5ml温热的PBS，适度弹击平板重悬未粘附细胞，然后轻弹载片去除未贴附的细胞。此漂洗共进行3次。将细胞于37'C在含7.5%(v/v)C02的气氛中保持5天。每隔l天换一次完全培养基，直至细胞被使用。以下方法用于用焚光细胞示踪剂标记HL-60靶细胞。临用前现配IOmMCFDASE贮液，即将一'J、瓶染料内容物溶于90u1DMSO中并用PBS稀释至10juM。离心获取HL-60细胞沉淀并吸出上清液。将细胞重悬于CFDA/PBS中并在37。C孵育15分钟。将样品离心并吸出上清液。细胞重悬于培养基中并再孵育30分钟。细胞活力和荧光被证实超过95%。在此吞噬作用检测中，将标记的HL-60细胞在UV254nm暴露5分钟，然后在37。C孵育1小时以诱导凋亡。将1(T个凋亡的HL-60细胞与巨噬细胞孵育1小时。加入10/ag/ml浓度的耐久霉素-C44缀合物。将相同浓度的小鼠抗体BBG3用作阴性对照，还包括3G4抗体用于对比。在最后45分钟向培养基中加入IO|ig/ml的Hoechst33342。用PBS洗载片3次，在4%低聚甲醛中固定15分钟。载片用稀释于0.2。/。明胶中的大鼠抗小鼠CD11抗体(CD11是巨噬细胞的标记物)染色l小时，漂洗并用经德克萨斯红标记的山羊抗大鼠二抗染色。在荧光显微镜下分析细胞。由于有CD11标记物，巨噬细胞被识别为红色的细胞。由于耙细胞中的荧光示踪剂，已吞噬了凋亡细胞的巨噬细胞被识别为绿色细胞。对红色和绿色细胞进行计数，吞噬作用以摄取呈阳性的巨噬细胞百分数进行定量。此研究表明，耐久霉素-抗体缀合物DuC44增强了巨噬细胞对凋亡HL-60细胞的吞噬作用。因此，耐久霉素部分可结合凋亡细胞的表面，使缀合物中突出的抗体部分被巨噬细胞识别。耐久霉素-抗体缀合物由此发挥了与3G4抗体相似的功能。正如所预期的，缺少Fc区域的3G4抗体(Fab)2片段不诱发高于对照水平的吞噬作用。由于早期研究显示耐久霉素-生物素缀合物在体内施用后定位于肺中的巨噬细胞，因而本试验中所显示的对巨噬细胞介导的凋亡细胞吞噬作用的刺激在本发明的治疗用途中具有重要的含义，例如治疗肺部的病毒感染。实施例XXVII在肿瘤治疗过程中的巨噬细^^浸润如前述研究中所示的，针对氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体在胂瘤治疗中是有效的。例如，3G4抗体在多个小鼠模型中特异地定位于肿瘤血管、引起肿瘤血管破坏并延迟肿瘤生长，而不引起毒性(实施例XI;实施例XVIII)。本实施例显示，用3G4治疗具有肺瘤的动物还引起单核白细胞结合肿瘤血管内皮并谦导巨噬细胞浸润到肿瘤中。A.方法对8-10只雌性SCID小鼠的组皮下注射2x107L540细胞，或同位注射1x107MDA-MB-435或MDA-MB-231细胞。对BALB/c小鼠皮下注射lxio6MethA细胞。允许肺瘤生长至平均直径为0.8-1cm(L540)、0.6-0.7cm(MDA-MB-435)、0.5-0.7cm(MDA-MB-231)或<0.1cm(MethA)。然后，小鼠通过腹膜内途径用100jag3G4抗体或对照抗体(BBG3)进行治疗，一周3次共2-3周。一周3次监测动物的肿瘤大小和体重。当对照小鼠中的肿瘤达到直径1.5-2cm时处死小鼠。B.结果用3G4治疗具有同位MDA-MB-435和MDA-MB-231肺瘤的小鼠导致单核白细胞结合肿瘤血管内皮并浸润到肿瘤间质中(图6A、图6B、图6C和图6D)。在这个图中，红色染色显示内皮，绿色染色显示巨噬细胞，和蓝色染色显示细胞核。通常，在经3G4治疗的肿瘤中的血管被单核白细胞挤满(图6D),而在来自对照即经BBG3治疗的小鼠的肿瘤中只能偶尔看见白细胞粘附至血管(图6C)。单核白细胞浸润到来自经3G4治疗的小鼠的肿瘤间质中，其数目显著大于在经BBG3治疗的小鼠中的数目(比较图6B和图6A)。粘附至肿瘤血管并浸润到肿瘤中的几乎所有(>90%)细胞表达单核细胞/巨噬细胞标记物F4/80、Ml/70(CDllb、Mac-l)和FcyR(图6A、图6B、图6C和图6D)。这些细胞缺乏嗜中性粒细胞标记物Ly-6G，NK细月包标记物Ly-49，和树突状细"包标记物CDllc。如SCID小鼠所预期的，不存在淋巴细胞标记物。总之，结果表明，粘附至肿瘤血管并浸润到肿瘤间质中的细胞分别是单核细胞和巨噬细胞。实施例XXVIIIF(abQ2片段在肺瘤治疗中是有效的针对氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体，例如3G4抗体，在肿瘤治疗中是有效的(实施例XI;实施例XVIII)。本实施例显示，3G4抗体的F(ab02片段在肿瘤治疗中与完整的3G4抗体一样有效。在对照研究中，用3G4抗体、3G4抗体的F(ab')2片段或同种型匹配的对照抗体(BBG3)治疗(在第9天)具有肿瘤的小鼠。对照动物中的肿瘤继续快速生长，而在用3G4抗体或3G4抗体的F(ab')2片段治疗的小鼠中，肿瘤生长明显减慢(图8)。F(ab02片段至少与完整的抗体一样有效(图8)，并且F(ab02片段的抗胂瘤效应在这些研究中可能被低估。这支持了下述提议抗体例如3G4增强单核细胞和巨噬细胞发动针对表达PS的肿瘤血管系统和肿瘤细胞的炎症应答的能力。抗体例如3G4可以防止胂瘤血管系统上的PS沉默宿主炎症应答，从而允许巨噬细胞分泌炎性细胞因子，例如TNF-oc、IL-1及其他，直接损害胂瘤内皮并募集更多的宿主细胞进入肿瘤(图7)。实施例XXIX膜联蛋白v二聚体比单体更好地定位于肿瘤血管实施例XXVII和实施例XXVIn涉及巨噬细胞在使用针对氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体的肿瘤治疗中的作用。从此类数据及其他信息中，本发明人形成了整个发明的受体-抗体方面。作为此类实施方案的支持，产生膜联蛋白V同型二聚体，并发现其比相应的膜联蛋白v单体更好地定位于胂瘤血管。实施例XXX3G4和P2GPI与PS的共结合本实施例证实，3G4抗体和PS之间的相互作用依赖于血浆蛋白质P2-糖蛋白I(P2GPI)。3G4在结构域II处结合P2GPI，所述结构域II不连接至从患有APS的患者中分离出的致病性抗体(其通常识别P2GPI结构域I)。数据显示，二价3G4/p2GPI复合物是增强PS结合(包括与PS阳性细胞)所必需的，因为3G4Fat/片段不具有这种活性。二价3G4/P2GPI与PS阳性细胞的结合支持了本发明的Fc-lHGPI构建体靶向PS阳性细胞并因此治疗疾病例如癌症和病毒感染的用途，所述Fc-p2GPI构建体也是二聚体。A.材料和方法1.材料Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和胰蛋白酶/EDTA从Mediatech，Inc.(Herndon，VA)获得。胎牛血清(FBS)、正常的人血清、正常的大鼠血清和正常的小鼠血清从Biomeda(FosterCity，CA)获得。新鲜的人血浆从CarterBloodCare(Dallas,TX)获得。无血浆的杂交瘤培养基、SynthecholNSO补充物、L-oc-磷脂酰丝氨酸(PS)、牛血清白蛋白(BSA)和来自鸡蛋清的卵清蛋白(OVA)从SigmaChemicalCo.(St.Louis,M0)获得。DEAE纤维素、肝素一Sepharose和Hybond-P膜从AmershamBiosciences(Buckinghamshire,UK)获得。1-棕榈酰基-2-羟基-w甘油基-3-磷酸胆碱[溶血磷脂酰胆碱(LPC)]从AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)获得。96孔Immulon-IB和-2HB微量滴定板从ThermoLabSystems(Franklin,MA)获得。Tris-HCl梯度SDS-PAGE凝胶和0pti-4CNSubstrate试剂盒从Biorad(Hercules,CA)获得。8孔玻璃腔式载玻片从BDBiosciences(Bedford,MA)获得。2.抗体被产生以结合阴离子磷脂PS的3G4小鼠单克隆抗体是本文的实施例IV和其他实施例中所描述的抗体(还参见，Ran等人，2005)。3G4最初在杂交瘤上清液中产生，但随后转化为小鼠IgG2a同种型(实施例XIX，D),并且现在在NSO小鼠骨髓瘤细胞系中产生。NS0细胞在补充有10%FBS的DMEM或含有SynthecholNS0补充物的无血清杂交瘤培养基中培养。还产生了3G4的人IgGl嵌合形式(ch3G4)(实施例XIX，B)，并且在无血清条件下由PeregrinePharmaceuticals,Inc.(Tustin，CA)生产。这种抗体已命名为"Tarvacin，，。小鼠抗人P2GPI(抗P2GPI或ot-P2GPI)mAb从USBiological(Swampscott，MA)获得。分泌C44的杂交瘤从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得，并用作3G4和抗P2GPI的对照，所述C44是秋水仙碱特异性的小鼠IgG2amAb。利妥昔单抗(人IgGl嵌合mAb)从UTSouthwesternpharmacy获得并用作ch3G4的对照。在培养物上清液中产生的所有抗体如前述实施例中所述(还参见，Ran等人，2003，其特别引入本文作为参考)进行纯化。所有二抗从JacksonImmunoresearchLabs(WestGrove,PA)获得。3.抗体片段的制备通过与胃蛋白酶一起孵育产生3G4F(ab02。通过与木瓜蛋白酶一起孵育产生3G4Fab和对照Fab7H11(抗腺病毒)。所有抗体切割产物通过FPLC进行纯化，并通过SDS-PAGE进^f亍验证。4.从人血浆中纯化P2GPI基本上如先前所述的(Polz等人，1980;Wurm等人，1984;各自特别引入本文作为参考)，从人血浆中纯化P2GPI(hP2GPI)。简言之，向汇集的血浆中加入高氯酸(70%)至终浓度为1.57%(v/v)。弃去沉淀物并用饱和Na2C03将上清液调整至pH7.5，随后为逆50mMTris，pH8.Q的广泛透析。将这种材料施加至用50mMTris，pH8.0平衡的DEAE纤维素柱以去除污染物。然后，将DEAE柱流出物施加至用50mMTris，pH8.0平衡的肝素-Sepharose亲和柱，并且用1.0MNaCl洗脱结合的蛋白质。最后，将p2GPI制剂逆PBS进行透析并通过蛋白质A/G进一步进行纯化以去除污染性IgG。最终制剂包含处于50kDa处的均质条带，如非还原性SDS/PAGE和考马斯染色所显示的。5.P2GPI和|32GPI结构域的构建和表达为了产生纯的、重组的、全长和删除形式的p2GPI，使用酵母穿梭表达栽体pPIC6aA(Invitrogen)和宿主菌林Mut+X-33(Invitrogen)。表达载体包含醇(曱醇)氧化酶基因(A0X1)的5'启动子和3'转录终止序列。该载体还具有A0X1启动子下游的酵母ot交配因子信号序列，外源cDNA可以与该启动子融合以将重组异源蛋白质分泌入培养基中。在巴斯德毕赤酵母(户.；a^ori"中的表达提供了类似于在哺乳动物细胞中的糖基化和二硫键形成。为了产生表达构建体，使用人P2GPIcDNA制备下列5种表达构建体(1)不含其关联信号肽的P2GPIcDNA的完整编码区(结构域1-5)5'引物5'-GGAATTCGGACGGACCTGTCCCAAGC-3'(SEQIDNO:12);(2)删除结构域1(结构域2-5)5'引物5'-GGAATTCGTATGTCCTTTTGC-3'(SEQIDN0:13);(3)删除结构域1和2(结构域3-5)5'引物5'-GGAATTCGCTCCCATCATCTGC-3'(SEQIDNO:14);(4)删除结构域l-3(结构域4-5)5'引物5'-GGAATTCGTAAAATGCCCATTC-3'(SEQIDNO:15);和(5)只有结构域55'引物:5'-GGAATTCGCATCTTGTAAAGTAC-3'(SEQIDN0:16)。对于所有片段的PCR使用共同的引物5'-TTCTAGATTAGCATGGCTTTAC-3'(SEQIDNO:17)。将PCR扩增的片段按阅读框插入pPICaA的EcoRI和Xbal限制性位点之间，刚好在a交配因子信号序列的下游。在每个片段的末端导入终止密码子以防止重组蛋白在C-末端融合成c-myc表位或His标签。质粒构建体在100jug/ml杀稻瘟素存在下在大肠杆菌(Aco7/)中增殖，并通过限制性分析和核苷酸测序进行验证。构建体(1)、(2)、(3)、(4)和(5)所表达的重组蛋白编码在糖基化前分别为大约36、29、24、16和9kDa的蛋白质。对于表达克隆的转化和篩选，重组质粒构建体用限制性内切酶Sacl线性化，纯化，并将10yg由于通过原生质球方法(Invitrogen)转化宿主菌林X-33。通过在包含400Mg/ml杀稻瘟素的YPD(酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基(YeastextractPeptoneDextroseMedium))平板上培育4天来选择这些构建体中每一种的转化体。这些构建体中每一种的几个克隆在包含400iiig/ml杀稻瘕素的YPD平板上再次划线培养，以确定真正的整合体。然后，将每种构建体的10个克隆在最低葡萄糖(MinimalDextrose,MD)和最低甲醇(MinimalMethanol,MM)平板上划线培养。在MD和MM平板上生长同样良好的每种构建体的5个克隆随后在液体MD和MM培养基中生长24、48、72、96和120小时。每个克隆在每个时间点的上清液和粒状沉淀通过使用抗人02GPI多克隆抗体的Western印迹法进行分析。在上清液中显示出所述蛋白质最高表达的克隆进一步用于大规模制备。对于所述重组蛋白的大规模制备，使用由Invitrogen推荐的培养条件来生产重组蛋白。将每个克隆的起始培养物在5ml经緩冲的最低甘油复合培养基(bufferedminimalglycerol-complexmedium,BMGY)中于30。C剧烈振荡培养过夜。收集细胞，用于接种25mlBMGY，并生长2天。然后，将来自25ml培养物的细胞用于接种1L经緩冲的最低曱醇复合培养基(bufferedminimalmethanol-complexmediumBMMY)(1.0%甲醇)。培养于30。C在剧烈振荡下持续4天，并且每24小时加入100%甲醇(终浓度为l.(T/。)以维持蛋白质表达。培养基通过离心(4000xg，15分钟)澄清，并且上清液在50mMTris緩冲液中于4'C透析2天，随后施加至用50mMTris緩冲液平衡的DEAE-Sephacel柱。收集流出液并施力口至肝素-Sepharose柱。用1MNaCl从肝素-Sepharose柱上洗脱P2GPI，逆50mMTris緩冲液透析，使用Amicon浓缩器浓缩，并通过Western印迹法进行分析。对每种蛋白质的N-末端进行测序以确认oc-因子前导序列的切割。蛋白质产量为10mg/L(全长P2GPI)至25mg/L(|32GPI结构域V)。6."带切口的"h02GPI的制备由如上所述从人血浆纯化出的完整的hp2GPI制备带切口的hp2GPI。hP2GPI与用纤维蛋白溶酶包被的小珠一起于37。C醉育17小时。通过离心去除小珠，并回收包含经切割的蛋白质的上清液。纯化产物的Western印迹法表明，带切口的P2GPI制剂是不含纤维蛋白溶酶的并且不含纤维蛋白溶酶自我蛋白酶解产物(与抗纤维蛋白溶酶或抗血管生长抑素抗体没有反应性)。N-末端序列分析揭示出相应于P2GPIN-末端的2个N-末端和在Lys317/Thr318切割位点处产生的新序列。7.抗PSELISA如下施行该测定法(还参见，Ran等人，2005，其特别引入本文作为参考)。用PS包被的Immunlon1B微量滴定板在1%OVA(w/v)中封闭过夜。第二天，从13.33nM的最初浓度，制备从含血清或无血清的上清液中纯化的3G4的2倍系列稀释物。在1%0VA或来自牛、人、大鼠或小鼠的10%非热灭活血清中进行稀释。平板于37X:孵育1小时，并且检测3G4的结合。所有ELISA研究进行至少3次。8.抗hp2GPIELISA如上所述并采用下列j务改进行该测定法。以lOyg/ml的浓度将h卩2GPI、带切口的h卩2GPI或重组h卩2GPI肽在96孑LImmunlon2HB微量滴定板上包被过夜。然后，将平板在1%0VA中于室温下封闭1小时。3G4、ch3G4或抗p2GPI在1%0VA中稀释至13.33nM的最初浓度，并制备2倍系列稀释物。平板于37。C孵育l小时，并检测抗体的结合。所有ELISA研究进行至少3次。9.蛋白质印迹法蛋白质样品在非还原性SDS样品緩冲液中加热至95'C5分钟。然后，将样品加载到Tris-HCl4-15%梯度SDS-PAGE凝胶上，并使用MiniProteanII装置(Biorad)分开。将分开的蛋白质转移至PVDF膜上，并在3%BSA(w/v)中封闭过夜。膜用在3%BSA中稀释至1jng/ml的抗P2GPI、3G4或对照小鼠IgG进行探测，充分洗涤，并与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG—起孵育。使用0pU-4CNSubstrate试剂盒^f吏膜显色。10，内皮细胞上的PS暴露的诱导和检测成年牛主动脉内皮(adultbovineaorticendothelial,ABAE)细胞维持在补充有10%FBS和2mML-谷氨酰胺的DMEM中。通过短暂暴露于0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA而从亚汇合(subconfluent)培养物中取出ABAE细胞，并以2xl(T细胞/孔接种至8孔腔式栽玻片。过夜培养后，细l包用PBS轻轻地洗涂，并用200jaM溶血磷脂酰胆碱(LPC)处理以诱导PS暴露。在3G4、ch3G4或对照IgG存在下在10%FBS或10。/。正常小鼠血清(MS)中于37。C进行LPC-处理。如果LPC-处理在10%MS中进行，那么加入hp2GPI作为辅助因子，因为3G4/ch3G4在MS中不结合PS(参见结果)。通过免疫荧光染色来测定PS暴露。细胞在PBS中充分洗涤，在4。/。低聚甲醛(w/v)中固定，并与缀合有生物素的抗小鼠二抗一起孵育。接下来，细胞与缀合有FITC的链霉抗生物素蛋白(JacksonImmunoresearch)—起孵育以检测抗体结合。然后，细胞用在PBS中的0.1%Triton-X100渗透化，并用缀合有德克萨斯红的鬼笔环肽(MolecularProbes,Eugene,OR)和4',6-二脒基-2-苯基p引味(DAPI;MolecularProbes)复染。^f吏用装配在Nikon显孩i:镜上的Coolsnap数码相机(Photometries,Tucson,AZ)捕获图像，并用MetaVue软件(UniversalImagingCorporation,Downingtown，PA)处理。11.与ABAE细胞结合的抗体的定量使用MetaVue图像分析软件测定抗体结合的面积，所述软件能够定量图像中发亮像素的数目。FITC荧光图像用于定量抗体结合。相应的DAPI荧光图像用于就视野中存在的细胞数目对FITC图像进行标准化。小的FITC/DAPI比表明小的抗体结合面积，而大的FITC/DAPI比表明大的结合面积。FITC/DAPI比用于确定在所选条件下相对于基线抗体结合量来说抗体结合面积的增加或减少。每次分析使用放大200倍的5个图像。数据呈现为平均的相对FITC/DAPI比，误差条表示标准差。B.结果1.3G4需要血清因子以结合用PS包被的微量滴定板当系列稀释在10%FBS中进行时，从含血清的培养基(SCM)或无血清培养基(SFM)中纯化的3G4抗体结合用PS包被的微量滴定板(图9A,实线)。相反地，当系列稀释在1%0VA(其缺乏牛血清蛋白质)中进行时，从SFM中纯化的3G4不再结合PS(图9A，虚线画)。这个发现表明，在牛血清中存在的因子介导3G4和PS之间的相互作用。有趣的是，当系列稀释在1%0VA中进行时，从SCM中纯化的3G4微弱地结合PS(图9A，虛线A)。这表明，在SCM中生长的3G4的纯化不完全去除介导3G4和PS之间相互作用所需的血清蛋白质。因此，4吏用从SFM中纯化的3G4进4亍下文描述的研究。2.在来自不同物种的血清中3G4与PS的结合为了确定来自其他哺乳动物物种的血清是否能够介导3G4和PS之间的相互作用，在10%小鼠、大鼠、人或其他血清中进行3G4的系列稀释。在大鼠和人血清存在下3G4结合PS,很类似在牛血清存在时(图9B)。然而，在小鼠血清存在下，3G4不结合PS(图9B)。在其他研究中，在仓鼠、雪貂、豚鼠、兔和猴血清存在下，3G4结合PS。因此，被3G4识别的血清蛋白质表位在所测试的除小鼠以外的所有哺乳动物物种中是保守的。3.3G4结合血清糖蛋白P2GPI在20世纪80年代末期，患有静脉和动脉血栓形成、血小板减少症和/或习惯性自然流产(recurrentpregnancyloss)的一群患者显示具有循环性抗磷脂(aPL)抗体(Hughes等人，1986;Deleze等人，1989)。这些患者被描述为具有"抗磷脂综合征"(APS)。在20世纪90年代早期，显示出许多所谓的aPL抗体不是直接识别磷脂，而是结合对磷脂具有亲和力的血清蛋白质(Galli等人，1990;McNeil等人，1990)。因此，就3G4反应性筛选已知与阴离子磷脂相互作用的一组人血清蛋白质。就P2GPI而言，将人p2GPI(hP2GPI)包被在微量滴定板上，并与小鼠抗人P2GPI抗体(抗P2GPI)、3G4或具有无关特异性的对照小鼠IgG2a(对照mlgG)—起孵育。如所预期的，抗P2GPI结合hp2GPI，而对照mlgG则不(图10A)。3G4还强烈结合用h02GPI包被的平板(图10A)。为了确定P2GPI是否是被3G4识别的唯一血清蛋白质，在SDS-PAGE凝胶上对纯化的hP2GPI和1G%人血清进行走样，并转移至膜支持物上以用于免疫印迹。3G4检测出50-kDa纯化的hP2GPI和人血清中类似大小的单个条带。重要地，兀4免疫印迹事实上等同于使用抗P2GPI抗体产生的印迹。对照mlgG抗体不检测任何蛋白质。总之，这些数据表明3G4结合血清蛋白质P2GPI。在ELISA中测试已知与阴离子磷脂相互作用的其他人血清蛋白质的3G4反应性。将等量的特定蛋白质包被在微量滴定板上，在1%OVA中封闭，并与3G4的系列稀释物一起孵育。充分洗涤平板，并使用过氧化物酶标记的第二检测抗体检测抗体结合。所有研究包括阳性和阴性对照抗体，它们如所预期的进行工作。免疫印迹和ELISA研究的结果显示于表15中，这因此将p2GPI鉴定为3G4的共结合因子。表15200680007064.8说明书第240/274页与磷脂相互作用的血清蛋白质的3G4反应性血清蛋白质3G4反应性膜联蛋白v一P2-糖蛋白I+因子XII-激肽原一氧化的LDL一蛋白c-蛋白s—凝血酶原-tPA—4.3G4在结构域II处结合p2GPIP2GPI有5个结构域，其中第5个结构域负责结合阴离子磷脂。为了确定P2GPI的哪个结构域被3G4抗体识别，产生具有不同结构域结构的重组人P2GPI构建体，并与重组全长hP2GPI并排地进行测试。这些结构域结构通过从N-末端开始进行系列截短来制备，因此如下依次缺乏每个N-末端结构域重组全长hp2GPI包含结构域I-V;已删除结构域I的hp2GPI包含结构域II-V;已删除结构域I和II的h卩2GPI包含结构域III-V;已删除结构域I、n和III的hp2GPI包含结构域IV-V;和已删除结构域I、II、11I和IV的hp2GPI只包含结构域V。将等量的全长hP2GPI和上述hP2GPI结构域构建体中的每一种包被在微量滴定板上，并与3G4的系列稀释物一起孵育。这项研究显示，只有包含P2GPI结构域II的hP2GPI构建体(结构域I-V和结构域II-V)可由3G4检测(图10B)。当删除结构域I时，3G4同样良好地结合结构域II-V(图10B)。因此，3G4在结构域II处结合P2GPI。根据关于从患有APS的患者分离的致病性抗体的已知信息，3G4247在结构域II处结合P2GPI这一发现是重要的。从患有APS的患者分离的致病性抗P2GPI抗体通常识别P2GPI的结构域I(deLaat等人，2005a)。识别结构域II的来自APS患者的抗P2GPI抗体通常不是致病性的。这可能可以解释为什么根据在各种动物模型中进行的广泛毒理学研究，缺乏与3G4相关的毒性。5.3G4和P2GPI与具有暴露的PS的细胞的共结合使用经P2GPI包被的微量滴定板来表征抗32GPI抗体的结合是具有争议的，这是由于取决于微量滴定板的类型或甚至批次所观察到的结果不一致(deLaat等人，2004a)。为了在更生理的条件下验证上述发现，开发了活细胞结合测定法。这个测定法检测并测量在用膜破裂剂即溶血磷脂酰胆碱(LPC)处理以诱导PS暴露后，与内皮细胞膜表面结合的抗体。在这个测定法中，在200jiMLPC存在或不存在下，ABAE细l包在DMEM+10%FBS中与3G4或对照mlgG—起孵育30分钟。然后，洗涤细胞，固定，并用荧光标记染色以显现抗体与细胞表面的结合。使用MetaVue软件定量3G4或mlgG结合的像素面积。所有值是相对于将3G4与未经LPC处理的细胞的结合设定为1而言的。当在正常条件下将3G4加入ABAE细胞培养基中时，没有观察到与细胞的结合。然而，当在LPC存在下将ABAE细胞与3G4—起孵育时，可容易地检测到3G4结合的众多小点。已知LPC诱导暂时的膜变形(Kogure等人，2003)，这可能引起膜不对称性的丧失和PS的暴露。定量结果显示，3G4结合面积在LPC处理后增加了超过500倍，而对照mlgG的结合仍无法检测。先前，当3G4和PS结合性分子即膜联蛋白V显示出在用仏02诱导PS暴露后结合内皮细胞时，获得了类似结果(实施例VI;实施例VII;还参见，Ran等人，2005)。重要地，经LPC处理的ABAE细胞不^皮膜不透性染料碘化丙锭或DAPI染色，这表明3G4结合细胞表面上的PS,而不是质膜内表面上的PS。为了确定P2GPI是否是3G4结合具有暴露的PS的内皮细胞所需的，在包含10%MS而不是10%FBS的培养基中进行活细胞结合测定法以防止牛P2GPI的干扰。如上文所证实的，在MS存在下，3G4不结合PS。此外，3G4通过免疫印迹不检测在10%MS中的任何蛋白质，这表明3G4不识别鼠类p2GPI。对于这项研究，将人嵌合3G4(ch3G4)用于防止由于在MS中存在的鼠类IgG检测产生的背景。当ABAE细胞在10%MS和LPC存在下与ch3G4—起孵育时，没有检测到抗体结合(图11)。相反地，将纯化的hp2GPI加入至结合反应中支持了ch3G4的广泛结合(图11),这证实ch3G4结合依赖于hp2GPI。在所有情况下，ch3G4结合依赖于LPC处理，并且在具有使用无关特异性的对照人IgG时没有检测到结合。有趣地，当ABAE细胞在10%MS和LPC存在下与2GPI—起孵育，充分洗涤，并随后与ch3G4—起孵育以检测hP2GPI的结合时，检测到非常少的ch3G4结合(图11)。这个发现表明hp2GPI在ch3G4不存在时不结合具有暴露的PS的内皮细胞，并且与P2GPI在生理条件下对阴离子磷脂膜表面具有低亲和力这一报道相一致(Willems等人，1996;Bevers等人，2005)。总之，这些数据显示，ch3G4和hp2GPI必须同时存在以结合具有暴露的PS的ABAE细胞，这暗示了ch3G々增强P2GPI与阴离子磷脂表面的亲和力。6.P2GPI的脂质结合区域是3G4共结合所必需的为了确证P2GPI的脂质结合区域是P2GPI和3G4(和ch3G4)与具有暴露的PS及其他阴离子磷脂的内皮细胞共结合所必需的，使用"带切口的"hp2GPI进行活细胞结合测定法。由于在结构域V的脂质结合区域内存在纤维蛋白溶酶介导的切割，所以带切口的h^2GPI不能结合PS及其他阴离子磷脂(Hunt等人，1993;Hunt和Krilis，1994)。当ABAE细胞在LPC不存在下与ch3G4和h卩2GPI或带切口的hp2GPI—起孵育时，没有检测到ch3G4结合(图12A)。在LPC存在下，hp2GPI能够介导ch3G4与具有暴露的PS的ABAE细胞的结合，而带切口的hp2GPI则不能介导结合(图12A)。在活细胞测定法中结合的缺乏不是由于ch3G4不能结合带切口的hP2GPI，因为当等量的蛋白质包被在微量滴定板上时，ch3G4结合带切口的hp2GPI以及hp2GPI(图12B)。这些发现证实，ch3G4/hP2GPI复合物经由hp2GPI结构域V的脂质结合区域来检测在LPC处理后暴露在ABAE细胞上的PS及其他阴离子脂质。7.抗体二价性是P2GPI共结合所必需的上文呈现的数据提示，3G4通过增强P2GPI与阴离子磷脂的亲和力来检测PS和阴离子磷脂。有趣的是，已知从许多APS患者分离的抗P2GPI抗体增加P2GPI与阴离子磷脂表面的结合(Bevers等人，2004)。此外，该现象依赖于二价抗体-p2GPI复合物的形成。为了确定二价性是否是3G4/p2GPI复合物与PS和阴离子磷脂结合所必需的，将经LPC处理的ABAE细胞与纯化的hP2GPI和不同量的ch3G4—起孵育。ch3G4结合面积以浓度依赖性方式增加，在抗体与卩2GPI之比为2:1时增至峰值(图13)。ch3G4浓度的进一步增加导致结合的浓度依赖性减少。ch3G4浓度与对具有暴露的PS的内皮细胞的结合之间的钟型关系提示，在膜表面上形成二价ch3G4/P2GPI复合物。在非常高的抗体浓度时，单价和二价复合物之间的竟争导致与经LPC处理的ABAE细胞结合的ch3G4/P2GPI复合物的量减少。为了进一步检查二价性是否是结合具有暴露的PS的内皮细胞所必需的，产生3G4F(ab')2和3G4Fab'单体，并与完整的3G4—起用于活细胞结合测定法中。如所预期的，完整的3G4结合经LPC处理的ABAE细胞，但不结合未处理的细胞(图14A)。等量浓度的3G4F(aV)2也结合经LPC处理的ABAE细胞，但3G4FaV的结合是可以忽略的(图14A)。3G4F(ab02的结合相对于3G4来说明显减少(图14A)可能是由于多克隆二抗与3G4F(aV)2上缺少的Fc表位的结合丧失。甚至在2uM的浓度下，在ABAE细胞上也没有检测到3G4Fab'的结合(图14B)，所述浓度超过了结合包被在微量滴定板上的P2GPI所需浓度的IOOO倍。此外，3G4FaV以浓度依赖性方式抑制ch3G4/^2GPI与经LPC处理的ABAE细胞的结合(图14C),而具有无关特异性的对照Fat/则不。3G4Fab'抑制ch3G4结合的能力证实，3G4Fab'能够结合&2GPI，并且单体3G4FabVP2GPI复合物不能结合具有暴露的PS的内皮细胞。这些数据支持下述假设二价3G4/(32GPI复合物是结合阴离子磷脂表面所必需的。如图10B中所示，3G4抗体在结构域II处结合P2GPI，并且如图12A和图12B中所示，P2GPI结构域V的脂质结合区域是3G4(和ch3G4)和p2GPI共结合暴露于内皮细胞上的PS所必需的。此外，如本文所证实的，抗体二价性是3G4(和ch3G4)和|32GPI共结合暴露的PS所必需的。因此，本发明人已提出了抗体和P2GPI共结合暴露于膜外表面上的PS的模型，例如在激活的内皮细胞、肺瘤血管内皮细胞和肺瘤细胞上以及在受病毒感染的细胞上发生的(图15)。实施例XXXIFc-P2GPI的制备和表征本实施例涉及示例性Fc-P2GPI构建体的制备和表征。在这个构建体中，小鼠IgGh的Fc区附着至全长小鼠P2GPI(结构域I-V)，以形成鼠类Fc-P2GPI或Fc-2GPI。小鼠IgG2aFc用作二聚体化结构域和用于提供效应器功能。所得二聚Fc-p2GPI构建体具有各种用途，包括靶向肿瘤血管和受病毒感染的细胞，其中每一种具有暴露的PS。使用Fc区的优点是，Fc-P2GPI构建体可以标记所靶向的细胞以通过宿主免疫系统进行攻击。A.制备尽管已设计了各种Fc-p2GPI构建体，但本实施例的示例性Fc-p2GPI(Fc-mp2GPI)构建体使用鼠类Fc区作为N-末端和使用鼠类卩2GPI的结构域I-V作为C-末端。因此，所述Fc-P2GPI包含来自小鼠IgG^的Fc区的二硫键键合的铰链区和两个CH2和CH3结构域，每个CH3结构域的C-末端连接至两个全长小鼠P2GPI蛋白的N-末端(图16)。为了制备表达质粒，通过PCR从2aG4构建体中扩增出3G4轻链的信号序列；通过PCR从2aG4构建体中扩增出包含铰链、CH2和CH3结构域的小鼠IgG2aFc区；并且通过RT-PCR从商购获得的小鼠肝RNA中扩增出小鼠P2GPI。所得Fc-mP2GPI蛋白序列显示于图18A中。切割mlgGK信号序列(SEQIDNO:18)，留下如SEQIDNO:19所示的成熟的Fc-m&2GPI(图18A)。质粒图显示于图17中，并且质粒的完整序列如SEQIDNO:25中所提供的。用FuGENE6试剂将Fc-mP2GPI构建体转染到CHO细胞中。2天后，收集上清液并用于几个测定法中。使用图18B中的序列信息可以制备相应物人Fc-p2GPI(Fc-h(32GPI),所述序列信息提供了人IgG:重链恒定区的示例性氨基酸序列(登录号P01857;SEQIDNO:21)和人02GPI的完整序列(登录号1C1ZA;SEQIDNO:22),包括结构域I、II、III、IV和V的定位。人铰链、CH2和CH3结构域将附着至人P2GPI的结构域I、II、III、IV和V,以提供SEQIDNO:23的Fc-hP2GPI。B.Fc-mP2GPI是二聚体所选系统对于表达Fc-m02GPI来说是有效的。图19显示来自使用两种不同的Fc-mp2GPI克隆(#8和#18)的捕获测定法的结果，其中Fc-mP2GPI细胞培养物上清液结合抗小鼠IgG。对Fc-mp2GPI蛋白样品实施凝胶电泳。在非还原性凝胶条件下，检测到预期二聚体大小的条带(在凝胶上的表观Mw为UOkDa)。在还原性条件下，检测到较小大小的条带(在凝胶上的表观Mw为90-100kDa)。C.Fc-mP2GPI结合PS和具有暴露的PS的细胞Fc-mP2GPI能够结合在经PS包被的板上的PS。使用用PS包被的孩i量滴定板，确定Fc-mP2GPI细胞培养物上清液(#8和#18)以浓度依赖性方式结合PS(图20)。与3G4抗体和嵌合形式(ch3G4或Tarvacin)—样，Fc-mP2GPI结合不局限于PS，而是延伸至其他阴离子磷脂。磷脂结合测定法(在10%FBS中)的结果显示，Fc-mP2GPI细胞培养物上清液结合阴离子磷脂PS、PA、PI和PG，但不结合中性脂质PC和SM。Fc-mP2GPI还能够结合暴露在细胞表面上的PS。正在经历凋亡的细胞在外表面上暴露PS。在使用正在经历凋亡的ABAE细胞的研究中，发现Fc-mP2GPI染色凋亡细胞(图22A、图22B和图22C)。箭头突出显示凋亡细胞，其是圆形的并且具有致密的细胞核。还可以不经历凋亡而诱导细胞在细胞表面上呈递PS。当ABAE细胞在LPC存在下进行孵育时，发生暂时的膜变形，引起膜不对称性的丧失和PS暴露。使用经LPC处理的ABAE细胞，还发现Fc-mP2GPI结合暴露在细胞表面上的PS，如绿色染色的小点所示(图23A和图23B)。在未经LPC处理的细胞上或使用对照上清液看不到小点染色。实施例XXXII二聚02GPI结合具有暴露的PS的内皮细胞才艮据实施例XXX中所描述的结果，并且为了进一步验证实施例XXXI中列出的信息，本实施例提供的数据显示，二聚P2GPI在3G4抗体不存在下结合具有暴露的PS的内皮细胞。在这些研究中，使用人工P2GPI二聚体，其通过使hP2GPI与因子XI的苹果4二聚体化结构域(apple4dimerizationdomain)的C-末端融合来产生(Lutters等人，2001)。这种P2GPI不具有通过附着至Fc区而提供的优点，如本申请中早期所描述的。然而，这种二聚体与具有暴露的PS的细胞的结合验证了Fc-P2GPI二聚体由于结合PS阳性细胞的用途。ABAE细胞用LPC处理以诱导PS暴露，并与纯化的hp2GPI、hp2GPI二聚体或包含经破坏的脂质结合结构域的突变型hp2GPI二聚体一起孵育。如所预期的，单体hp2GPI与经LPC处理的ABAE细胞的结合是可以忽略的(图24A)。相反地，hP2GPI二聚体强烈结合经LPC-处理的细胞(图24B),但不结合未经LPC处理的细胞(图24D)。还发现hp2GPI二聚体的结合依赖于功能性的脂质结合结构域(图24C)。这些数据表明，二价P2GPI构建体结合具有暴露的PS的细胞。本发明的Fc-P2GPI二聚体还将会结合具有暴露的PS的细胞，例如肿瘤血管内皮细胞、肿瘤细胞、受病毒感染的细胞和病毒颗粒。然而，Fc-p2GPI构建体将具有另外的优点，即Fc区将促进宿主效应器功能以增强疾病治疗。另外的试剂还可附着至Fc-P2GPI构建体，例如毒素、细胞因子、放射性同位素、药物等，以递送治疗有效负荷至PS阳性耙细胞。无需过多实验，根据本公开内容即可制备和执行本文所公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经以优选实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所述组合物和方法，和在本文所述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化，而不偏离本发明的构想、精神和范围。更具体而言，显而易见的是，可以用化学和生理学上相关的某些药剂替代本文所述的药剂而仍获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员而言显而易见的所有这些相似替代和修饰，被认为是位于由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构想之内。参考文献特别地将下列参考文献引入本文作为参考，以便他们提供对于本AbramsandOldham，A/owoc/owa/Jw^Z>o<i}7T^n3pyC""wce厂，FoonandMorgan(Eds.)，Marti腿NijhoffPublishing,Boston，pp.103-120,1985.Adler,Ng,Rote,"Monoclonalantiphosphatidylserineantibodyinhibitsintercellularfusionofthechoriocarcinomaline,JAR,"肠/.53(4):905-910,1995.Alving，Banerji，FoglerandAlving,"Lupusanticoagulantactivitiesofmurinemonoclonalantibodiestoliposomalphosphatidylinositolphosphate",C7〖w.￡平Zwmwwo/"69:403-408,1987.Anderson,Croyle,Lingrel，"PrimarystructureofageneencodingratT-kininogen,"G^"e,81(1):119:28,1989.Andree,Reutelingsperger,Hauptmann,Hemker,Hermens，Willems，"Bindingofvascularanticoagulanta(VACoc)toplanarphospholipidbilayers，"JS/o/,C72细.，265:4923-4928,1990.Antibodies:丄aZ0ra^9rj/M"nwa/,CoWS戸7gT/"rZw丄aZ0m/^A7,1988.Aoki，Uenaka，Aoki,UmedaandInoue,"Anovelpeptideprobeforstudyingthetransbilayermovementofphosphatidylethanolamine,"J.116:291-297，1994.Asano，Yukita,Matsumoto,Kondo，Suzuki,"Inhibitionoftumorgrowthandmetastasisbyanimmunoneutralizingmonoclonalantibodytohumanvascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactor,"Ca"cw/es1.,55:5296-5301,1995.Bacaa/.,"Antibodyhumanizationusingmonovalentphagedisplay,"J.Biol.Chem.,272(16):10678-84，1997.Balasubramanian，Chandra,Schroit,"Immuneclearanceofphosphatidylserine-expressingcellsbyphagocytes;theroleofbeta2-glycoproteinIinmacrophagerecognition,"J!Biol.Chem.,272:31113-17，1997a.Balasubramanian,Chandra，Schroit,"Macrophagerecognitionofphosphatidylserine-expressingcells:theroleofbeta(2)-glycoproteinIinimmuneclearance,"5/00d，90:2864,1997b.Balasubramanian,Schroit,"Characterizationofphosphatidylserinedependentbeta(2)-glycoproteinImacrophageinteractions-implicationsforapoptoticcellclearancebyphagocytes,"Blood,.273:29272-77，1998.BalasubramanianandSchroit，"Aminophospholipidasymmetry:amatteroflifeanddeath,"X"服Tev.P/7^zW,，65:701-734,2003.Balasubramanian，Maiti，Schroit，"Recruitmentofbeta-2-glycoprotein1tocellsurfacesinextrinsicandintrinsicapoptosis,」/^to57、，10:439-446，2005.Barbas,Kang,Lerner,Benkovic,"Assemblyofcombinatorialantibodylibrariesonphagesurfaces:thegeneIIIsite,"Ptoc.Ato/.爿cfldSc'.，88(18):7978-7982,1991,Barbas""/.,尸亂胸/.Jo^.5W.,园，88:4457-4461,1992.Barras,Bain,HoekstraandLerner,"Semisyntheticcombinatorialantibodylibraries:achemicalsolutiontothediversityproblem,"脂/.5W,89:4457-4461,1992，Beck,Luster，Miller,"Combinationofamonoclonalanti-phosphatidylserineantibodywith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