一种不动杆菌及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用
【技术领域】
[0001]
[0002]本发明属于功能性细菌的筛选及其应用技术领域，具体涉及一种不动杆菌及其在磷脂酰丝氨酸合成上的应用。
【背景技术】
[0003]自1812年Uauquelin在人脑中发现卵磷脂之后，人们又相继从蛋黄和植物种子中发现卵磷脂的踪迹。卵磷脂作为细胞膜的重要组成部分具有良好的生理功能，同时其还具有保湿、乳化、抗氧化等功效。进入21世纪磷脂作为第三大保健品和食品乳化剂已经吸引了世界各国的关注。磷脂俗称卵磷脂，狭义的是特指磷脂酰胆碱(Phosphatidyleholin，PC)，广义上讲是一类含有磷脂酰甘油酯混合物的总称。依据磷脂所含有的磷脂酰基的不同可以将磷脂分为:磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidy lethano lamin, PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PL)、磷脂酸丝氨酸(Phosphatidylserine、PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycero, PG)和神经鞘磷脂(Springmyehn, SM)。
[0004]在众多磷脂组分中PS是唯一能够调控细胞膜关键蛋白的状态的磷，能够帮助细胞膜保持韧，维持细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢合成。此外，PS对生物的神经系统具有重要作用可影响脑内化学讯息的传递，并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要元素。研宄报道，PS能够改善老年人阿尔茨莫氏症(Alzheimen’ s Disease)，修复大脑损伤提高认知力，缓解紧张压力和身体疲劳、治疗抑郁症等作用。PS广泛存在日常的食物当中，但是含量稀少不能够满足人体需求；并且随着年龄的增长进入30岁之后，人体的PS和磷脂成分逐渐减少，人体需要每天补充100-300mg纯PS，所以PS的生产开发具有重要意义。
[0005]目前PS的生产主要有提取法和酶合成法。提取法主要从植物卵磷脂、动物内脏、脑组织中提取PS，提取工艺复杂且需要大量的有机试剂，由于磷脂结构和性质的相似性化学提取只能获得粗品，难以制备高纯度的多功能特性的单一磷脂，不能够满足医药、食品等领域的使用。生物酶法由于其具有广泛的底物特异性、反应条件温和、副产物少、来源广泛且方便等优点，已经成为PS制备最有开发潜力的方法。该方法操作简单，有机试剂使用量少，并且酶法合成的产物容易提取分离，可以极大地降低PS生产成本。
[0006]磷脂酶D (Phospholipid D，EC 3，L 4.4，缩写PLD)能够催化水解磷脂分子中的磷酸和有机碱(如胆碱、乙醇胺等)羟基成酯的键，即4位酯键，生成磷脂酸(Phosphatidicacid, PA)和有机碱；同时，还能通过碱基交换反应催化各种羟基化合物(如丝氨酸)与磷脂碱基结合形成新的磷脂(如PS)。因此，PLD碱基交换活性可以用于磷脂的定向改造、药物的合成以及单一磷脂、稀有磷脂的制备，具有重要的商业价值。已报导的产磷脂酶D的微生物主要有链霉菌(Streptomyces)、棒状杆菌(Corynebacterium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏杆菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonad)、哈维氏弧菌(Vibr1 harveyi)、錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、无色杆菌(Achromobacter)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。但是，目前大部分产磷脂酶D的微生物在催化底物PC以后生成过多的水解产物PA，而合成改性磷脂(如PS)的量较低，从而限制了 PLD在制备单一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性过程中的应用。因此，有必要筛选一种能减少PA合成量的菌株。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种不动杆菌及其在磷脂酰丝氨酸合成上的应用，从而弥补现有技术的不足。
[0008]本发明首先提供一种不动杆菌(Acinetobacter sp.) 0UC_Qa2，该菌株于2015年01月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microb1logical CultureCollect1n Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC N0.10471。
[0009]本发明的不动杆菌用于生物催化磷脂酰胆碱(PC)合成磷脂酰丝氨酸(PS)。
[0010]本发明的不动杆菌(Acinetobacter sp.)0UC_Qa2具有高的碱基交换活性，应用其催化磷脂酰胆碱(PC)合成磷脂酰丝氨酸(PS)后，通过核磁共振分析发现底物PC转化率为47.8%，PS合成的选择性为74%，而水解产生PA的量低(26% )，具有非常好的应用前景。
【附图说明】
[0011]图1:本发明菌株0UC-Qa2的筛选平板图；
[0012]图2:本发明菌株0UC_Qa2的进化树图；
[0013]图3:本发明菌株0UC_Qa2用于磷脂酰丝氨酸合成图。
【具体实施方式】
[0014]下面将结合实例对本发明做进一步的说明。但实施例中所用的条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的方法，可按照常规条件操作。
[0015]实施例1菌株筛选
[0016](I)菌株筛选及培养
[0017]将新鲜采集的豆磷脂压榨残渣在无菌操作台内均质后取Ig于50mL(250mL三角瓶)灭菌的富集培养基中培养，培养条件为28°C 180rpm培养72h。将富集好的菌液梯度稀释至10_7，每个稀释梯度取0.1mL均匀涂布于筛选培养基平板上，28°C恒温培养。提取在筛选平板上产生水解圈的单菌落(图1)，划线挑取单克隆于种子培养基中28°C、180rpm震荡培养12小时接种于发酵培养基中发酵培养。发酵完成通过离心(4°C、I100g离心1min)获得其上清并检测磷脂酶D水解活性，经测定0UC-Qa2的水解活力为0.336U/mL。
[0018]富集培养基:10g/L蛋白胨，3g/L NaCl，0.5g/L MgSO4.7H20，lg/L CaCl2, pH 6.5，121°C蒸汽灭菌20min冷却后加入1mL新鲜蛋黄。
[0019]筛选培养基:10g/L蛋白胨，3g/L NaCl, 0.5g/L MgSO4.7Η20，lg/L CaCl2，20g/L 琼脂，pH 6.5，121°C蒸汽灭菌，20min冷却后加入20mL新鲜蛋黄。
[0020]种子培养基:10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，pH 7.4，121°C蒸气灭菌20mino
[0021]发酵培养基:10g/L蛋白胨，3g/L NaCl，0.5g/L MgSO4.7H20，lg/L CaCl2, pH 6.5，121°C蒸汽灭菌20min冷却后加入2%新鲜蛋黄。
[0022](2)0UC_Qa2 的鉴定
[0023]利用TIANGEN细菌全基因提取试剂盒提取0UC-Qa2的基因，通过16S rDNA对其进行细菌鉴定。对其16S PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI比对，发现与0UC_Qa2最相似的菌株为 Acinetobacter rad1resistens WC-A-157 (NCBI 编号 JN669146.1)。同时发现0UC-Qa2 与 Acinetobacter rad1resistens 在进化上最为相近(图 2)。
[0024]该菌株于2015年01月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrob1logical Culture Collect1n Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC N0.10471。
[0025]实施例2 0UC-Qa2应用于磷脂酰丝氨酸合成
[0026]将0UC_Qa2的发酵液冷冻干燥，在双相体系中合成磷脂酰丝氨酸。反应体系由酶粉70mg (水解活力23U)，pH 5.6、0.2mol/L醋酸缓冲液(含有lmol/L丝氨酸和0.lmol/LCaCl2) ImL, 20mg/mL乙醚溶解的95%的蛋黄卵磷脂lmL，50°C水浴振荡反应12h。反应结束后静置待溶液分层，将上层乙醚相提取出来氮吹干，正己烷溶解定容后过0.22 μπι有机滤膜，核磁共振定量检测反应体系中的PA、PC、PS。测定结果见图3。
[0027]对图3中的PA、PS、PC进行峰面积积分，再与磷标准曲线对比计算成反应体系中PA、PS、PC的含量。结果显示反应体系中PA:PS:PC的面积比为1.01:2.87:2.06。同时计算得出70mg酶粉(水解活力为23U)50°C，反应12小时共生成PS的量为13.lg，远高于文献报道其他PLD的活力。
[0028]由图3数据计算出0UC_Qa2产PLD合成PS的转化率和选择性，其中合成PS的转化率=PS/ (PS+PA+PC) X 100%，计算获得0UC-Qa2产PLD合成PS的转化率为47.8%。
[0029]合成PS的选择性=PS (PS+PA) X 100 %，计算获得0UC_Qa2产PLD合成PS的选择性为74%。
[0030]利用0UC-Qa2发酵生产的PLD酶进行了 PS合成，通过核磁共振检测0UC_Qa2PLD合成PS的转化率为47.8%，PS合成的选择性为74%，而水解产生PA的量低(26% )，具有非常高的应用前景。
【主权项】
1.一种不动杆菌，其特征在于，所述的不动杆菌的保藏编号为CGMCC N0.10471。
2.一种菌液，其特征在于，所述的菌液由权利要求1所述的不动杆菌发酵制成的。
3.权利要求1所述的不动杆菌在合成磷脂酰丝氨酸中的应用。
4.一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的不动杆菌催化磷脂酰胆碱来合成磷脂酰丝氨酸。
【专利摘要】本发明提供一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)OUC-Qa2，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.10471。本发明的不动杆菌用于生物催化磷脂酰胆碱(PC)合成磷脂酰丝氨酸(PS)。本发明的不动杆菌(Acinetobacter sp.)OUC-Qa2具有高的碱基交换活性，应用其催化磷脂酰胆碱(PC)合成磷脂酰丝氨酸(PS)后，通过核磁共振分析发现底物PC转化率为47.8％，PS合成的选择性为74％，而水解产生磷脂酸(PA)的量低(26％)，具有非常好的应用前景。CGMCC NO.1047120150130
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20, C12P13-04
【公开号】CN104845922
【申请号】CN201510325298
【发明人】毛相朝, 邱永乾, 薛长湖
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月15日