一株海洋卓贝尔氏菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体是涉及一株海洋卓贝尔氏菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 天然水体中，氮以-3至+5九种不同价态形式存在，在生物及非生物因素的共同作 用下，它们在水体内不断地迀移转化，构成一个复杂的动态循环。其中亚硝酸盐是这一循环 过程中的一个重要中间产物，同时也是一种具有潜在毒性的无机氮化合物。水体中亚硝酸 盐作为氮素转化的中间产物其产生及消除主要包含在硝化与反硝化两个反应中。正常情况 下，水体中存在的亚硝酸盐含量很低，不会影响养殖动物的正常生长。但是由于现代商业化 养殖模式的集约化管理与高密度养殖很容易引起硝化细菌活性失调、反硝化过程不平衡， 从而导致水体亚硝酸盐的积累，对养殖动物产生毒害作用甚至引起养殖动物的死亡，最终 造成巨大的经济损失。因而如何从养殖废水中去除氮素污染成为了水产养殖的一个研宄热 点。相较于物理、化学脱氮方法，目前认为生物脱氮法去除氮素污染更为经济有效。参与生 物脱氮的微生物主要包括硝化细菌和反硝化细菌。反硝化细菌可通过参与反硝化过程的一 系列酶将硝酸盐和亚硝酸盐转化成气态氮，将氮素从水体环境中脱除，改善养殖环境水质， 避免水体富营养化。
[0003] 传统理论认为，细菌的反硝化作用是一个严格的厌氧过程，反硝化细菌会优先利 用氧气作为最终电子受体。好氧反硝化细菌的发现，突破了传统的认识，同时也为人们研宄 新的生物脱氮技术提供了新的依据。好氧反硝化，是指在有氧条件下能以N(V-N、N(V-N作 为最终电子受体，进行反硝化过程。然而，目前关于好氧反硝化菌的专利和文献资料不多， 尤其是海洋来源的更少，并且已报道的菌株对于高浓度含氮废水的脱除效率不高。分离筛 选具有盐度适应范围广、脱氮效率高的好氧反硝化细菌，并将之应用到含氮废水的处理中 具有实际的意义。
[0004] 中国专利CN201310100699公开一株好氧反硝化细菌及其应用。涉及一株好氧反 硝化细菌卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )NKDN_01，CGMCC No. 7330,及利用该菌进行污水处 理去除污水中总氮的方法。菌株接种至LB培养基中，30°C振荡培养至菌浓为0D600 = 2. 0， 以1 %~5%的接种量接种于高氮废水中，20~30°C振荡培养2~4d，维持溶氧在2. 5ppm 以上；离心取上清，测定总氮、亚硝态氮和硝态氮，结果显示总氮去除效果明显。该菌在污水 处理工程中有很好的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8。
[0006] 本发明的第二目的在于提供海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl-8在海淡水 养殖生物脱氮中的应用。
[0007] 所述海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8,已于2015年04月29日保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC N0:M 2015267。
[0008] 所述海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8,是从南美白对虾海水养殖池定向 富集分离获得。所述海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl_8也保藏于中国海洋微生物 菌种保藏管理中心（MCCC)，保藏编号为：MCCC 1A10905。
[0009] 海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8具有以下特征：
[0010] 1、形态：海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. ) CYT1-8,革兰氏阴性，在Marine Agar 固体培养基上28°C培养24h，菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明，菌落直 径大小约为1~2mm。
[0011] 2、生理生化：海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl_8生长盐度为0~12%， 15%以上不生长，最适为0~3%;生长pH为5~11，最适为6. 5~9. 5。生长温度为10~ 45°C，最适为30~40°C。氧化酶（+)，接触酶（_)，硝酸盐还原（+)，吲哚试验（_)，能发酵 D-葡萄糖产酸，明胶液化（_)，尿素酶（+)，0 -葡萄糖苷酶（_)，0 -半乳糖苷酶（_)，能利 用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸， 不能利用癸酸、己二酸、、L-阿拉伯糖、D-甘露糖。
[0012] API ZYM结果显示，海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8具有碱性磷酸酶、酯 酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、酸性磷酸酶、葡（萄）糖苷酶，不具有胱氨 酸氨肽酶、胰蛋白酶、a -半乳糖苷酶、0 -半乳糖苷酶、a -胰凝乳蛋白酶、0 -葡（萄）糖 苷酸酶、a -葡（萄）糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、a -甘露糖苷酶、a -岩藻糖苷酶等酶 活性。
[0013] 3、16S rRNA和gyrB基因序列分析：按照常规方法抽提海洋卓贝尔氏菌 (Zobellella sp. )CYTl-8的基因组DNA，并对16S rRNA和gyrB基因序列进行测定，海洋卓 贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl-8 的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID NO. 2 所示。
[0014] 经BLAST比对分析，海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYTl-8的16S rRNA基 因与 Zobellella denitrificans ZD1 (T)DQ195675 相似性最高，分别为 99. 04%，其次为 2.&61'(^1^1&兀2671 (1')腿475140 和2.七&1￥&11611818 21'1(1')0〇19567，分别为 97.46%和 97.06%。gyrB基因序列的比对结果表明，海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl-8与 Zobellella denitrificans ZD1(T)和Z.taiwanensis ZT1(T)两株模式种的同源性分别为 91. 4%、91. 3%〇
[0015] 综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16SrDNA和gyrB基因序列分析结果，本 发明的海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8属于卓贝尔氏菌属，为该属的一个潜在新 种，具体为海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl_8。
[0016] 本发明的海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp.)CYTl_8能快速高效去除硝酸盐和亚 硝酸盐，且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。
[0017] 海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8的脱氮作用在含氮液体中进行，所述含 氮液体溶解氧浓度为〇~7ppm。
[0018] 所述含氮液体的碳源为甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠及琥珀酸 钠，优选碳源为柠檬酸钠。
[0019] 所述含氮液体的C/N为3~24,优选C/N为12~24。
[0020] 所述含氮液体的pH值为5. 5~0? 5,优选pH值为6. 5~9. 5。
[0021] 所述含氮液体的盐度为0~60g/L，优选为0~30g/L。
[0022] 所述含氮液体的温度为15~45°C，优选为30~40°C。
[0023] 在优选条件下，海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8能在16h内将100mL的 NCV-N 和 NCV-N 完全去除，分别在 72h、84h、96h 和 168h 将 500mL、600mL、700mL 和 1000mL N02 _N完全脱除，具有尚效脱氣能力。
[0024] 该菌株在好氧条件下，能快速高效去除水体环境中的硝酸盐和亚硝酸盐，且对高 浓度的亚硝酸盐具有很强的耐受性和去除能力。
[0025] 由此可见，海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1-8可在处理亚硝酸盐废水、在 海淡水养殖生物脱氮、在亚硝酸盐毒害去除、在制备用于任何形式的好氧厌氧反硝化脱氮 活菌制剂等中应用。
[0026] 所述海淡水养殖生物脱氮包括但不限于海水养殖废水或淡水养殖废水的脱氮。
[0027] 本发明与现有技术相比有如下突出效果：
[0028] 1、本发明的海洋卓贝尔氏菌（Zobellella sp. )CYT1_8以铵盐、硝酸盐或亚硝酸盐 为唯一氮源均能正