一种海洋环境α变形菌群落检测基因芯片及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种海洋环境α变形菌群落检测基因 芯片及应用，本发明的芯片能识别海洋环境中不同科的α变形菌。
【背景技术】
[0002] 海洋环境检测是是保护海洋生态环境可持续健康发展的重要环节。海洋环境监 测包括化学监测和生物监测。生物监测主要是对海洋环境中的浮游生物、底栖生物、海草、 红树植物、珊瑚、大肠杆菌等生物种类组成和数量分布进行监测，缺少对海洋细菌群落的监 测。细菌作为一类多样性最高的生命形式，在海洋环境中承担着重要的生态功能（碳循环， 氮循环，硫循环，磷循环和金属循环等）。细菌复杂的群落结构、功能、相互作用和动态变化 对海洋生态功能的维持有着重要意义。因此，增加对海洋环境各个细菌种类组成和数量分 布的监测，对建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系来说十分必要。
[0003] 目前针对海洋大肠杆菌的监测主要是利用传统的分离培养方法。这种监测方法繁 琐、耗时、耗力，不适合对多种细菌同时进行监测。亟需发展高通量、高效、便捷的海洋细菌 群落监测技术。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测海洋环境α变形菌群落的基因芯片 及应用，即可平行、快速、高通量的检测海洋环境α变形菌群落，使基因芯片技术更好的应 用于海洋环境监测，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明的基因芯片，包括有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测 海水中 Acetobacteraceae、Beijerinckiaceae、Bradyrhizobiaceae、Brucellaceae、 Caulobacteraceae、Cohaesibacteraceae、Erythrobacteraceae、Hyphomicrobiaceae、 Hyphomonadaceae、Kordiimonadaceae、Methylobacteriaceae、Methylocystaceae、 Parvularculaceae、 Phyllobacteriaceae、 Rhizobiaceae、 Rhodobacteraceae、 Rhodobiaceae、 rhodospirillaceae、 Rickettsiaceae、 Sneathiellaceae、 Sphingomonadaceae、Xanthobacteraceae 的探针；
[0006] 其中用于检测Acetobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-2中的任一种或几种；
[0007] 用于检测Beijerinckiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3-5 中的任一种或几种；
[0008] 用于检测Bradyrhizobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:6_8 中的任一种或几种；
[0009] 用于检测Biaicellaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:9-10中 的任一种或几种；
[0010] 用于检测Caulobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 11-13中的任一种或几种；
[0011] 用于检测Cohaesibacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 14-15中的任一种或几种；
[0012] 用于检测Erythrobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 16-17中的任一种或几种；
[0013] 用于检测Hyphomicrobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 18-20中的任一种或几种；
[0014] 用于检测Hyphomonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:21-23 中的任一种或几种；
[0015] 用于检测Kordi imonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:24-26中的任一种或几种；
[0016] 其中，用于检测Methylobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:27-29中的任一种或几种；
[0017] 用于检测Methylocystaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 30-31中的任一种或几种；
[0018] 用于检测Parvularculaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:32-33中的任一种或几种；
[0019] 用于检测Phyllobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:34-35中的任一种或几种；
[0020] 用于检测Rhizobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 36-38中 的任一种或几种；
[0021 ] 用于检测Rhodobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 39-41中的任一种或几种；
[0022] 用于检测Rhodobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 42-44中 的任一种或几种；
[0023] 用于检测rhodospiriIlaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:45-47中的任一种或几种；
[0024] 用于检测Rickettsiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:48-49 中的任一种或几种；
[0025] 用于检测Sneathiellaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 50-52 中的任一种或几种；
[0026] 用于检测Sphingomonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:53-55中的任一种或几种；
[0027] 用于检测Xanthobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:56-57中的任一种或几种；
[0028] 在本发明的基因芯片上还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探 针、表面化学质控探针中的任一种或几种，
[0029] 其中杂交阳性对照质控探针（PC)的核苷酸序列为SEQ ID NO:58 ;
[0030] 杂交阴性对照质控探针（NC)的核苷酸序列为SEQ ID NO:59 ;
[0031] 表面化学质控探针（CK)的核苷酸序列为SEQ ID N0:60,是一条用HEX染料标记的 40个T的寡核苷酸序列。这些荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检 测过程中起到定位探针位置的作用。
[0032] 本发明芯片所使用的探针可以快速、高通量地对海水中的α变形菌群落进行检 测，最大可以检测22个科的α变形菌信息，从而为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的 技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
【附图说明】
[0033] 图1 :本发明基因芯片的探针布局示意图。
[0034] 图2 :本发明基因芯片的特异性检测图。
[0035] 图3 :本发明基因芯片的灵敏性检测图。
[0036] 图4 :本发明基因芯片的应用效果图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述，下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0038] 实施例1 :放线菌群落检测基因芯片的探针设计
[0039] 采用高通量测序技术和克隆文库技术获得东海海水中α变形菌群落信息。根 据α变形菌群落16S rRNA基因序列信息，利用ARB软件对东海海水中22个主要的α 变形菌科（Acetobacteraceae、Bei jerinckiaceae、Bradyrhizobiaceae、Brucellaceae、 Caulobacteraceae、Cohaesibacteraceae、Erythrobacteraceae、Hyphomicrobiaceae、 Hyphomonadaceae、Kordiimonadaceae、Methylobacteriaceae、Methylocystaceae、 Parvularculaceae、 Phyllobacteriaceae、 Rhizobiaceae、 Rhodobacteraceae、 Rhodobiaceae、 rhodospirillaceae、 Rickettsiaceae、 Sneathiellaceae、 Sphingomonadaceae、Xanthobacteraceae)进行探针设计，并在BLAST中进行验证，获得用 来制备基因芯片的探针序列。
[0040] 申请人从灵敏度和检测特异性的角度出发，对上述可能作为探针的序列进行筛 选，最终确定了如下的探针序列：
[0041 ] 用于检测Acetobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2 ；
[0042] 用于检测Bei jerinckiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3-5 ；
[0043] 用于检测Bradyrhizobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6-8 ；
[0044] 用于检测Biaicellaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:9-10 ;
[0045] 用于检测Caulobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:11-13 ；
[0046] 用于检测Cohaesibacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:14-15 ；
[0047] 用于检测Erythrobacteraceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:16-17 ；
[0048] 用于检测Hyphomicrobiaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:18-20 ；
[0049] 用于检测Hyphomonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:21-23 ；
[0050] 用于检测Kordi imonadaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO :24-26 ；
[0051 ] 其中，用于检测Methylobacteriaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:27-29 ;
[0052] 用于检测Methylocystaceae微生物的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO :30-31 ；
[0053] 用于检测Parvularculaceae微生