一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检 测技术（Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA_LFD) 鉴定结核分枝杆菌复合群的方法和相关引物与探针以及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)中能引起人 和动物的结核病的致病菌包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis)、牛分枝杆菌（M. bovis)、 非洲分枝杆菌（M. africanum)、坎纳分支杆菌（M. canettii)等。结核病是一种严重危害人 和动物健康的人畜共患传染病，全球每年因结核病死亡人数约为200万~300万。根据世 界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一。目前我国结核病年发病 人数约为130万，占全球发病的14. 3%，仅次于印度位居全球第2位。在结核病人中，约有 1%的人通过饮用未经消毒的牛奶等方式感染了牛分支杆菌（牛型菌）；在亚洲、非洲国家 和地区，4. 7%~30. 8%的结核阳性牛感染的是结核分枝杆菌（人型菌），人结核病感染越 为严重的国家，牛感染人型菌的比例也就相应地越高。因此，结核病的防控关系到国家的公 共卫生安全，而控制结核病传播的关键就是早期准确诊断。
[0003] 目前结核病的诊断主要依赖于对病原体的检查，常用方法为涂片染色镜检、分离 培养、免疫学诊断和分子生物学诊断等。其中，分离培养法是目前诊断结核的金标准，但培 养需要4~8周的时间，延误临床诊断与治疗。涂片染色镜检法操作简单，快速，但该法灵 敏度低、特异性差。免疫学诊断则由于现有的抗原或抗体与其它微生物存在交叉，导致其特 异性较差、假阳性率高。分子生物学诊断快速、灵敏，且利用特异性的DNA片段可以区分结 核分枝杆菌复合体内菌种，但是以PCR技术为代表的分子生物学方法对仪器设备和技术人 员要求较高，不能在结核病现场进行快速诊断。虽然恒等温扩增技术（LAMP)可用于现场检 测，但是其反应时间一般在lh，对结果的判定存在人肉眼的误差等问题。因此，亟需建立一 种可应用于现场、简易、快速检测技术。
[0004] RPA技术通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单 链DNA结合蛋白（SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左 右，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高，能 够将痕量级（trace levels)的核酸（尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模 板分子得到大约1〇12扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸 的实地检测。目前，RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和LFD试纸条三种不 同方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。凝胶电泳和荧光扩增曲线 法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的方法。
[0005] RPA-nfo反应的引物与探针的设计没有具体的规则，只能经过RPA反应后应用侧 流层析试纸条（LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针组合。在RPA-nfo正 反向引物的扩增靶序列中设计一条带FAM标记的特异探针，同时反向引物用生物素标记， 生物素标记的RPA产物与FAM标记的特异探针杂交、FAM标记的特异探针与抗FAM抗体的 金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测 线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线，即检测条带。不 被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线，BP 对照条带。当RPA技术与侧流层析技术结合后，即RPA-LFD技术，可以通过侧流层析试纸条 (LFD)读取结果，本方法既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅仅使用侧流层 析试纸就可以通过肉眼观察结果。因此，RPA-LFD技术在结核病的现场诊断方面具有广阔 的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异、灵敏、简易、快速的现场检测结核分枝杆菌复合群 (结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分支杆菌）的RPA-LFD引物与探针以及含 有该引物与探针的试剂盒。
[0007] 为实现本发明目的，采用如下技术方案：
[0008] 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物对和探针组合，其正向引物序 列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探针序列如SEQIDNo. 3所示。
[0009] 优选的是，所述的核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆 菌、坎纳分支杆菌。
[0010] 优选的是，所述正向引物序列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所 示，探针序列如SEQIDNo. 3所示：
[0011] SEQIDNo. 1 ：
[0012] 5,-GGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCG-3'
[0013] SEQIDNo. 2 ：
[0014] 5,-(Biotin)-GAGTCTTGCCCCCCACCCAACCATCCCTGCCAT-3，
[0015] SEQIDNo. 3 ：
[0016] 5' FAM-CCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCG (dSpacer) CGCTTCGATGGATTC-C3-Spacer3'
[0017] 本发明还提供了一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的的试剂盒，该试剂 盒包含上述的引物对和探针组合。
[0018] 本发明还提供了一种现场快速检测结核分枝杆菌复合群的方法，包括如下步骤：
[0019] (1)检测样本DNA的提取或检测样本裂解处理；
[0020] (2)以步骤⑴中处理的样本为模板，进行RPA扩增；
[0021] (3)用侧流层析试纸条检测上述RPA扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含 有结核分枝杆菌复合群。
[0022] 优选的是，所述RPA扩增体系为：RPA反应体系为50yL :其中包括10μΜ的上游引 物 2. 1 μ L，10 μ M 的下游引物 2. 1 μ L，10 μ M 的探针 0· 6 μ L，rehydration 缓冲液 29. 5 μ L， 待测样本DNA或粗裂解产物和ddH20 13. 2 μ L ;扩增程序为：恒温水浴锅38摄氏度反应25 分钟。
[0023] 优选的是，步骤（3)的具体步骤为：取2 μ L RPA扩增产物与98 μ L的LFD检测缓 冲液混合，将LFD置入观察结果，在5分钟内，若同时出现检测条带和对照条带，则该样本结 核分枝杆菌复合群感染阳性，仅出现对照条带则说明该样本中不含结核分枝杆菌复合群细 菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
[0024] 本发明还提供含有上述引物与探针组合的用于检测结核分枝杆菌复合群的试剂 盒。该试剂盒中还包括大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋 白（SSB)、rehydration缓冲液、280nM醋酸镁（MgAc)溶液、侧流层析试纸条（特异性检测 生物素与FAM标记基因扩增产物）、PBST试纸条检测缓冲液（I X PBS+0. 1 %吐温20)、灭菌 去离子双蒸水（ddH20)，TE缓冲液、10% (w/v)SDS、2% (w/v)蛋白酶K、牛分支杆菌基因组 DNA标准阳性模板的一种或多种。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒灵敏性高、特异性强。最低可 以检测8. OX 10°cfu的结核分枝杆菌复合群，与副结核分支杆菌、大肠杆菌0157、金黄色葡 萄球菌、肺炎链球菌等细菌均无交叉反应。
[0027] (2)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒不仅可用于结核分枝杆菌复 合群菌株检测，还可用于临床样本的检测。临床样本主要包括组织样本、痰液、血液、气溶