用于减弱结核分枝杆菌复合群的细菌以生产结核病疫苗的方法
【专利摘要】本发明涉及结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌株在生产用于预防宿主中结核分枝杆菌复合群的细菌感染的疫苗的用途，在结核分枝杆菌复合群的分支杆菌株中插入有能够表达耻垢分枝杆菌孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核细胞优选巨噬细胞，其中如此转化的所述分枝杆菌株在所述真核细胞中显示出降低的生长。NCTC 120426012012.04.26
【专利说明】用于减弱结核分枝杆菌复合群的细菌以生产结核病疫苗的 方法
【背景技术】
[0001] 结核病是一种影响人类和动物的传染性疾病，由于该物种之一的结核分枝 杆菌（Mycobacterium tuberculosis)复合群（complexe)，即特别是结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis)(以及由其衍生 的 BCG 株）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum)、卡氏分枝杆菌（Mycobacterium canettii)、山羊分枝杆菌（Mycobacterium caprae)、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti)和海豹分枝杆菌（Mycobacterium pinnipedii)[19]以及 Mycobacterium mungii (20)。结核病每年在世界各地引起约900万新发感染病例，并且每年杀死约300万 人。HIV感染流行与发达国家结核病的重新出现同时出现，并且令人担忧的是伴有耐受一线 抗结核病抗生素的结核分枝杆菌菌株的出现。结核病是一种传染性疾病，可以传染自患有 杆状肺结核的人，即在吐出物中排出结核分枝杆菌复合群的活分枝杆菌的人。
[0002] 在很长一段时间，预防肺结核是基于接种卡介苗（BCG)，这是一种牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)的减毒株，一种和结核分枝杆菌非常密切相关的分枝杆菌属，并且 也在人类与动物中引起结核病，主要是牛结核病。然而，BCG疫苗的功效变化很大，这取决于 临床情况以及在其中已经测量这种功效的国家。这种功效在〇%的保护直至60%的保护之 间不等。BCG疫苗对肺结核的这种不良保护已导致一些国家的卫生机构放弃这种接种。自 2007年7月以来，法国就是如此，因为除了一些更特殊群体（如医疗保健提供者）外，BCG 接种在法国不再是强制性的。
[0003] -些实验研究用结核分枝杆菌基因组的不同遗传工程方法，努力提高BCG疫苗 的保护性，但到现在为止，这些构建体中未能允许开发出BCG的替代疫苗用于保护免受结 核病以及特别是肺结核。一个第一个策略是，开发产生并分泌细胞因子的BCG变体[1]。 第二个策略是，着手构建表达结核分枝杆菌30千道尔顿的抗原蛋白的重组BCG;这种构 建体在动物模型中显示出保护作用。最后几项研究对BCG株的基因组进行工程化，使其 分泌细菌单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素 (listeriolysin)以刺激参与结核病保护的⑶8和⑶4淋巴细胞[2]。最后一个策略转向 通过使强毒基因（如phoP基因和mce基因）失活产生结核分枝杆菌的减毒株[3、4]。在动 物模型中，这些构建体显示出比BCG更强的抗结核分枝杆菌感染的保护[3、4]。
[0004] 如已知的，这种负责感染人类或动物的分枝杆菌属的减毒株能够被用于生产疫 苗，特别是通过将所述减弱的细菌插入所述疫苗。
[0005] 如已知的，尤其当在真核细胞中进行体内培养时，用作疫苗的分枝杆菌的株尤其 是H37Rv株，具有不超过30天的存活时间。在实践中，生长的降低伴随着所述细菌在所述 细胞中寿命的减少，尤其是在体内。
[0006] 在耻垢分枝杆菌（M. smegmatis)的膜提取物中，MspA孔蛋白作为一种20kDa亚基 组成的寡聚蛋白而被发现[5]。它被认为是耻垢分枝杆菌中主要和最丰富的孔蛋白[5、6]。 抑制编码MspA的mspA基因降低耻垢分枝杆菌外膜对葡萄糖[7]、对磷酸盐[8]、对金属离 子和对氨基酸[9]的渗透性，表示此孔蛋白是耻垢分枝杆菌中对不同基质的主要通用扩散 通路，也允许从分枝杆菌外的介质中流入营养物[8、9]。也在其它快速生长的分枝杆菌中检 测到编码MspA孔蛋白的基因，比如龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae) [10]以及草分 枝杆菌（Mycobacterium phlei) [11]。已经显示在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中表达MspA 孔蛋白增加了它们对抗生素敏感性[12]。类似地，耻垢分枝杆菌的MspA孔蛋白增加牛分枝 杆此6菌株在无菌（ &161119116)介质中的生长[14]。在这些先前的研究中[12、14]，作者通 过在无菌Middlebrook 7H10琼脂介质中的生长，确定了抗生素对于对照株结核分枝杆菌 H37Rv和表达MspA的株的最小抑制浓度。
[0007] 最后，已经显示耻垢分枝杆菌中缺失mspA基因增加耻垢分枝杆菌在小鼠巨噬细 胞中的存活（13)。
[0008] 因此，遵循如下文献：
[0009] 1-不同的生物工程技术已被用来产生突变或缺失来构建结核分枝杆菌复合群的 细菌的减毒株。通过使强毒基因（如phoP基因和mce基因）失活而产生结核分枝杆菌的 减毒株的策略[3、4]，在小鼠和豚鼠动物模型中表现出比BCG对结核分枝杆菌感染更强的 保护[3、4]。然而，出于用作疫苗或生产疫苗的目的，这些生物工程技术没有有效地用于添 加从结核分枝杆菌复合群的细菌基因组中缺失的基因。
[0010] 2-没有现有技术的研究表明mspA基因的表达能减弱结核分枝杆菌复合群的细菌 在真核细胞模型和动物模型中的生长，以及更强的原因在于它可以用作疫苗或生产疫苗。
[0011] 本发明的目的是提供结核分枝杆菌复合群的新型株，其具有降低的生长速率，但 同时保持了其免疫原性。
[0012] 疫苗领域中的技术人员不断寻求多样化的疫苗生产模式，以提高所述疫苗的功效 和减少副作用，并且还扩展了可受益于接种的哺乳动物谱，特别是家畜如牛。
【发明内容】
[0013] 与需要失活或消除基因以失活分枝杆菌以便可用于疫苗目的的那些策略不同，根 据本发明，发明人惊奇地发现，利用分子工程方法通过基因的增加和表达，有可能减弱结核 分枝杆菌复合群的细菌。
[0014] 为此，通过在所述分枝杆菌中增加和表达编码耻垢分枝杆菌孔蛋白A的mspA基 因，本发明提供了一种用于降低结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌株在真核细胞中生长的方 法，以期使其用作疫苗。
[0015] 在 Georgiana E. Purdy 等人，2009 中（Molecular Microbiology. 73 卷 N。5. 1， 2009年9月，844-857页），作者使用了结核分枝杆菌⑶C 1551株，其比结核分枝杆菌的大 多数其它株更毒[31]并因此不适合用作疫苗，并且报道由于鼠巨噬细胞感染了鼠白血病 病毒（MuLV)即RAW264. 7细胞[28]而表达mspA孔蛋白的所述转化株在所述鼠巨噬细胞中 的活力降低。有效地，已知由于病毒干扰的现象，免疫系统细胞（如巨噬细胞）感染第一病 毒（MuLV)导致感染所述细胞[29]的第二微生物结核分枝杆菌的活力降低。考虑到制备抗 结核病的疫苗，这就是为什么作者没有提及可能使用结核分枝杆菌的所述突变体向宿主赋 予增加的免疫力的优势。
[0016]在Mailaender等人中[12]，与结核分枝杆菌野生型株相比，表达mspA孔蛋白的转 化株在培养基中生长增加的结果，启示本领域技术人员，如此转化的株不允许在宿主真核 细胞中降低所述株的生长。在Mailaender等人，2004中[12]，作者解释道，出于提供具有 抗结核病活性的新型分子而不考虑提供新型疫苗的目的，他们获得的实验数据仅仅符合结 核分枝杆菌株对天然抗生素（源自泛素的肽）更高的敏感性。
[0017] 根据本发明，首先已发现通过使用未感染病毒的巨噬细胞系，更特别地是通过对 健康人类志愿者供体的细胞进行分析，能够获得改进的结核分枝杆菌株的减毒株，其可方 便地用作疫苗的。如下实施例4所报告，通过在动物中的体内实验数据证实了这些结果。这 些结果，显示根据本发明的突变株的无害性，超越了本领域中目前针对BCG所发表的所有 结果[30]，并且为改进抗结核病的疫苗构成了基础。
[0018] 更具体地，本发明提供了结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌株在生产用于预防结核 分枝杆菌复合群的细菌在宿主中感染的疫苗中的用途，在所述结核分枝杆菌复合群的分枝 杆菌株中已插入能够表达耻垢分枝杆菌孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核细胞，优 选巨噬细胞；所述的如此转化的分枝杆菌株在所述真核细胞中显示出降低的生长。
[0019] 更具体地，本发明的主题是根据本发明的结核分枝杆菌的转化株在生产用于预防 哺乳动物或鸟中结核病的疫苗中的用途，所述细胞是巨噬细胞。
[0020] 更具体地，本发明的主题是可用于生产预防人类结核病的疫苗的根据本发明的转 化株的用途。
[0021] 根据本发明，已观察到：
[0022] a_结核分枝杆菌复合群的如此转化的分枝杆菌株，在不含真核细胞的培养基中 (无菌介质）显示出比结核分枝杆菌野生型株更强的生长，其中所述转化的分枝杆菌株允 许在结核分枝杆菌复合群的所述分枝杆菌中表达Msp孔蛋白--在这方面发明人已经证实 了先前文献中发表的结果[12、14];
[0023] b_然而，出人意料的是，正如当使用包含尤其是小鼠巨噬细胞和人类巨噬细胞的 三种不同真核细胞培养基所显示的，相较于原始野生型株的生长，在与真核细胞的共培养 中这种转化株的生长允许结核分枝杆菌突变体的生长降低。这些巨噬细胞尤其参与结核 病、和免疫原性反应以及因此从用作疫苗方面的保护。巨噬细胞是人类和动物细胞，其吞噬 结核分枝杆菌分枝杆菌以试图消灭它们并将分枝杆菌的抗原递呈给免疫系统的其它细胞 [25]。
[0024] 真核细胞共培养中这种细胞内的生长结果完全出乎意料，因为它有悖于发明人所 取得的发现、以及在不含真核细胞的无菌介质中的培养相关的国际文献中所公布的[12、 14]。
[0025] 此外，小鼠中体内分析允许证明，生长中这种降低在体内得以保持，并且减毒株的 免疫原性特性也得以保持，因此这能被赋予用于生产疫苗以及甚至作为哺乳动物和鸟中结 核病疫苗的有利用途。
[0026] 更具体地，所述mspA基因被插入到所述株中，并置于允许在结核分枝杆菌复合群 的所述分枝杆菌中表达所述mspA基因的启动子控制下。
[0027] 更具体而言，含有所述mspA基因的质粒被插入到启动子的控制下，用于在结核分 枝杆菌复合群的所述分枝杆菌中表达所述mspA基因。
[0028] 更进一步地具体而言，所述mspA基因以及控制所述mspA基因在结核分枝杆菌复 合群的所述分枝杆菌中表达的所述元件，被插入到结核分枝杆菌复合群的所述分枝杆菌的 染色体中。
[0029] 本文的"结核分枝杆菌复合群的细菌"是指至少选自如下的细菌物种之一：结核分 枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis)及其克隆、 或BCG亚种、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum)、卡氏分枝杆菌（Mycobacterium canettii)、山羊分枝杆菌（Mycobacterium caprae)、田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti)、海豹分枝杆菌（Mycobacterium pinnipedii)和Mycobacterium mungii。这些物 种均密切相关，目前测序的这些物种它们的基因组具有高于99%的相似性；它们都引起相 同的临床疾病并在感染器官中引起相同的组织损伤，特征在于形成具有巨噬细胞型的巨细 胞的肉芽肿[26]。
[0030] 在本发明一个优选实施方案中，所述结核分枝杆菌复合群的株是物种结核分枝杆 菌的株。
[0031] 更具体地，所述结核分枝杆菌的原始株是H37RV株。
[0032] 更具体地，所述mspA基因包含本说明书所附序列表中的序列SEQIDN°1。
[0033] 更进一步尤其是，所述mspA基因在被称为"hsp60启动子"的表达元件控制下，所 述表达元件由本说明书所附序列表中的SEQ ID N° 4组成。有利地，所述真核细胞是哺乳 动物或鸟的细胞，优选所述细胞是人类细胞。更优选，所述细胞是巨噬细胞。
[0034] 本发明还提供了一种疫苗，其包含结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的转化株，其 中已插入有能够在所述分枝杆菌中表达耻垢分枝杆菌孔蛋白A的所述mspA基因，以允许实 施本发明的方法。
[0035] 更具体地，其是结核分枝杆菌的转化株。
[0036] 更具体地，其是下文中被称为H37RvpVVMspA的株，以编号12042601于2012年4 月26日保藏在NCTC中心（典型培养物国家中心），英国，SP40JG，威尔特郡索尔兹伯里，波 顿镇的健康保护局培养物中心（Health Protection Agency Culture Collections)。此保 藏的提交符合布达佩斯条约。
[0037] 更具体地，根据本发明的"转化株"在每ml的细胞培养物中细菌数目方面，显示出 所述细菌在真核细胞中降低至少90%、甚至至少99%的生长。换言之，每ml细胞培养物中 细菌数目除以至少10,甚至除以至少100。
[0038] 根据本发明转化的分枝杆菌株在真核细胞培养物中尤其是在体内，具有不超过60 天，优选不超过50天的存活期。
[0039] 实践中，生长的降低伴随着所述细菌在所述细胞中寿命的减少，特别是在体内，至 少3至10天。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 阅读如下实施例并参考图1至图3,本发明的其它特征和优点将变得更加明显，其 中：
[0041]-图1是SDS-PAGE凝胶照片，其显示MspA孔蛋白的表达水平。泳道M显示分子量 标记物。泳道1显示耻垢分枝杆菌蛋白提取物的分离，泳道2是结核分枝杆菌H37Rv/pVV16 的蛋白提取物，以及泳道3显示结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA的蛋白提取物的分离，MspA蛋 白20KDa处可见。
[0042]-图2给出了在MspA孔蛋白存在时，在实施例1的7H9无菌介质上结核分枝杆菌 生长增加的曲线，沿Y轴测量的是600nm处的光密度（0D)，从0到1维持18天（X轴上的 "t"）。
[0043]-图3A至3C给出了结核分枝杆菌H37Rv/pVV16和结核分枝杆菌H37Rv/MspA在不 同真核细胞中的细胞内生长曲线：实施例2和3中的多噬棘阿米巴（A.polyphaga)(图3A)、 BMDM (图3B)以及hMdM(图3C)，测量为细胞裂解物的CFU/ml数，从0到1000000 (Y轴），培 养0至14天后（X轴上的"t"）。
[0044]-图4显示，针对以不同浓度（10,000CFU/100iil和10,000CFU/100iil)的野生型 H37Rv株感染的小鼠以及以不同浓度（10,000CFU/100iil和10,000CFU/100iil)的修饰的 H37Rv/pVVMspA株感染的小鼠，以克（g)计的小鼠重量（w)作为时间⑴的函数的趋势，其 中时间为从〇到39天数。
[0045]-图5显示如实施例4所讨论的，接种根据本发明的结核分枝杆菌H37Rv ()的 野生型株和结核分枝杆菌株（□)后，在肝脏中（A)、脾脏（B)和肺（C)中的细菌载量（CFU 数目）。
【具体实施方式】
[0046] 实施例1.表达MspA的结核分枝杆菌在无菌介质中的生长
[0047] 首先，发明人从耻垢分枝杆菌基因组中扩增编码MspA孔蛋白的基因，然后将扩增 产物插入到表达载体PVV16中[16]以获得质粒pVVMspA，表达载体pVV16特征在于存在 编码抗潮霉素和卡那霉素（选择标记物）的蛋白的两个基因。发明人随后通过电穿孔将 pVVMspA质粒并入结核分枝杆菌的株HS7Rv，并使用潮霉素和卡那霉素作为抗生素进行筛 选转化的克隆。
[0048] 实验规程
[0049] 1) pVVMspA 质粒的构建：
[0050] 首先，发明人从耻垢分枝杆菌株mcl55(ATCC 700084)中提取基因组DNA，并使用 标准PCR来扩增编码MspA孔蛋白的基因[5]。
[0051] 所述基因的序列gi_118467340是如下序列SEQ.ID.N° 1 :
[0052] 5，-
[0053] ATGAAGGCAATCAGTCGGGTGCTGATCGCGATGGTTGCAGCCATCGCGGCGCTTTTCACGAGCACAGGC ACCTCTCACGCAGGCCTGGACAACGAGCTGAGCCTCGTTGATGGCCAGGACCGCACCCTCACCGTGCAGCAGTGGGA CACCTTCCTCAATGGTGTGTTCCCCCTGGACCGCAACCGTCTTACCCGTGAGTGGTTCCACTCCGGTCGCGCCAAGT ACATCGTGGCCGGCCCCGGTGCCGACGAGTTCGAGGGCACGCTGGAACTCGGCTACCAGATCGGCTTCCCGTGGTCG CTGGGTGTGGGCATCAACTTCAGCTACACCACCCCGAACATCCTGATCGACGACGGTGACATCACCGCTCCGCCGTT CGGCCTGAACTCGGTCATCACCCCGAACCTGTTCCCCGGTGTGTCGATCTCGGCAGATCTGGGCAACGGCCCCGGCA TCCAGGAAGTCGCAACGTTCTCGGTCGACGTCTCCGGCGCCGAGGGTGGCGTGGCCGTGTCGAACGCCCACGGCACC GTGACCGGTGCGGCCGGCGGTGTGCTGCTGCGTCCGTTCGCCCGCCTGATCGCCTCGACCGGTGACTCGGTCACCAC CTACGGCGAACCCTGGAACATGAACTGA-3'.
[0054] 所用的引物是：
[0055] -MSPA-pVV16F ：5, -cccccccatatgaaggcaatcagtc-3, (SEQ. ID.N。2);以及
[0056] -MSPA-pVV 16ndel :5，-ccccatatgtcagttcatgttccaggg-3, (SEQ. ID.N。3)。
[0057] 确定这些引物用于产生对应整个msp.A基因的PCR产物（636bp)，其中在每侧携带 限制性酶Ndel (此酶的切割位点在上述引物序列中用下划线表示）的切割位点，以允许在 表达载体PVV16中进行克隆；随后是其组成型表达。
[0058]像其它表达载体如pMS3 [15]、pMV261 [16] -样，pVV16载体在分枝杆菌中具有潮 霉素抗性盒和hsp60表达启动子（SEQ. ID. N° 4) [16]。pVV16的特异性在于大肠杆菌的表 达启动子（用于验证克隆时的质粒构建体）和允许双重筛选的卡那霉素抗性盒[16]。
[0059] 接下来，将PCR片段克隆在pVV16质粒的Ndel位点，得到pVVMspA质粒。用最简 单的方法（热休克）将此后者插入至大肠杆菌DH5 a。通过酶促消化和随后测序的PCR扩 增来验证该质粒构建体。
[0060] hsp60 启动子的 SEQ. ID.N。4 序列是：5' -
[0061] AACGCGTCGGCGGCTGCGCGCACCGAGTCCAGCGAGCACAGATCGAGTTGCTGCAGCGTGACGTGGGCG CCTGGGCGGGCGGCCATGATGCGGGCCCGGGCGGCGTTGCCCTTCTCGAGATTGCGGACGGCCAAACCTACGTGTGC ACCGCGGTCGGCAAACACGGCGGCGGTGTGGTAGCCGATGCCGGTGTTGGCGCCGGTGACCACAACGACGCGCCCGC TTTGATCGGGGACGTCTGCGGCCGACCATTTACGGGTCTTGTTGTCGTTGGCGGTCATGGGCCGAACATACTCACCC GGATCGGAGGGCCGAGGACAAGGTCGAACGAGGGGCATGACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATAGGCGAGT GCTAAGAATAACGTTGGCACTCGCGACCGGTGAGTCGTAGGTCGGGACGGTGAGGCCAGGCCCGTCGTCGCAGCGAG TGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCGGGCACTGCGCCCGGCCAGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCGTCACCC GGTGACCCCCGGTTTCATCCCCGATCCGGAGGAATCACTTCGCA-3 /
[0062] 在hsp60启动子控制下的mspA基因表达盒由并置（juxtaposition)的SEQ. 10.犷4和5已〇.10^°1组成。
[0063] 2)电感夸杰结核分枝杆菌的分枝杆菌的制各以及插入dVVMsdA质粒:
[0064] 如Van Kessel和Hatfull先前所述[18]的来制备电感受态（对质粒的插入是可 渗透的）结核分枝杆菌细菌株H37Rv(ATCC 27294)[17]。简言之，结核分枝杆菌分枝杆菌 收获自光学密度（D0_)在0. 8-1. 0之间的结核分枝杆菌H37Rv的液体培养物，在10%甘 油中洗涤三次，在相同的缓冲液重新悬浮。质粒pVV16(对照，以保证生长的变化不是由于 表达载体本身，而确实是由于mspA基因的存在）以及pVVMspA (含有目标MspA孔蛋白的基 因的质粒），利用电穿孔仪（参考Multiporator/Electroporator 2510,法国，Le Pecq)以 1000欧米爺2. 5kV和25uF，通过电穿孔分别插入到分枝杆菌中。经电穿孔的分枝杆菌收集 在lmL富集的液体Middelbrook 7H9介质中（Sigma-Aldrich，法国里昂）于37°C培养12h， 然后涂布在Middelbrook 7H10介质上通过添加卡那霉素加潮霉素进行筛选，于37°C孵育 3至4周。转化的结核分枝杆菌分枝杆菌中mspA基因的转录和翻译，通过PCR、RT-PCR和 SDS-PAGE 验证。
[0065] MspA孔蛋白的特征在于它对热变性的稳定性[5]。在图1中，用结核分枝杆菌 H37Rv/pVV16(泳道2)、结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA (泳道3)和耻垢分枝杆菌（阳性对 照）（泳道1)的蛋白提取物进行SDS-PAGE凝胶电泳。经高温选择性提取制备这些提取物 [27]。图1显示mspA基因在结核分枝杆菌H37Rv和在对照株耻垢分枝杆菌中的表达。从凝 胶切出所检测到的蛋白点，并通过MALDI-T0F质谱进行分析。该蛋白点经鉴定具有和20KDa 的耻垢分枝杆菌的MspA蛋白序列21 %至29%的序列覆盖度以及相似性。
[0066] 3)转化或未转化的结核分枝杆菌株在液体介质中的生长：结核分枝杆菌H37Rv/ PVV16 (不表达MspA孔蛋白的对照转化株）和结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA (表达MspA孔蛋 白的转化株）置于5mL的Middlebrook 7H9介质（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法 国）的预培养物中保持15天，直至达到D0_值为1。然后，在搅拌下剧烈涡旋混合分枝杆菌 以除去细胞簇，收集并稀释于l〇ml的新鲜7H9介质中。用BACTEC MGIT 960系统（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法国）通过D0_测量在三个独立的培养中确定两菌株的增 长速率。这种全自动的系统是基于对需氧菌氧气消耗的检测。
[0067] 4)结果
[0068] 为了研究MspA蛋白对结核分枝杆菌生长的影响，本发明人用株结核分枝杆菌/ PVV16和结核分枝杆菌/pVVMspA在液体7H9无菌介质中以三个独立的培养进行体外生长实 验。本发明人采用细胞悬浮液，并在BACTEC MGIT960系统中测量为期17天的细菌生长。 对照株结核分枝杆菌/pVVl和结核分枝杆菌/pVVMspA株的生成时间分别是19小时10分 ±10分以及17小时16分±12分（图2)。因此，本发明人确定表达MspA孔蛋白的株比对 照株显示更快的生长（P < 0. 05)。进行了三次的此实验显示MspA孔蛋白的表达增加了结 核分枝杆菌的生长速率。
[0069] 实施例2.表达MspA的结核分枝杆菌和变形虫多噬棘阿米巴的共培养的生长
[0070] 1)实验规程：
[0071] 10mL变形虫悬液（?105变形虫/mL)接种?10 6分枝杆菌/ml (M0I = 10)。作 为对照，多噬棘阿米巴和分枝杆菌分别培养在PAS缓冲液（Page氏改性的Neff氏变形虫盐 水）中（21、22、23)。在32°C孵育24h的时间后，用PAS洗涤三次共培养物，在32°C在10ml PAS中孵育10至15分钟。
[0072] 2)结果：
[0073] 使用变形虫作为真核细胞，共培养8天后观察到两株结核分枝杆菌H37Rv/pVV16 和结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA在实验中存活，但是表达MspA孔蛋白的结核分枝杆菌 H37Rv/pVVMspA分枝杆菌的数目显著降低（P彡0. 05 ;Student氏统计检验）。在第12天，对 于结核分枝杆菌H37Rv/pVV16的菌落数目为2X 105±6X 104,相对于结核分枝杆菌H37Rv/ pVVMspA 的菌落数目为 8X103±5X103(图 3A)。
[0074] 图3A给出了结核分枝杆菌H37Rv/pVV16和结核分枝杆菌H37Rv/MspA在真核细胞 多噬棘阿米巴培养物中的细胞内生长曲线。
[0075] 这些数据表明，相较于结核分枝杆菌H37Rv/pVV16株，结核分枝杆菌H37Rv/ pVVMspA细胞内生长约两个对数的降低，S卩每ml培养物中细菌数目约99 %的降低。
[0076] 实施例3.表达MspA的结核分枝杆菌和人类巨噬细胞（hMdM)或小鼠巨噬细胞 (BMDM)共培养的生长：
[0077] 1)实验规程：
[0078]使用 Ficoll 梯度（MSL, Eurobio, Courtaboeuf 法国）从白细胞层（leukopack)(法 国，马赛，国家血液服务机构（EtablissementFran^ais du Sang))分离 BMDM[24]和 hMdM, 然后使其分化，并分别（1〇5细胞/孔）接种在24孔培养板在含有10% FCS的RPMI 1640 介质中。分别用结核分枝杆菌、结核分枝杆菌H37Rv/pVV16和结核分枝杆菌H37Rv/pWMspA 感染BMDM和hMdM达24小时，然后洗涤巨噬细胞来除去游离的分枝杆菌，之后在含有10% 胎牛血清（FCS)的RPMI1640介质中孵育不同时间段。作为对照，分别培养每种细胞类型和 分枝杆菌。
[0079] 确定定细朐内分枝杆菌的数目（CFU)：
[0080] 在给定的时间，用0. 1 %十二烷基硫酸钠（SDS)裂解被感染的细胞30min，然后穿 过26号规格的针以保证完全裂解。用PBS将裂解物（500 ii L)洗涤三次，涂布在固体7H10 介质上（Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法国）并在37°C孵育15天以确定细胞内 分枝杆菌的菌落数（CFU)。所有的实验均以一式三份进行。
[0081] 2)结果：
[0082] 通过使用BMDM巨噬细胞作为真核细胞，本发明人观察到两株结核分枝杆菌 H37Rv/pVV16和结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA在整个实验时间（14天）均得以存活。本 发明人观察到第4和第14天之间，对照株H37Rv/pVV16显示出比表达MspA的株显著更 强的生长（P < 0. 05)(图3B)。在第14天，对于结核分枝杆菌H37Rv/pVV16的菌落数为 IX 106±7X 105,相对于结核分枝杆菌 H37Rv/pVVMspA 的菌落数 4X 105±1105(P 彡 0. 05)。
[0083] 转化的或未转化的结核分枝杆菌与人类巨噬细朐的共培养
[0084] 使用hMdM巨噬细胞作为真核细胞，本发明人观察到在第4天及其以后直到 实验结束时，对照株结核分枝杆菌H37Rv/pVV16比表达MspA的株显示出显著更强的 生长（P < 0.05)(图3C)。在第14天，对于结核分枝杆菌H37Rv/pVV16的菌落数为 2X 104±2X 103,相对于结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA的菌落数为5X 103±7102。
[0085] 总之，这些结果表明，与对照株相比，在结核分枝杆菌中MspA孔蛋白的表达导致 细菌在3种测试类型的真核细胞中难以增殖。
[0086] 图3B和3C给出结核分枝杆菌H37Rv/pVV16和结核分枝杆菌H37Rv/MspA在不同 巨噬细胞培养物中的细胞内生长曲线：BMDM(图3B)和hMdM(图3C)。
[0087] 这些数据表明，相较于结核分枝杆菌H37Rv/pVV16株，结核分枝杆菌H37Rv/ pVVMspA的细胞内生长约一个对数的降低，S卩每ml培养物的细菌数目约90%的降低。
[0088]实施例4.表达MspA的结核分枝杆菌在动物模型中的生长和对结核病的保护
[0089] 1)实验规程：
[0090] 在得到当地动物实验伦理委员会办公室批准后3天，在NSB实验室进行在动物中 的研究。通过腹膜内途径用100 y L细菌培养物感染6至8周龄的Balb/c小鼠（每组10 只）。采用上述各株（野生型H37RvATCC 27294株和突变的结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA 株）的Tw不同的接种物：1 X 107CFU/mL和1 X 105CFU/mL。作为对照，一组小鼠被感染有 100 U L的无菌PBS。持续一个月监测小鼠的重量、表现和存活。
[0091] 根据其它研究者发表的规程进行感染小鼠的检查[3]。此外，在第一阶段处死一些 存活的小鼠，通过病理解剖分析脾、肝和肺，并确定每培养物、每组织的细菌载量，并以CFU 表示。在第二阶段，两组中存活的小鼠重新接种10 7CFU/mL的结核分枝杆菌h37Rv，并进行 相同的观察规程。
[0092] 2)结果：
[0093]目前的数据显示，相较于感染结核分枝杆菌野生型株的小鼠，感染有本发明的改 变株的小鼠存在更少的行为问题，并具有更快的增重（图4和图5)。
[0094] 根据其它研究者发表的规程进行感染小鼠的检查[3]。感染后10周，接种有突 变结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA株的所有小鼠活了下来，然而接种野生型株的那些表现出 50%的死亡率。这种存活与结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA在肺中非常低的菌落形成单位 (CFU)数目相关。接种有突变结核分枝杆菌H37Rv/pVVMspA株的小鼠发展出较少的组织损 伤，包括小肉芽肿。一只接种有野生型结核分枝杆菌H37Rv株的小鼠表现出腹部瘘。宏观分 析表明，接种有野生型结核分枝杆菌H37Rv株的小鼠中脾的重量显著大于接种有突变株的 小鼠。此外，肝脏中肉芽肿的数目分别为24±21相对于0 ;以及脾中61±27相对于8±7， 这些差异是显著的（P〈〇.05)。在脾中，相较于野生型结核分枝杆菌H37Rv株，对于突变结核 分枝杆菌H37Rv/pVVMspA株而言，分枝杆菌的计数显示出CFU数目的显著降低。细胞分析 中测试的免疫原性被保留下来。
[0095] 第一次接种后90天，本发明人用野生型结核分枝杆菌H37RV株以每ml 107CFU的 接种物再次接种两组小鼠。再次监测小鼠90天；除了在初次接种时接种有野生型株的每4 只小鼠中的1只以外，所有小鼠均存活。
[0096]此外，正如在接种第38天及其后所观察到的，相较于最初接种有野生型株的小 鼠，最初接种有根据本发明疫苗株的小鼠的组中增重显著更高（P〈〇. 05) (p = Student统计 检验，表示当声称两个系列的两个平均值不相等时错误的概率的（此处〈5% ))。
[0097] 第二次接种后90天使小鼠安乐死；组织的组织病理学分析显示，相较于最初接种 有本发明疫苗株的小鼠（21±25结节），最初接种有野生型结核的组中显著更高的肺肉芽 肿的结节数（33±37结节）（P〈0. 05)。
[0098] 最后，相较于最初接种有本发明疫苗株的小鼠的组，最初接种有野生型结核的小 鼠的组中，结核分枝杆菌H37RV的细菌载量（CFU的数目）显著更高（p〈0. 05)(图5)。[0099] 因此，发明人得到三种类型的证据要素：临床证据要素（死亡率）；组织学证据要 素（每个器官肉芽肿数）；以及微生物证据要素（接种后的细菌载量），这允许得到这样的 结论：结核分枝杆菌H37RV/PVVMSPA突变株在这种动物模型中赋予了抗野生型结核的保护 作用。
[0100] 这些结果显示了本发明突变体株的无害性、以及本发明的结核分枝杆菌突变株对 抗结核分枝杆菌感染的保护性，这超越了本领域中目前针对BCG所发表的所有结果[30]， 并且为改进抗结核病的疫苗构成了基础。
[0101] 在Brandt L.等人2002中[30]，接种结核分枝杆菌后6周没有显出对结核病所导 致死亡率的保护作用，尽管在人类当中其感染前景非常重要。此外，在脾和肺中结核分枝杆 菌的细菌载量被非常温和地降低。
[0102] 参考文献
[0103] [l]Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ Jr. Mycobacterium. In:Murray PR, Jo Baron H, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH 编.Manual of clinical microbiology. ASM Press Washington DC, 1999 ；399-437.
[0104] [2]Grode L, Seiler P, Baumann S, Hess J，Brinkmann V，Nasser Eddine A，Mann P, Goosmann C, Bandermann S, Smith D, Bancroft GJ, Reyrat JM, van Soolingen D, Raupach B，Kaufmann SH. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovisbacilleCalmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.J Clin Invest. 2005;115:2472-9.
[0105] [3]Gioffre A, Infante E，Aguilar D，Santangelo MP，Klepp L，Amadio A，Meikle V,Etchechoury I，Romano MI，Cataldi A 等人 Mutation in mce operons attenuates Mycobacterium tuberculosis virulence. Microbes Infect 2005;7:325-334;
[0106] [4]Martin C，Williams A，Hernandez-Pando R，Cardona PJ，Gormley E，Bordat Y，Soto CY，Clark SO, Hatch GJ，Aguilar D 等人 The live Mycobacterium tuberculosis phoP mutant strain is more attenuated than BCG and confers protective immunity against tuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine 2006;24:3408-3419
[0107] [5]Niederweis, M. , Ehrt, S. , Heinz, C. , Klocker,U., Karosi, S. , Swiderek, K. M. , Riley, L. W.和Benz，R. Cloning of the mspA gene encoding a porin from Mycobacterium smegmatis. Mol. Microbiol. 1999；5:933-945.
[0108] [6]0jha A，Hatfull GF. The role of iron in Mycobacterium smegmatis biofilm formation:the exochelinsiderophore is essential in limiting iron conditions for biofilm formation but not for planktonic growth. MolMicrobiol. 2007；66:468-83.
[0109] [7] Stahl, C. Kubetzko, S. Kaps, I. Seeber, S. Engelhardt, H. Niederweis, M. MspA provides the main hydrophilic pathway through the cell wall of Mycobacterium smegmatis. MolMicrobiol. 2001 ；40；451~64.
[0110] [8]Wolschendorf F,Mahfoud M,Niederweis M. Porins are required for uptake of phosphates by Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 2007；189:2435-42.
[0111] [9] Stephan J, Bender J, Wolschendorf F, Hoffmann C, Roth E, Mailandcr C，Engelhardt H，Niederweis M. The growth rate of Mycobacterium smegmatis depends on sufficient porin-mediated influx of nutrients. MolMicrobiol. 2005；58:714-30.
[0112][10] Trias，J.，Jarlier，V.，和Benz，R. Porins in the cell wall of mycobacteria. Science 1992；258:1479 - 1481
[0113][11] Riess，F. G.，Dorner，U.，Schif f ler，B?，和Benz，R. Study of the properties of a channel-forming protein of the cell wall of the Gram-positive bacterium Mycobacterium phlei. J MembrBiol 2001；182:147 - 157
[0114] [12]Mailaender C，Reiling N，Engelhardt H，Bossmann S，Ehlers S, Niederweis M. The MspA porin promotes growth and increases antibiotic susceptibility of both Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis. Microbiology 2004； 150:853-864
[0115] [ 13] Fabr ino DL，B1 eck CK，Anes E，Hasi 1 ik A，Melo RC，Niederwei s M，Griffiths G, Gutierrez MG. Porins facilitate nitric oxide-mediated killing of mycobacteria. Microbes Infect. 2009；ll:868-75.
[0116] [14]Sharbati-Tehrani S, Meister B，Appel B,Lewin A. The porinMspA from Mycobacterium smegmatis improves growth of Mycobacterium bovis BCG. Int J Med Microbiol. 2004 ;294:235-45.
[0117] [15] Scholz, 0. , Thiel, A. , Hillen, W. &Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. Eur J Biochem 2000； 267, 1565 - 1570.
[0118] [16] Stover CK, De la Cruz VF, Fuerst TR,Burlein JE, Benson LA, Bennett LT，Bansal GP，Young JF，Lee MH，Hatfull GF，Snapper SB，Barletta RG，Jacobs WR，Bloom BR. New use of BCG for recombinant vaccines. Nature 1991:351:456 - 460.
[0119] [17] Cole ST，Brosch R, Parkhi 11 J, Gamier T，Churcher C，Harris D，Gordon SV,Eiglmeier K，Gas S,Barry CE，第三等人:Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998, 393(6685) : 537-544)
[0120] [ 18] Van Kesse 1，J. C?和Hatfu 11，G. F. (2007) Recombineer ing in Mycobacterium tuberculosis. Nat Methods 4:147-152.
[0121] [19]Dye C.等人，Prospects for worldwide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy. Lancet 1998；352:1886-91. 3.
[0122] [20] Alexander KA, Laver PN, Michel AL, Williams M, van Helden PD, Warren RM, Gey van Pittius NC. Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M. mungi. Emerg Infect Dis. 2010；16:1296-9.
[0123] [21]Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. J ClinPathol 1983；36:978986.
[0124] [22] La Scola，B.，Mezi，L.，Weiller，P. J?和Raoult，D. Isolation of Legionella anisa using an amoebic coculture procedure.J ClinMicrobiol2001； 39:365-366.
[0125] [23]Greub,G.和Raoult，D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. ClinMicrobiol Rev 2004;17:413-433).
[0126] [24]Cook, P. , Totemeyer, S. , Stevenson, C. , Fitzgerald, K. A. , Yamamoto, M. , Akira, S.等人?Salmonella-induced SipB-independent cell death requires Toll-like receptor-4signalling via the adapter proteins. Tram and Trif. Immunology 2007；122:222-229).
[0127] [25]Gengenbacher M，Kaufmann SH. Mycobacterium tuberculosis:success through dormancy. FEMS Microbiol Rev. 2012；36:514-32
[0128] [26] Isaza R. Tuberculosis in all taxa. In:Fowler ME，Miller RE，编，Zoo and Wild Animal Medicine?第五版，St. Louis，M0:Elsevier;2003:689_696
[0129] [27]Heinz, C.矛口Niederweis，M. Selective extraction and purification of a mycobacterial outer membrane protein. Anal Biochem 2000 ;285 ;113_120
[0130] [28]HARTLEY J.W?等人，Retrovirology 2008, 5:1
[0131] [29]MicrobiologieMedicale. Jawetz E. Melnick JL,Adelberg EA. Maloine SA 编，1973, 384页
[0132] [30]BrandtL等人，Infect. Immun. 2002 ;70:672-678
[0133] [31]Manca C.等人，J. Immunol. 1999 ;62:6740-6。
【权利要求】
1. 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)复合群的分枝杆菌株在生产用于预 防宿主中结核分枝杆菌复合群的细菌感染的疫苗中的用途，在所述结核分枝杆菌复合群的 分枝杆菌株中插入有能够表达耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A的mspA 基因，所述宿主包含真核细胞，优选巨噬细胞，所述的如此转化的分枝杆菌株在所述真核细 胞中具有降低的生长。
2. 根据权利要求1所述的结核分枝杆菌的转化株在生产用于预防哺乳动物或鸟中结 核病的疫苗中的用途，所述真核细胞是巨噬细胞。
3. 根据权利要求2所述的株在生产用于预防人类中结核病的疫苗中的用途。
4. 根据权利要求1至3中的一项所述的用途，特征在于插入在所述株中的mspA基因 被置于启动子的控制下，从而允许在所述结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌中表达所述mspA 基因。
5. 根据权利要求4所述的用途，特征在于所述基因和所述启动子插入在质粒中。
6. 根据权利要求1至5中的一项所述的用途，特征在于分枝杆菌复合群的所述分枝杆 菌的所述株是物种结核分枝杆菌的株。
7. 根据权利要求6所述的用途，特征在于所述结核分枝杆菌的原始株是H37Rv株。
8. 根据权利要求1至7中的一项所述的用途，特征在于所述mspA基因包含序列SEQ ID N° 1。
9. 根据权利要求4至8中的一项所述的用途，特征在于所述mspA基因在由SEQ ID N° 4组成的hsp60启动子的表达元件的控制下。
10. 根据权利要求1至9中的一项所述的用途，特征在于所述株是经转化的，并且以编 号12042601于2012年4月26日保藏在NCTC中心（UK)。
11. 一种根据权利要求1至10中的一项所述的用途所获得的疫苗，特征在于其包含结 核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的所述转化株，其中插入有能够在所述分枝杆菌中表达耻垢 分枝杆菌MspA孔蛋白的mspA基因。
12. 根据权利要求11所述的疫苗，特征在于所述株是结核分枝杆菌的转化株。
13. 根据权利要求12所述的疫苗，特征在于所述株是以编号12042601于2012年4月 26日保藏在NCTC中心（UK)的株。
【文档编号】C12N1/20GK104271732SQ201380024171
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2012年5月21日
【发明者】M·德朗古, O·拉姆贝特, D·拉乌尔 申请人:地中海传染基金会