一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于定位探针介导剪切的核酸等 温扩增方法。
【背景技术】
[0002] 核酸体外扩增技术是目前临床化学中发展最为迅速的技术领域之一。对核酸的扩 增检测无论在操作上还是时效上均比其他检测技术更为实用，因此颇受研宄者和仪器开发 商的青睐。聚合酶链式反应（PCR)作为核酸扩增的革命性技术经过三十多年的发展已牢牢 占据领导地位，并涌现多种衍生技术如逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR(Real-time PCR)、多 重PCR(Multiplex PCR)、巢式PCR(Nested PCR)等。然而，这些技术严重依赖于温度循环来 实现核酸链的变性、退火和延伸三步骤，均属于变温核酸扩增技术。
[0003] 近年来，等温核酸扩增技术已悄然兴起，并得以迅猛发展，不仅丰富了核酸扩增 技术的内容，还代表着核酸扩增技术发展的新趋势。目前，等温核酸扩增技术有基于核酸 序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、RNA 的信号介 导扩增技术（Signal mediated amplification of RNA technology，SMART)、链置换扩 增技术（Strand displacement amplification，SDA)、滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA)、环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA)、解旋 酶依赖型扩增技术（Helicase-dependent amplification，HDA)和基因组指数扩增反应 (Genome exponential amplification reaction，GEAR)等。这些等温扩增技术能在较短 的时间内实现目标核酸序列的指数扩增，且无需特定的温度循环，比变温扩增技术具备更 强的现场和床旁检测应用潜能。
[0004] 然而，尽管这些技术均有其十分独特的优势，但同时也存在各自的局限。为了实现 目标核酸序列以及新生成的反义序列的循环利用，常常需要复杂的引物设计，例如LAMP需 要针对目标核酸序列的6个区域设计至少4条引物，这不仅要依赖于专业的设计软件，还要 求设计者具有丰富的经验。SDA等虽然具有相对简单的反应机理，但由于内切酶对于目标核 酸中特定识别序列的依赖，其通用性受到了很大挑战。为了在目标核酸中引入内切酶的识 别序列，也不得不诉诸于复杂的引物设计，这不仅大大增加了非特异性扩增的严重程度，同 时加大了扩增失败的风险。另一方面，这些技术几乎都是从引物的延伸来启动扩增反应的， 即首先由引物（含特定碱基序列的寡核苷酸链）来识别目标核酸序列，并在聚合酶作用下 沿目标核酸序列延伸，紧接着该延伸产物从目标核酸序列脱离以实现循环扩增。采用这种 方式来启动扩增反应的主要缺点在于缺乏有效的手段来抑制非特异性扩增反应，这是目前 绝大多数等温指数扩增方法尚未解决的难题。因此，亟需进一步发展更加简单、通用、高灵 敏、高特异性的核酸等温指数扩增方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法，该方法不仅能够 克服内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖，解决目标核酸序列任意剪切继而引发 扩增反应的难题，还能降低引物设计的难度，同时提高方法的通用性、灵敏度与特异性。
[0006] -种核酸等温扩增方法，包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应，酶切目标核酸序 列所采用的试剂包括上、下游的定位探针和内切酶，所述定位探针包括一段双链以及至少 一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双 链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。
[0007] 上述方法中内切酶与所述的定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链的识别 区与目标核酸序列进行杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序 列的精确剪切。
[0008] 上述核酸等温扩增方法是在现有链置换扩增技术（Strand displacement amplification，SDA)的基础上做的重要改进，该方法的整个反应体系中，主要包括以下组 分：目标核酸序列，具有链置换活性的核苷酸聚合酶（简称聚合酶），上、下游引物，上、下游 定位探针，内切酶，反应缓冲液，dNTPs和镁离子；其中，上、下游引物至少包含3'端的保护 结构（即：终止剂或垂悬序列），可与目标核酸序列特异性杂交的目标核酸识别序列，可供 内切酶结合的内切酶识别序列。
[0009] 该方法的具体反应原理，如下：
[0010] a)反应体系中，上游定位探针与目标核酸序列的上游序列（位于目标核酸序列的 3'端）特异性结合后，内切酶与上游定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸上游序列 的特定位点进行剪切；
[0011] b)被剪切后的目标核酸序列与上游定位探针分离，转而与上游引物结合，并在聚 合酶的作用下，以上游引物为模板，沿上游引物的5'端进行延伸，延伸的核酸序列与上游引 物序列形成双链的内切酶识别区域；
[0012] c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对上游引物上的内切酶 剪切位点进行剪切，形成切口；接着，聚合酶以该切口为起始点，以目标核酸序列为模板， 沿目标核酸序列的5'端进行延伸，不仅置换掉原有的部分引物序列，而且延伸获得目标核 酸序列的反义序列（该反义序列仅包含目标核酸序列5'末端到内切酶剪切位点之间的互 补序列）；然后，内切酶再次剪切上述上游引物的内切酶剪切位点，形成切口，在聚合酶的 作用下进行引物延伸、置换掉所述的反义序列，形成新的反义序列，通过上述过程的不断重 复，反应体系中，形成了大量的目标核酸序列的反义序列；
[0013] d)再以上述反义序列为目标核酸序列，下游定位探针会与反义序列（位于反义序 列的3'端）特异性结合，然后，内切酶与下游定位探针的双链结合区结合，并对反义序列的 特定位点进行剪切；
[0014] e)被剪切后的反义序列与下游定位探针分离，转而与下游引物结合，并在聚合酶 的作用下，以下游引物为模板，沿下游引物的5'端进行延伸，延伸的核酸序列与下游引物序 列形成双链的内切酶识别序列；
[0015] f)内切酶与e)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对下游引物上的内切酶 剪切位点进行剪切，形成切口；接着，聚合酶以该切口为起始点，以反义序列为模板，沿反义 序列的5'端进行延伸，不仅置换掉原有的部分引物序列，而且延伸获得目标核酸序列的同 义序列（该同义序列仅包含目标核酸序列5'端和3'端剪切后剩余的序列）；然后，内切酶 再次剪切上述下游引物的内切酶剪切位点，形成切口，在聚合酶的作用下进行引物延伸、置 换掉所述的同义序列，形成新的同义序列，通过上述过程的不断重复，反应体系中，形成了 大量的目标核酸序列的同义序列；
[0016] g)通过上述过程，可以获得大量的目标核酸序列的待扩增部分序列（即f)中的同 义序列），然后，再通过上、下游引物进行指数扩增，即：上述同义序列与上游引物结合，并 以上游引物为模板进行延伸，形成双链内切酶识别序列；上游引物被剪切后，以该同义序列 为模板进行延伸，获得该同义序列的反义序列，不断重复此过程可以生成越来越多的该反 义序列。同理，该反义序列与下游引物又可以继续生成上述的同义序列，最终实现从目标核 酸序列中待扩增部分序列的指数扩增。
[0017] 核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还 可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别 区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切 酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数（单链区按核苷 酸数计）根据内切酶的类型来确定。
[0018] 本发明所述的"靠近"是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切 目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位 点间的核苷酸数量来确定。
[0019] 作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的 同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
[0020] 更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于 双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
[0021] 进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0,小于等于50。
[0022] 理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪 切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：
[0023] 所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分 互补杂交形成。
[0024] 若以两条核苷酸链形式存在，该核