酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补 序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补区域中至少包含一段与目标核酸 序列互补的识别区，当然，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数（单链区按核苷酸 数计）根据内切酶的类型来定。说明书附图IB中提供的即为两条核苷酸链形式的核酸定 位探针中的一种具体形式，图中3'侧臂和5'侧臂位于双链的同侧，且均含有一段识别区， 该结构的核酸定位探针有助于提高核酸定位探针与目标核酸序列结合的稳定性，提高剪切 效率。为了提高核酸定位探针的稳定性，双链中非内切酶识别序列的长度可依据所需退火 温度进行调整；增加两单链识别区的序列长度也可以促进核酸定位探针双链结合区的形成 与稳定。
[0025] 若以单条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针中应有两段互补的序列，并杂交形 成带单链环的茎环结构，上述茎环结构能够提高核酸定位探针的稳定性。上述单链环的核 苷酸数多〇, < 50 ;单链环的核苷酸数为0时，是指互补区域的一端通过最末两个核苷酸之 间的磷酸二酯键连接。当然，该核酸定位探针的未互补区域也应具有至少一段与目标核酸 序列互补的识别区。作为优选，上文所述定位探针的3'末端处具有保护结构，例如：3'终止 剂或3'悬垂序列，其中，3'悬垂序列的核苷酸数目为0~5,3'终止剂包括：11^6竹6(1-(11\ 3 ? -propyl phosphate、dideoxyC。
[0026] 作为优选，扩增采用的引物包括依次连接的目标核酸识别序列、连接序列和内切 酶识别序列，引物3'端设有终止序列或垂悬序列。其中，3'悬垂序列的核苷酸数目为0~ 5, 3' 终止剂包括 Inverted_dT、3' -propyl phosphate、dideoxy C。连接序列用于调节剪 切位点。更优选，扩增采用的引物包括依次连接的目标核酸识别序列、连接序列、内切酶识 别序列和稳定序列，引物3'端设有终止序列或垂悬序列。
[0027] 上述定位探针和引物的3'末端均连接有保护结构，其作用在于，既可以防止引物 先沿目标核酸序列延伸而致定位探针不能与目标核酸序列结合，又可以防止定位探针沿目 标核酸序列延伸而致剪切后的目标核酸序列不能离去，二者均使扩增反应不能被启动。另 一方面，终止剂作为3'保护结构还可以防止引物二聚体作用，以降低非特异性扩增。
[0028] 所述的内切酶为切口 内切酶，包括：Nt. BstNBI、Nb. BsrDI、Nb. BtsI、N. Alwl、 Nt. BsmAI、Nt. BspQI。
[0029] 所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。
[0030] 所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的核苷酸聚合酶，包括Bst DNA聚合酶、 Vent (exo_)聚合酶、Klenow DNA 聚合酶。
[0031] 本发明还提供了一种核酸等温扩增试剂盒，包括：具有链置换活性的核苷酸聚合 酶，上、下游引物，内切酶；此外，还包括定位探针；所述定位探针包括一段双链以及至少一 段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性结合的识别区，所述双链 具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。该试剂盒中还包含扩增所需的基本原料，如 dNTPs、镁离子等。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033] 本发明方法利用含内切酶双链识别序列的上、下游定位探针，含内切酶单链识别 序列的上、下游引物，内切酶和DNA聚合酶在等温条件下对目标核酸序列进行指数式扩增。 该方法具有简单、灵敏度与特异性高、通用性强等优势，彻底克服了内切酶对目标核酸序列 中特定识别序列的依赖，解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题，降低了等温 扩增方法中引物设计的难度，有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围，是对目前核酸分子 检测技术手段的重要改进和补充，可应用于微生物检测、肿瘤标志物鉴定和转基因成分筛 查等方面。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明定位探针的结构示意图（阴影部分为内切酶识别区域）；
[0035] A为茎环结构的核酸定位探针，B为由两条寡核苷酸链杂交形成的非茎环结构的 核酸定位探针；阴影部分为内切酶识别序列区域；圆点代指3'保护结构（以3'终止剂作为 保护结构为例）。
[0036] 图2为本发明引物的结构示意图，圆点代指3'保护结构（以3'终止剂作为保护 结构为例）。
[0037] 图3为本发明方法的反应原理示意图（以茎环结构定位探针和3'终止剂作为保 护结构为例）；
[0038] Pll表示上游定位探针；P21表示下游定位探针；P12表示上游引物；P22表示下性 引物。
[0039] 图4为实施例1中验证扩增产物的琼脂糖凝胶（3% )电泳结果图；
[0040] 其中，阳性道电泳物来自含浓度为IpM目标核酸序列的实验组，阴性道电泳物来 自不含目标核酸序列的空白组。
[0041] 图5为实施例2中验证本发明扩增特异性的实时荧光变化曲线图；
[0042] a为不含目标核酸序列的空白对照组（None) ;b为含与定位探针/引物完全配对 的目标核酸序列（T2)的实验组；c，d，e均为含有一个错配碱基的目标核酸序列（T3，T4，T5) 的实验组，但各自的错配碱基所在位置不同。
[0043] 图6为实施例3中验证本发明扩增灵敏度的实时荧光变化曲线图；
[0044] a为不含目标核酸序列的空白对照组（None) ;b为含KT18M浓度目标核酸序列的实 验组；c为含KT16M浓度目标核酸序列的实验组；d为含KT14M浓度目标核酸序列的实验组； e为含KT12M浓度目标核酸序列的实验组；f为含HTkiM浓度目标核酸序列的实验组。
[0045] 图7为实施例4中利用分子信标探针对扩增产物进行检测的实时荧光变化图；IfM 指含浓度为IfM目标核酸序列的实验组，NTC指不含目标核酸序列的空白组。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图，通过具体实施例具体说明本发明。本领域的技术人员应当理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0047] 本发明的反应体系主要包括目标核酸序列，上、下游定位探针（如图1)，上、下游 引物（如图2)，内切酶和具链置换活性的DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTPs和镁离子；其反应 原理如图3所示；具体的扩增反应过程如下：
[0048] a)上游定位探针Pll与目标核酸序列的上游序列（位于目标核酸序列的3'端） 特异性结合后，内切酶与上游定位探针的双链结合区结合，并对目标核酸上游序列的特定 位点进行剪切；
[0049] b)被剪切后的目标核酸序列与上游定位探针Pll分离，转而与上游引物P12结合， 并在聚合酶的作用下沿上游引物P12延伸，形成双链的内切酶识别序列；
[0050] c)内切酶与b)中形成的双链的内切酶识别序列结合，对上游引物P12进行剪切， 形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延伸 过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列的反义序列T tl;
[0051] d)反义序列Ttl与下游定位探针P21结合，被内切酶剪切；
[0052] e)被剪切后的反义序列与下游定位探针P21分离，转而与下游引物P22结合，并在 聚合酶的作用下沿下游P22引物延伸，形成双链的内切酶识别序列；
[0053] f)内切酶绑与e)中形成的双链的内切酶识别序列结合，对下游引物P22进行剪切 以，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延 伸过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的同义序列T 1;
[0054] g)同义序列T1与上游引物P12结合，在聚合酶的作用下沿上游引物P12延伸，形 成双链的内切酶识别序列；
[0055] h)内切酶与g)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对上游引物P12进行剪 切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延 伸过程不断重复，以生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的反义序列T 2;
[0056] i)反义序列T2与下游引物P22结合，在聚合酶的作用下沿下游引物P22延伸，形 成双链的内切酶识别序列；
[0057] j)内切酶绑与i)中形成的双链的内切酶识别序列结合，并对下游引物P22进行剪 切，形成切口，然后聚合酶从该切口位置开始催化延伸并置换掉原有核酸序列，该剪切-延 伸过程不断重复，生成越来越多的目标核酸序列待扩增部分的同义序列T 1;
[0058] k)步骤g到j不断重复，整个过程进入指数反应阶段。
[0059] 随着扩增反应不断进行，将生成大量的序列T1和序列T2，由于二者为互补序列，可 杂交成双链，因而将使双链特异性荧光染料SYBR Green I的荧光信号逐渐增强，从而实现 对目标核酸序列的扩增检测。此外，也可以用序列特异性荧光探针，如用分子信标探针，进 行信号检测。
[0060] 实施例1
[0061] 在该实施列中，使用人工合成的目标核酸序列来验证该方法的可行性。根据目标 核酸序列的