豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及豆类检疫性植物细菌的检测领域，特别是涉及一种用于豆类检疫性植 物病原细菌的高通量检测方法，及该检测方法所采用的锁式探针。
【背景技术】
[0002] 菜豆晕疫病菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 简称 PSPHA)，主要危害 豆类经济作物，引起菜豆细菌性晕疫病害，造成严重的经济损失。尽管很多国家对菜豆晕疫 病采取防御措施，但其传播速度惊人，在世界各大洲的60多个国家均有分布。该菌在我国 属于分布未广的危险性生物，仅在黑龙江发现过这种病害，目前该病菌被列为我国进境检 疫性有害生物。该病菌主要通过种子携带方式进行传播，一般可在种子内存活2年以上，一 旦入侵我国，将严重危害我国豆类生产，造成重大的经济损失。
[0003] 豌豆细菌性疫病菌（Pseudomonas syringae pv. pisi简称PSPI)为豆科作物上重 要的植物病原细菌，其主要寄主有豌豆、菜豆、扁豆、香豌豆、野菜豆。该病主要在欧洲、美 洲、亚洲、大洋洲均有发生，在我国还未见报道。豌豆细菌性疫病的症状主要表现在地上部 分组织受害为坏死斑，茎杆和托叶表现较为明显，危害严重时可引发系统病害，使整株萎蔫 枯死，早期侵染可造成严重损失，对产量影响大。目前该病菌被列为我国进境检疫性有害生 物，是进出境植物源性产品的必检项目。
[0004] 目前针对以上两种豆类检疫性植物细菌仍无有效的化学药剂防治，控制这两种病 害发生最有效的办法是使用不携带病菌种子。近年来，随着我国大豆进口数量增加，进出 口检疫是防控豆类植物细菌病害传入我国的关键。目前，豆类检疫性植物细菌的检测方法 主要有分离培养、生理生化反应、血清学等传统技术，然而，这些检测方法灵敏度低，特异性 不高，耗时长。近年来基于DNA的PCR技术是比较常用的检测方法，如nest-PCR、实时荧光 PCR等，具有较高的特异性和灵敏度，但是未见同时检测两种或多种豆类病原菌的检测方法 报道，无法满足快速、灵敏的口岸检验检疫要求。
[0005] 锁式探针也称环式寡核苷酸探针，自被发现以来，以灵敏度高，特异性强等特点被 广泛应用到病毒、细菌、真菌的检测中。这种探针主要包括三个部分：第一部分为，分别位 于5'端和3'端的检测臂区，用于与靶标序列互补，在连接酶的作用下连接成环；第二部 分为通用引物结合区，用于对连接成环的锁式探针进行滚环扩增，不同检测臂的锁式探针 可以采用相同的引物结合序列，因此称为通用引物结合区，可以实现一条引物或一对引物 等效扩增多条环化的锁式探针实现多重检测；第三部分为与检测无关的Zip区，该部分序 列并非必须的，但是，不同的锁式探针可以采用不同的Zip区序列，从而实现多条锁式探针 的统一识别，是每条探针独特的识别序列，当然，如果仅有一条锁式探针，并且长度各方面 都满足检测的话，Zip区也可以省略不要。滚环扩增技术是借鉴自然界中环状原核生物体 DNA分子滚环式复制方式建立的一种核酸扩增技术，在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作 用下由一条引物即可实现环状DNA体外扩增，这种方法称为线性扩增。在此基础上增加一 条与DNA模板序列一致的引物，可实现指数扩增也称为超分支滚环扩增（hyper-branched rolling circle amplification，HRCA)。HRCA具有特异性强、灵敏度高、适用于多革E标检 测等特点，常应用于单核苷酸多态性（SNPs)、动植物病毒、植物真菌和细菌等检测。目前尚 没有针对PSPHA和PSPI检测的锁式探针或相关检测方法。
[0006] 液相芯片检测技术是近年来发展的一种快速高通量检测技术，是对生物芯片技术 的继承和发展。该技术可提供100种不同荧光编码微球作为探针的载体同时检测多种不同 目标核酸或蛋白，较传统的固相芯片优势在于检测准确、信息质量稳定、可重复性好，而且 具有操作简便、高通量、高灵敏等特点，可大大缩短检测时间。
【发明内容】
[0007] 本申请的目的是提供一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，以及 该检测方法中所采用的锁式探针。
[0008] 为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
[0009] 本申请公开了一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，包括（1)锁 式探针环化和扩增，将受检样品的DNA或菌悬液与锁式探针一起进行环化连接反应，用通 用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；锁式探针包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的 第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，第一锁式探针为Seq ID No. 1所 示序列，第二锁式探针为Seq ID No. 2所示序列；通用引物为能够与连接成环的锁式探针发 生超分支滚环扩增的引物组合，由与锁式探针序列杂交结合的第一引物和与锁式探针的互 补序列杂交结合的第二引物组成，其中第一引物的5'端上具有生物素标记；（2)液相芯片 检测，将滚环扩增的产物与液相芯片的编码微球杂交，杂交完成后用液相悬浮芯片检测仪 进行检测，液相芯片的编码微球上偶联有与滚环扩增产物杂交的捕获探针；捕获探针包括 第一捕获探针和第二捕获探针，两条捕获探针分别偶联到不同的编码微球上，第一捕获探 针用于杂交捕获第一锁式探针，第二捕获探针用于杂交捕获第二锁式探针。
[0010] 需要说明的是，本申请创造性地率先设计了豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌两 种豆类上重要检疫性植物细菌的锁式探针，为这两种病菌的检验检疫提供了一种更为灵敏 有效的检测新途径。本申请中，第一锁式探针为Seq ID No. 1所示序列，第二锁式探针为 Seq ID No. 2所示序列，
[0011] Seq ID No. 1 ：
[0012] 5' -P-TGTTCAAATACGAAGGCGGTCTGCTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGA CATGCAGCGTAGGTATCGACTGCAGCGGTAAGGAAGAAT-3，
[0013] 其中，5'端的"P"为磷酸化标记，从5'端的第一个碱基开始，1-24位的序列为锁式 探针的Tl检测臂区，第25-65位的序列为通用引物结合区，第66-85位为Zip区，第86-103 位为T2检测臂区。
[0014] Seq ID No. 2 ：
[0015] 5' -P-GGTACTCACTTGGTGGGCTTCCGTTTCCCAATAGGTCCAGAATGT CAGCCGTTCCTCACACCA GACGTCACGTATGGTTCGCTGCTCCCACAGCGTGACGGT-3，
[0016] 其中，5'端的"P"为磷酸化标记，从5'端的第一个碱基开始，1-25位的序列为锁式 探针的Tl检测臂区，第26-66位的序列为通用引物结合区，第67-86位为Zip区，第87-102 位为T2检测臂区。
[0017] 需要说明的是，锁式探针的环化和扩增中，在连接环化反应之后，通常还包括提取 或纯化连接成环的锁式探针的步骤，以方便后续用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚 环扩增。提取或纯化连接成环的锁式探针的方法包括至少两种，第一，采用外切酶消化没 有连接成环的线性探针，以及其他DNA片段；第二，采用磁珠将连接成环的锁式探针分离提 纯。可以理解，以上两种获得环化锁式探针的方法都可以用于本申请，在此不做具体限定。
[0018] 还需要说明的是，第一，本申请的捕获探针实际上就是根据锁式探针的Zip区序 列设计的，第一捕获探针的序列与用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针的Zip区序 列或部分序列相同；第二捕获探与用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针的Zip区序列或 部分序列相同；以便于与滚环扩增的产物杂交；可以理解，捕获探针的序列只要全部或部 分与Zip区序列相同，能够实现与滚环扩增产物杂交，将滚环扩增产物