一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明公开了一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其方法，该引物包括Vp1?B1基因分子标记的2条正向引物和1条反向引物，TaPHS1基因分子标记的1条正向引物和1条反向引物，PM19?A1基因分子标记的1条正向引物和1条反向引物，通过两次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳实现的。第一次PCR反应中用三对引物对全部待测材料进行检测，第二次PCR反应中用一对引物对第一次PCR反应中不能很好区分的材料进行检测。综合两次PCR可明确鉴定全部主效休眠等位基因，利用含有多对引物组合的第一次PCR反应可明确鉴定三个主效休眠位点的强休眠等位基因。本发明为小麦品种资源和育种群体后代休眠等位基因的有效鉴定和选择提供一种简单、快速和准确的方法。
【专利说明】
-种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其 方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物分子标记技术领域，具体设及一种通量鉴定小麦种子主效休眠基 因的引物、试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 穗发芽(Pre-harvest sprouting,简称PHS)是指收获前遇到阴雨天气时巧粒在穗 上发芽的现象，是一种世界性的气候农业灾害。穗发芽不仅降低产量而且严重劣化巧粒品 质和种用价值。我国长江中下游、西南冬麦区和东北春麦区是穗发芽危害频繁和严重的地 区，黄淮和北部冬麦区也时有发生，受穗发芽危害的麦区约占全国小麦总面积的83%，对小 麦的优质、高产生产极为不利。选育和推广抗穗发芽小麦品种是解决运一问题的最有效途 径。
[0003] 穗发芽是受遗传基因控制和环境因素影响的复杂数量性状。巧粒休眠特性是影响 小麦穗发芽抗性的主要遗传因素。国内外学者利用不同的遗传分析群体，在2B、2D、3A、3B、 30、44、48、40和70等染色体上定位出了多个控制小麦巧粒休眠的9化位点(数量性状遗传位 点），并建立了与基因位点连锁的分子标记。近年来的研究表明，位于染色体3化、3AS和4AL 的3个QTL位点是控制巧粒休眠的主效基因，与小麦种质资源的穗发芽性状密切相关。染色 体3化上的种子特异性的转录因子化1-B1，在促进种子成熟和维持胚休眠方面发挥重要作 用。目前已报道化1-B1基因位点的突变类型（等位基因）有6个，编号分别为化1-Bla~化1- Blaf。该基因等位变异与小麦种子休眠关系紧密，携有化1-Bla的品种休眠性最差，表现穗 发芽敏感；携有Vpl-Blb和Vpl-Blf的品种休眠性强，表现抗穗发芽。位于染色体3AS上的 化PHS1基因具有促进种子休眠的作用，该基因内含子3区域发生的单碱基突变导致功能缺 失的翻译蛋白，含有该突变等位基因的品种巧粒休眠性降低，表现易穗发芽。目前报道的 化PHS1等位基因有2个，分别控制种子的强、弱休眠特性。位于染色体4AL的PM19-A1基因编 码受脱落酸ΑΒΑ诱导的质膜蛋白19,是种子休眠的正向调控因子，有些品种在该基因启动子 区发生18bp核巧酸片段的缺失，导致种子休眠性降低、易穗发芽;含有该18bp核巧酸片段的 等位基因的品种则休眠性强、抗穗发芽。
[0004] 研究表明，在多季节、多环境条件下，上述主效基因能解释绝大部分的小麦种子休 眠变异和穗发芽表型变异。通过聚合优良抗性基因的分子育种手段提高种子休眠性，培育 抗穗发芽品种，是降低小麦穗发芽危害的最有效途径。目前，能用于穗发芽抗性分子标记辅 助选择的有效标记较少。近年来，有学者针对不同的休眠等位基因设计了与之紧密连锁的 功能分子标记，但对每一种等位基因的检测都需要采用一对不同的标记引物和一次PCR反 应。对于多基因控制性状的分子标记鉴定，运些标记检测方法均存在步骤繁琐，费时费力， 且费用成本高等缺点，特别不适合大规模小麦种质资源和育种分离群体后代的鉴定工作， 很难在科学研究或育种实践中普遍应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种简单、快速、准确地通量鉴定Ξ 个小麦种子主效休眠基因的引物、试剂盒及其检测方法。
[0006] 本发明的目的通过W下技术方案来实现:一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的 引物，所述小麦种子主校休眠基因为化1-B1基因、TaP服1基因和PM19-A1基因；其中，
[0007] 所述化1-B1基因的分子标记引物包括2条正向引物和1条反向引物，正向引物1序 列如沈9 10齡.1所示：5'-4〔4了4了64了66644了〇：6-3'，正向引物2序列如569 10齡.2所示： 5'-TCTGATACCATATATACTTGC-3'，反向引物序列如SEQIDNo.3所示：5'- TCTCACCAGTGTTCTCTA-3'；
[000引所述化P服1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列 如569 10齡.4所示：5'-6644〔464了6〔44圳44464-3'，反向引物序列如569 10齡.5所示： 5'-AGGATGTGAGACCAGTTGAC-3'；
[0009] 所述PM19-A1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序 列如569 10齡.6所示：5'-〔6了6466了66刊641'1'〔6-3'，反向引物序列如沈9 10齡.7所示： 5 '-TGGTGAAGTGGAGTGTAGT-3 '。
[0010] 上述的引物在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。
[0011] -种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，包含如权利要求1所述的引物。
[0012] 一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，它还包括Buffer、MgCl2、dNTP和 Taq 酶。
[0013] 上述试剂盒在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。
[0014] 上述引物通量鉴定小麦种子休眠基因的方法，它包括W下步骤：
[001引 S1.使用化1-B1基因的分子标记正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子标记引 物和PM19-A1基因的分子标记引物形成的引物组合，对小麦DNA进行PCR扩增，并将扩增产物 进行琼脂糖凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，1224bp扩增条带鉴定为化PHS1位点的弱 休眠等位基因，强休眠等位基因没有扩增条带;4846口、6776口、45抓口、6146口的扩增条带分别 鉴定为化1-B1位点的等位基因化1-Bla、化1-B化、化1-Bld和化1-Blf，其中化1-B化和化1- Blf为强休眠等位基因，Vpl-Bla为弱休眠等位基因；195bp和177bp的扩增条带分别鉴定为 PM19-A1位点的强休眠等位基因和弱休眠等位基因；
[0016] S2.使用化1-B1基因的分子标记正向引物2和反向引物进行PCR扩增检测，并将扩 增产物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，有扩增条带的鉴定为等位基化1-Ble，没 有扩增条带的为等位基因化1-Blc。
[0017] 本发明具有W下优点:本发明中设计的引物组合，在第一次PCR反应中可W鉴别Ξ 个主效休眠位点的强休眠等位基因，对于第一次PCR反应不能很好鉴别的等位基因化1-Blc 和化1-Ble，通过第二次PCR反应十分容易区分。所W综合两次PCR结果，可W明确地鉴定Ξ 个主效休眠位点的全部休眠等位基因。实验结果经测序验证，本发明鉴定主效休眠等位基 因结果可靠、重复性好，为小麦品种资源休眠等位基因的有效鉴定和选择提供一种简单、快 速和准确地通量鉴定Ξ个小麦主效休眠等位基因的引物、试剂盒及其检测方法，解决了传 统分子标记技术在数量性状多基因检测过程中存在的操作繁琐、时间长和费用成本高的难 题。
【附图说明】
[0018] 图1为主效休眠等位基因在第一次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；图中，字母a ~f分别代表等位基因化1-Bla~化为标准分子量D2000;
[0019] 图2为等位基因化1-Blc和化1-Ble在第二次PCR反应中的扩增片段凝胶电泳图；图 中，Μ为标准分子量D2000;
[0020] 图3为部分四川小麦品种主效休眠等位基因的第一次PCR鉴定图；图中，泳道1~15 表示供试小麦品种，Μ为标准分子量D2000;
[0021] 图4为部分四川小麦品种主效休眠等位基因的第二次PCR鉴定图；图中，泳道12~ 15表示与第一次PCR对应的供试品种，e代表等位基因化l-Ble，M为标准分子量D2000。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于W 下所述。
[0023] 实施例1 :DNA的提取及PCR引物设计
[0024] (l)DNA的提取及检测
[0025] 采用CTAB方法提取小麦种子总DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。
[0026] (2)PCR引物设计
[0027] 分析比较等位基因序列的突变特征，针对基因扩增区域，采用Prime巧生物学软件 设计基因特异性分子标记引物，保证引物间连续互补不超过4bpW防止发生交叉错配，引物 序列见表1。第一次PCR反应采用化1-B1基因正向引物1、反向引物，TaPHSl基因正、反向引物 对和PM19-A1基因正、反向引物对组成的引物组合。第一次PCR实质是多重PCR，是在传统PCR 原理的基础上进行改进壌即在同一反应体系中加入多对特异性引物撰对多个DNA模板或同 一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。第二次PCR为普通PCR，采用化1-B1基因正向引 物2和反向引物形成的引物对对目的基因进行PCR扩增，不同等位基因的预期扩增目的片段 大小见表2。
[002引表1:PCR引物序列
[0033] 注:表中-表示没有扩增产物;/表示未进行PCR反应。
[0034] 实施例2 :PCR体系的建立及测序验证
[0035] 进一步优化PCR反应体系和热循环条件，利用实施例1的引物组合对含有不同等位 基因的小麦材料进行PCR扩增及检测：
[0036] 第一次（多重)PCR反应体系总体积为20ul，包括1XPCR Buffer(Mg^hee)、2.5mM MgCl2、300uM dNTP、2U的Taq酶和400ng的模板DNA，PHS1基因上下游引物分别为lOpmol， VP1-B1基因上下游引物分别为12pmol，PM19-Al基因上下游引物分别为2pmol。
[0037] 第一次（多重)PCR扩增条件为:95°C预变性5min，95°C变性30S，62°C退火30S，72°C 延伸lmin，10个循环。94°C变性30S，56°C退火30S，72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸 10min〇
[003 引第二次PCR反应体系总体积为20ul，包括lXPCRBuffer(Mg2卞ree)、1.5mMMgCl2、 200uM dNTP、0.抓的化q酶和l(K)ng的模板DNA，上下游引物分别为5pmol。
[0039] 第二次PCR扩增条件为：95 °C预变性5min，94°C变性30S，55 °C退火30S，72°C延伸 30S，30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0040] 第一次(多重)PCR产物用3.5 %的琼脂糖凝胶电泳0.5-化，第二次PCR产物用1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳0.化，EB染色后用凝胶成像系统观察并拍照。每个等位基因材料均能扩 出唯一一条清晰的带，结果见图1、图2。由图1可知，第一次（多重)PCR反应可W明确地鉴定 VPl-Bla(484bp)、P1-B化（677bp)、VP1-Bld(459bp)、VP1-Blf(614bp)，VP1-Blc(4(nbp)和 VPl-Ble(40化p)扩增片段相近，在第一个PCR反应检测中不能很好区分。TaPHSl位点的强休 眠等位基因无扩增条带，弱休眠等位基因产生1224bp扩增片段。PM19-A1位点的强、弱休眠 等位基因则分别产生19化P和177bp的扩增条带;在第二次PCR反应中用一对引物对第一次 PCR反应中不能很好区分的材料进行检测，第二次PCR反应可W明确地区分VPl-Blc(无扩增 产物)和VPl-Ble(237bp)，结果如图2所示。
[0041] 进一步利用相应的引物对上述扩增片段直接测序，测序结果分别与GeneBank中对 应的VP1-B1、TaP服巧日PM19-A1等位基因序列进行比对分析，证明每个等位基因的特异性扩 增片段与预期结果吻合。所W，综合两次PCR的结果，能够明确地鉴定Ξ个休眠主效位点的 全部等位基因类型。尤其是利用第一次（多重)PCR可W-次性鉴定Ξ个位点的强休眠等位 基因，可W作为抗穗发芽育种过程中强休眠等位的分子标记辅助选择技术，加快优良抗性 基因在小麦遗传背景中的快速聚合。
[0042] 实施例3:四川育成小麦品种主效休眠等位基因的鉴定
[0043] 利用本发明的分子标记，鉴定98份四川小麦育成品种在Ξ个主效休眠位点的等位 基因组成。DNA提取及分子标记PCR检测方法同实施例1和实施例2。结果如图3、图4所示，图3 表示利用第一次（多重)PCR对其中15份供试材料主效休眠基因的鉴定结果，对于泳道12~ 15检测材料中不能分辨的VPl-Ble和VPl-Blc等位基因，继续利用第二次PCR进行鉴别，结果 表明均为等位基因 VPl-Ble，如图4所示。实验数据表明，98份四川小麦育成品种在VP1-B1位 点存在5种等位基因类型。其中，64份材料含有￥口1-816，频率为65.3%，21份材料含有￥口1- Blc，频率为21.4%，12份材料含有VPl-Bla，频率为12.2%，含有￥?1-8化和￥?1-81(1的材料 均只有1份，未检测到强休眠等位基因 VPl-Blf。可见，四川小麦在VP1-B1位点的强休眠等位 基因频率极低，在抗穗发芽育种中应加强VPl-Blb和VPl-Blf强休眠等位基因的利用。四川 小麦品种在化PHS1位点出现巧巾等位基因，即强休眠等位基因和弱休眠等位基因，频率分别 为98 %和2 %。四川小麦品种在PM19-A1位点出现巧巾等位基因，即强休眠等位基因和弱休眠 等位基因，频率分别为3%和97%。上述检测结果表明，四川小麦抗穗发芽育种应加强对 VP1-B1和PM19-A1位点的种子强休眠基因的引进和利用，本发明建立的强休眠主效等位基 因特异性分子标记及检测方法为小麦抗穗发芽分子育种提供了强有力技术手段。
【主权项】
1. 一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的引物，其特征在于，所述小麦种子主校休眠 基因为Vpl-Bl基因、TaPHSl基因和PM19-A1基因；其中， 所述Vpl-Bl基因的分子标记引物包括2条正向引物和1条反向引物，正向引物1序列如 SEQ ID No. 1所示，正向引物2序列如SEQ ID No. 2所示，反向引物序列如SEQ ID No. 3所 示； 所述TaPHSl基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 4所示，反向引物序列如SEQ ID No. 5所示； 所述PM19-A1基因的分子标记引物包括1条正向引物和1条反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 6所示，反向引物序列如SEQ ID No. 7所示。2. 如权利要求1所述的引物在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。3. -种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述 的引物。4. 如权利要求3所述的一种通量鉴定小麦种子主效休眠基因的试剂盒，其特征在于，它 还包括 BufTer、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶。5. 如权利要求3或4所述的试剂盒在通量鉴定小麦种子主效休眠基因的应用。6. 如权利要求1所述的引物通量鉴定小麦种子主效休眠基因的方法，其特征在于，它包 括以下步骤：51. 使用Vpl-Bl基因的分子标记正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子标记引物 和PM19-A1基因的分子标记引物形成的引物组合，对小麦DNA进行PCR扩增，并将扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，1224 bp扩增条带鉴定为TaPHSl位点的弱休 眠等位基因，强休眠等位基因没有扩增条带;484 bp、677 bp、459 bp、614 bp的扩增条带分 别鉴定为Vpl-Bl位点的等位基因 Vpl-Bla、Vpl-Blb、Vpl-Bld和Vpl-Blf，其中Vpl-Blb和 Vpl-Blf为强休眠等位基因，Vpl-Bla为弱休眠等位基因；195 bp和177bp的扩增条带分别鉴 定为PM19-A1位点的强休眠等位基因和弱休眠等位基因；52. 使用Vpl-Bl基因的分子标记正向引物2和反向引物进行PCR扩增检测，并将扩增产 物进行凝胶电泳并染色鉴定等位基因，其中，有扩增条带的鉴定为等位基Vpl-Ble，没有扩 增条带的为等位基因 Vpl-Blc。
【文档编号】C12Q1/68GK106011301SQ201610632831
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月3日
【发明人】陈静, 王威, 徐登安, 张紫晋
【申请人】中国科学院成都生物研究所