等温核酸扩增的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2009年6月11日的国际申请PCT/GB2009/050662进入中 国、申请号为200980131223. 9的题为"等温核酸扩增"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及核酸的扩增，尤其涉及用于扩增双链核酸靶分子的等温方法。
【背景技术】
[0003] 在核酸和遗传材料技术范畴，经常需要确定基因、基因的一部分或核苷酸序列是否存 在于活的生物体、该生物体的细胞提取物或生物样品内。因为任何基因或基因的一部分的 特征在于特定序列的核苷酸碱基，所以只需要在包含多核苷酸混合物的样品中直接查找所 述特定序列的全部或部分的存在。
[0004] 对于特定多核苷酸序列的查找存在巨大兴趣，尤其是对于致病生物的检测，等位 基因存在的确定，宿主基因组中病变存在的检测，或细胞宿主的特定RNA或修饰的存在。因 此可以通过分析个体的核酸诊断遗传性疾病诸如亨廷顿氏病，Duchenne' s病，苯丙酮酸尿 症和β地中海贫血。还有可能通过使用核探针的测试诊断或鉴定病毒，类病毒，细菌，真 菌，原生动物，或任意其他形式的植物或动物。
[0005] -旦已知生物体或疾病的特定序列，应当从样品提取核酸，并确定是否存在这 种序列。核酸检测的各种方法已经在文献中描述。这些方法基于DNA-DNA，DNA-RNAjP RNA-RNA双链中互补核酸链的嘌呤-嘧啶配对的特性。这种配对过程通过双链DNA的腺嘌 呤-胸腺嘧啶（A-T)和鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C)碱基之间建立的氢键来实现；腺嘌呤-尿嘧 啶（A-U)碱基对也可以通过DNA-RNA或RNA-RNA双链中的氢键键合形成。用于确定指定核 酸分子的存在或缺失的核酸链配对通常被称为"核酸杂交"或简单地被称为"杂交"。
[0006] 检测核酸样品中靶序列存在最直接的方法是获得"探针"，其序列与靶核酸的一部 分充分互补以与其杂交。可以在包含核酸样品中使用预先合成的探针。如果存在靶序列， 则探针将与靶形成杂交产物。当不存在靶序列时，将没有杂交产物形成。可以利用本领域 已知的许多方法检测探针杂交。通常可以将探针与可检测的标记物缀合。荧光或酶标记物 形成均匀体系中分子信标、Taqman以及其他可切割探针的基础。可选的，使用探针捕获扩增 或标记的材料，这样的话可以将与扩增子杂交的探针和未杂交的材料分离后检测扩增子。
[0007] 但是，这种方法的主要困难在于不直接适用于以下情况：样品中存在的靶序列拷 贝数较低，低于大约IO 7个拷贝。在这些条件下，很难将探针与其靶序列的特异性粘附和探 针与不同于靶序列的序列非特异性的粘附区分开来。这个问题的一个解决方案是使用由增 强检测信号组成的扩增技术，通过设计用于特异性并且显著增加靶核酸片段（如果其存在 于样品中）的拷贝数的预备技术。
[0008] Lewis (1992，Genetic Engineering News 12: 1-9)以及 Abramson 和 Myers (1993，Curr. Opin. Biotechnol. 4: 41-47)的文章是扩增技术的良好全面综述。该技术 主要基于：扩增过程中需要多个循环的技术或在单一温度下进行的技术。
[0009] 循环技术由需要热循环的方法举例说明，使用最广泛的这类技术是PCR (聚合酶 链式反应，美国专利号4, 683, 195,4, 683, 202,和4, 800, 159 ;欧洲专利号0 201 184)，其能 够扩增来自DNA或RNA的感兴趣区域。这种方法通常由三个步骤组成： (i) 通过热变性/熔解将双链DNA分解（变性）为单链DNAs (图1B); (ii) 将引物寡核苷酸与单链DNA退火（图1B);和 (iii) 从引物合成（延伸）互补链以便拷贝感兴趣的DNA的区域（图1C)。
[0010] 在此过程完成后，加热系统（分离互补链），并重复上述过程。通常进行20-40个 循环将基因组DNA扩增到可以进一步分析的程度。
[0011] 大部分指数级核酸扩增过程依赖于过量的上游和下游引物，它们与被研宄的靶核 酸模板的3'末端和5'末端的互补序列结合，如图IA-C所示。
[0012] 扩增技术的第二类（被称为等温技术）是在单一温度进行的技术，或其中扩增过 程的主要方面是在单一温度进行。与PCR过程（其中加热反应产物以分离两条链，这样的 话其他引物可以结合模板以重复上述过程）不同，等温技术依赖于链置换聚合酶以便分 离/置换双链的两条链和再拷贝模板。这种公知的特性是许多科学论文的主题（参见例 如 Y. Masamute and C.C. Richardson, 1971，J. Biol. Chem. 246，2692-2701; R. L. Lechner et al·，1983，J. Biol Chem. 258，11174-11184; or R. C. Lundquist and Β· M. Olivera，1982，Cell 31，53-60)。区分等温技术的关键点是使用的方法以便起始重 复的过程。
[0013] 广义的等温技术可以被再分成以下方法：依赖于引物的置换以起始重复的模板拷 贝（以下举例说明，HDA (解旋酶依赖性扩增），核酸外切酶依赖性扩增（EP1866434)，重组 酶聚合酶扩增（RPA)和环介导的扩增（LAMP))的方法和依赖于单引物分子的持续再使用或 从头合成（以下举例说明，SDA (链置换扩增和基于核酸的扩增（NASBA和TM))的方法。
[0014] 重组酶聚合酶扩增（RPA)是一种方法，其中重组酶介导的寡核苷酸与DNA靶 的革巴向与聚合酶的DNA合成结合（Morrical SW et. Al. J Biol Chem. 1991 Jul 25; 266 (21) :14031-8 和 Armes and Stemple, US 申请 10/371，641)。WO 2008/035205 描 述了扩增双链靶核酸分子的RPA方法，包括以下步骤：(a)将UvsX、UvsY和gp32蛋白与对 所述双链靶核酸分子特异的第一和第二单链核酸引物接触以形成第一和第二核蛋白引物； (b)将第一核蛋白引物与所述双链靶核酸分子接触以在所述双链靶核酸分子的第一部分产 生第一 D环结构，将第二核蛋白引物与所述双链靶核酸分子接触以在所述双链靶核酸分子 的第二部分产生第二D环结构，这样的话所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3'端在 相同的双链靶核酸分子上朝向彼此并且没有将靶核酸分子完全变性；（c)利用一种或更多 种能够进行链置换合成的聚合酶和dNTPs延伸所述第一和第二核蛋白引物的3'端以产生 第一和第二双链革G核酸分子和第一和第二置换的核酸链；和（d)通过（b)和（c)的重复持 续反应直至达到所需的扩增程度。
[0015] 为了将靶的扩增与产生假象的无用扩增区别开来，可以使用基于探针的系统，其 检测被研宄的扩增子（在提供给系统的引物中不存在）的序列。
[0016] 所有这些方法只依赖于模板，所述模板在它们的末端包括针对两条引物的结合位 点。具备这些性能的模板可由上游和下游引物之间的非特异性相互作用单独产生，产物 (引物-二聚体）可以不依赖被研宄的模板有效扩增，如图ID-E所示。作为这种无用扩增 的结果，测定成分被非生产性事件消耗，限制了测定方法的敏感性。
[0017] 本发明的目的是提供一种选择性等温核酸扩增技术。本发明的另一目的是提供一 种指数扩增技术。另一目的是最小化或消除扩增假象，从而提供一种特异性和/或敏感性 增加的扩增核酸的方法。
【发明内容】
[0018] 本发明因此提供一种扩增核酸靶分子的等温方法，其依赖上游引物、下游引物、链 插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没 有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供一种等温方法，包括下列步骤： (a) 提供上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增 过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插 入系统的底物； (b) 将寡核苷酸用于靶分子，允许其插入双链从而使靶分子的一些或全部变成单链； (c) 将上游引物用于靶分子的单链区，利用聚合酶和dNTPs延伸上游引物的3'端以产 生双链核酸祀分子； (d) 将下游引物用于单链靶分子，利用聚合酶和dNTPs延伸下游引物的3'端以产生另 外的双链核酸祀分子； (e) 通过（b)到（d)的重复持续反应。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明提供一种等温方法，包括下列步骤： (a) 提供： (i) 上游和下游引物，每种包括小于30个核苷酸的单链DNA分子，其至少一部分与靶分 子的序列互补； (ii) 包括至少30个核苷酸的单链DNA分子的寡核苷酸，其至少一部分与插入正向和反 向引物的靶分子的序列互补，和任选的在其3'端还包括下游元件，其与靶分子的序列互补 并且不是聚合酶底物； (b) 将寡核苷酸（ii)与重组酶接触以使其插入靶分子的互补区，从而使得靶分子的互 补区和相邻区变成单链； (c) 将上游引物用于靶分子的单链区，利用聚合酶和dNTPs延伸上游引物的3'端以产 生双链核酸祀分子； (d) 将下游引物用于单链靶分子，利用聚合酶和dNTPs延伸下游引物的3'端以产生另 外的双链核酸祀分子； (e) 通过（b)到（d)的重复持续反应。
[0021] 有利地这些方法提供靶核酸分子的等温和指数扩增。上述扩增方法的特异性和敏 感性比已知方法更高，产生最小的扩增假象或无扩增假象。
[0022] 优选的链插入系统包括重组酶系统，诸如T4 UvsX / gp32 / UvsY系统。优选的 寡核苷酸的至少一部分与插入上游和下游引物的靶序列的一部分互补。优选的寡核苷酸包 括至少30个核苷酸的单链DNA分子，其具有不可延伸的3'端。
[0023] 优选的用于链插入系统的底物促进靶模板双链的分离或靶核酸上引物延伸的产 物。一种或更多种其他的寡核苷酸可以通过插入的寡核苷酸促进靶双链的分离。优选的寡 核苷酸在其3'端包括下游元件，其与靶序列互补并且不是有效的聚合酶底物。这可以结合 寡核苷酸释放的靶链，分枝迀移入邻近的双链核酸进一步分离双链。
[0024] 在另一个实施方案中，本发明提供一种等温扩增核酸靶分子的试剂盒，包括上游 引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系 统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。
【附图说明】
[0025] 图1显示在引物依赖性扩增反应中引物二聚体的形成。
[0026] IA :将上游和下游引物与双链模板温育。模板在其末端与引物同源。模板的一条 链与上游引物同源，另一条链与下游引物同源。
[0027] IB :模板链被分离，这使得上游和下游引物可以结合。
[0028] IC :模板结合引物的延伸产生两条相同的双链。每条双链可以参与反应的前面几 步，这样的话模板被指数扩增。
[0029] ID-E :在没有模板的情况下上游和下游引物彼此拷贝。这些可能取代被研宄的模 板，还可能指数扩增造成假象。
[0030] 图2显示本发明的基础扩增系统以及任选的基于探针的检测系统。
[0031] 图3显示一种扩增方法，其