:307-15; Reddy MK, Weitzel SE, von Hippel PH. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Apr 15; 90 (8) : 3211-5; Stommel JR et. Al. Biotechniques. 1997 Jun;22(6) : 1064-6)，DMS0、甜菜碱、脯氨酸和去污剂可以通过改变寡核苷酸在测定中的Tm 或二级结构来增强所述系统。
[0068] 聚合酶 用于本发明方法的聚合酶优选的是那些具有链置换活性的那些聚合酶。这种活性是一 些 DNA 聚合酶的公知特性（Sambrook et al·，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, pp. 5. 33-5. 35, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)。DNA聚合酶的特性，尤其是其中一些的链置换活性，由Kornberg和Baker等详细 给出，DNA R印Iication,第 2 版，第 113-225 页，Freeman, N.Y. (1992)。链置换不是 所有DNA聚合酶共有的特性，因为其中一些（例如T4 DNA聚合酶）不能单独实现链置换。 在这些情况下可以通过添加聚合酶辅助蛋白实现链置换。最初大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow 片段显不链置换活性（Masamune and Richardson, 1971，J. Biol. Chem. 246: 2692-2701)，其赋予该酶从双链DNA裂解位点的3' OH末端起始核酸复制的能力。这种链置 换活性还显示于热稳定的0嫩聚合酶诸如1110嫩聚合酶0(〇叩6丨&1.，1993.181〇1· Chem. 268: 1965-1975)。在这种情况下还显示该酶的突变形式不具有核酸外切酶5'-3' 活性，这具有更高的链置换能力。对于T7 DNA聚合酶（Lechner et al.，1983. J. Biol. Chem. 258: 11174-11184)和 HIV 逆转录酶（Huber etal·，1989，J. Biol. Chem. 264: 4669-4678)也显示了这种链置换活性。
[0069] 优选的，使用没有5' -3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶来实现本发明的扩增循环， 因为在没有这类核酸外切酶活性的酶中链置换活性的效率更高。大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段是没有5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶的实例，聚合酶诸如T7 DNA聚合酶或 测序酶（US Biochemical)也是如此。还可以使用T5 DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。但 是，当不阻止扩增过程进行时，可以使用具有这种5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。在 这种情况下，扩增反应的产量可以通过在所用反应条件下对DNA聚合酶的5' -3'核酸外切 酶活性的特异性抑制来提高。
[0070] 还可以通过使用稳定单链而不是双链DNA的酶系统或其他元件来增强链置换。这 类系统的实例是应用DNA解旋酶，通过单链结合蛋白的稳定化以及用于所述系统的特定聚 合酶的影响。增强链置换的方法不干扰链插入系统是非常重要的。
[0071] 合适的聚合酶包括poll或poll片段或变体，诸如来自大肠杆菌（凡Cb/i人枯草 芽抱杆菌 嗜热脂肪芽抱杆菌的那些 或T7聚合酶。同样的可以使用诸如针对噬菌体T4描述的聚合酶全酶复合物。优选的聚合 酶是klenow，exo_，T7聚合酶或BST phi29或枯草杆菌的pol-I或全酶。在一些实施方案尤 其是使用下游元件或反向互补的情况下，优选的聚合酶不具有与大肠杆菌poll的Klenow 片段一样的强链置换活性。在其他实施方案中，聚合酶的强链置换活性可能是优势。
[0072] ATP再生系统 当重组酶用于链插入步骤的情况下，所述系统可能要求能量来源。这些酶的大多数利 用ATP作为能量来源，但是因为ATP整理（collate)酶活性必需的镁离子，因此有利的提供 另外的ATP再生系统而不是提高ATP的浓度。ATP生成系统可以涉及糖酵解或其他生化途 径以及ATP消耗中的各种酶，这些酶以及SIS酶诱导伴随AMP和ADP产生的正磷酸盐和/ 或焦磷酸盐的积聚。无机磷酸盐的积聚也能螯合镁，在多个方面对所述系统是不利的。可 以通过焦磷酸酶实现焦磷酸盐向正磷酸盐的转化，正磷酸盐向危害性较低的有机磷酸盐的 转化也被广泛报道。
[0073] 优选的无机磷酸盐或正磷酸盐向有机磷酸盐的转化利用蔗糖和蔗糖磷酸化酶或 其他糖磷酸化酶。可选的可以使用烟酰胺核糖核苷和嘌呤磷酸化酶。
[0074] 因为一些ATP再生系统只利用ADP作为底物，利用肌激酶将一些重组酶产生的AMP 转化为ADP是有利的。这也避免了 ATP资源的提前耗竭。在实施例描述的标准操作条件下， T4重组酶不产生AMP，这步可以省略。
[0075] ATP再生系统自身通常使用磷酸肌酸和肌酸激酶或磷酸-苯基-丙酮酸和丙酮酸 激酶。因为UVSX重组酶可以在一分钟内消耗多达300个ATP分子并且可以使用3 μ M UVSX， 所以使用含有40-100mM磷酸肌酸的系统是有利的。
[0076] 实际上在反应溶液中包括一种或更多种上述能源是有利的，例如，一种或更多种 ATP，磷酸肌酸，肌酸激酶，肌激酶，焦磷酸酶，蔗糖，蔗糖磷酸化酶。
[0077] 用于系统优化的总体考虑 实际上当实施本发明的方法时，可能要求标准操作步骤中所示系统各组成的标准滴定 以确保最适扩增。组成的滴定包括蛋白性金属离子和盐滴定。就盐来说，可以评估阳离子 和阴离子的性质以及最适浓度以实现最适扩增。
[0078] 因此，还可以包括各种组成诸如：镁离子；磷酸肌酸及其平衡离子，pH调节剂， DTT或其他还原剂，各种分子量分布的BSA/PEG或其他群集剂，ATP及其平衡离子，dNTP， 鹿糖，肌酸激酶，肌激酶，焦磷酸酶，鹿糖磷酸化酶，UvsX，UvsY，gp32 (NEB，10 mg/ml)， Klenow，exo-或其他聚合酶。
[0079] 扩增方案中使用的缓冲系统应当与提供给系统的所有元件相容。显然所有组成的 最适条件不可能在单个缓冲系统中实现。存在许多可能可用于平衡试验条件以便系统有效 工作。
[0080] 引物和寡核苷酸设计也会影响系统的平衡，因为各种引物和寡核苷酸的长度和熔 解温度以及选择的扩增子长度的改变可能会改变双链分离和引物延伸的平衡。
[0081] 熔解温度（Tm)是相同双链群的一半分离的温度。双链的长度和序列与Tm有关，这 样的话更长的双链倾向于具有更高的Tm。同样的扩增期间使用的缓冲液可以改变Tm，因为 各种盐和其他成分可以改变模板和引物间的亲和力（Chadalavada S.V. FEBS Letters 410 (1997) 201-205)。在本发明的环境下，Tm与没有被IO插入的双链区有关。尽管此处的细 节涉及开发的在大约40°C工作的系统，但是有可能开发出在不同温度起作用的系统，例如 从约21到50°C，优选的从约25到45°C，最优选的约37-40°C。所以靶和引物的长度和序列 可以相应调整。当被研宄的模板是负超螺旋的情况下，这些倾向不适用于起始模板，因为负 超螺旋DNA可以如同单链DNA -样处理。在扩增的第一轮，必须加热或另外化学/酶变性 或切割靶以启动扩增过程。按照先前的报道，可以使用称为缓冲引物（bumper primer)的 附加引物启动第一轮扩增（Nuovo G.J;Diagn Mol Pathol. 2000 (4) :195-202)。此外，如 果在扩增的第一轮系统实现上游或下游引物延伸较慢，则没有另外的特征是必需的，但是 将会有因为初始扩增事件的受阻造成的延缓期（lag phase)。
[0082] 扩增方法 说明书的以下部分将描述本发明的一个实施方案，其中所述方法依赖于重组酶诱导的 链插入系统（SIS)。重组酶与单链寡核苷酸底物反应，使其插入双链核酸内的互补链，置换 所述双链的其他突出链（OS)。
[0083] 本发明的基本要点在于提供插入双链核酸靶的寡核苷酸（IO)。这一事件的后果是 靶双链的链被分离，不仅在与插入寡核苷酸同源的模板区解离，而且在插入位点外但与其 相邻的区域解离，这使得末端引物结合组成链并且延伸，从而产生两个双链拷贝。该过程自 身递归重复，产生靶的指数扩增。
[0084] 在本发明的一个实施方案中，在重组酶的作用下单链不可延伸的寡核苷酸（IO) 插入双链靶核酸的中间区域。寡核苷酸的插入干扰双链稳定性使得双链分离变成单链。这 将结合位点暴露于上游和下游引物（它们不是重组酶的底物），在分离链上的这些延伸产 生两个拷贝的双链（图2)。
[0085] 图2显示本发明的基础扩增系统以及任选的基于探针的检测系统。该系统在某种 程度上防止非特异性的扩增，但在温育延长后可能形成非特异性产物，如图5所示（下文讨 论）。图2到4是关于T4 gp32、UvsX和UvsY重组酶系统的讨论，但可以使用任何重组酶 系统或其他链插入系统。
[0086] 2A:该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物，其不是 底物或只是所述的SIS的最差底物（即它不结合重组酶)。II显示所述系统的中间成分，10， 其可以在聚合酶的作用下延伸或不可延伸。该核酸元件是SIS的底物，因为它结合重组酶 并插入靶双链。它不需要受到聚合酶的作用。该元件还可以任选的包括延伸的3'或5'尾 (它们不与插入的序列同源）。插入寡核苷酸的同源区的5'区与双链末端足够接近，这样 的话残余双链的熔解温度低于系统的环境温度，导致残余上游双链在结合后的解离。III显 示任选的探针系统诸如T7核酸外切酶敏感探针或分子信标的可能位点。IV代表下游引物， 其不是底物或只是SIS的最差底物。
[0087] 该系统的所有单链元件被单链结合蛋白GP32包被。作为UVSX辅因子的UVSY也 包被10。GP32包被的元件具有减弱的分枝迀移能力。UVSX只有效包被10,因为只有这个 元件包括足以诱导所述过程的长度。
[0088] 2B:在用重组酶包被IO (II)后，它能够插入双链。双链分离，在插入区以及相邻 区变成单链，通常长度为大约15到20个核苷酸。这释放双链核酸的上游末端。
[0089] 2C:上游引物（I)能够结合释放的链。引物浓度、温度和其他系统成分诸如变性剂 被优化，这样的话引物有效结合，尽管其接近其熔解温度。
[0090] 2D:上游引物（I)延伸，这稳定其产物并置换IO (II)。这重新创造出初始双链。 下游引物（IV)以及任选的探针（III)能够结合被置换的下游区。可以将系统优化，这样的 话上游或下游引物浓度是不对称的，通过这种机制过量的下游引物确保在反应结束时诱导 单链过量的下游产物，并且提供探针的结合位点。
[0091] 2E:下游引物延伸使双链数量翻倍。
[0092] 通常两条互补寡核苷酸按照由同源区的长度和序列决定的亲和力结合到一起。两 条链只在高于特定温度时分离，这一温度被称为熔解温度（Tm)。同源区的长度与Tm成正 比。Tm还受镁和一价盐浓度的影响，在单链结合蛋白存在的条件下Tm也降低。重组酶在寡 核苷酸上的短暂存在将增加其Tm。因此相关的熔解温度参数通常按照经验进行评价。
[0093] 双链可以被重组酶包被的寡核苷酸插入，这依赖于其与插入双链的一条链同源。 双链的另一条链被称