一种筛选与启动子互作的蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选与启动子互作的蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 启动子是一段位于结构基因 5'-端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与 模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性.基因的特异性转录取决于酶与启动子能 否有效地形成二元复合物。基因转录实际上是RNA聚合酶，转录调控因子和启动子区各种 调控元件相互作用的结果.启动子DNA结合蛋白作为转录调控因子通过与启动子DNA结合 以调苄基因转录.犹如抗原-抗体特异性结合一样，蛋白质与DNA的结合也是特异的，这是 研宄启动子DNA结合蛋白的前提。目前，常用的启动子-蛋白互作的研宄方法用得较多的 是酵母单杂交技术。
[0003] 酵母单杂技术是1993年从酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物 基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多 个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，酵母单杂技术需要建立一个文库。只要文库 表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下 游报告基因的转录。
[0004] 然而，酵母单杂交因为需要构建文库，过程较为繁琐，耗时较长。因此，本发明提供 一种较为简便的筛选启动子-互作蛋白的研宄方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、便捷地筛选与启动子互 作的蛋白的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种筛选与启动子互作的蛋白的方法，包括生物素标记启动子，启动子与磁珠结 合，筛选与启动子互作的蛋白，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
[0008] 1)生物素标记启动子：在PCR管中加入20-30 μ I Ultrapure water (超纯水）， 5-20 μ I TdT Buffer (末端脱氧核苷酰转移酶缓冲液），3-10 μ 1摩尔浓度为1-5 μ mol/L 的启动子片段，3-10 μ 1摩尔浓度为1-10 ymol/L的Biotin-ll-dUTP(生物素 -ε -氨基 已酰-[5-{3_氨基}-2' -脱氧尿苷-5' -三磷酸），1-10μ1酶活为l-lOU/μΙ的TdT (末 端脱氧核苷酰转移酶），然后用移液枪将PCR管内的溶液轻轻吹打混匀，于37-40°C孵育 30-60min，然后加入2-5 μ 1探针标记终止液，轻轻混匀，终止反应，探针标记反应终止后， 加入50-100 μ 1体积比为氯仿：异戊醇=24:1的氯仿-异戊醇溶液，混匀，使有机相和水 相充分混合以抽提，然后在12000_14000g的离心条件下离心2-5min，吸取上清液，所述上 清液即为被生物素标记的DNA探针；
[0009] 每100 μ 1被生物素标记的DNA探针，加入25-100 μ 1的摩尔浓度为l-5mol/L的醋 酸铵，再加入100-200 μ 1的无水乙醇，混匀，在4°C，12000-14000g的条件下离心30-60min， 小心去除上清液，加入30-50 μ I ddH20(双蒸水）溶解，获得标记有生物素的启动子片段 的溶液；至此，生物素标记的dUTP添加到启动子DNA的3'末端，因为生物素可以与链霉亲 和素磁珠结合，因此接下去的步骤就是将标记有生物素的启动子片段与链霉亲和素磁珠结 合；
[0010] 2)启动子与磁珠结合：取50-100ug链霉亲和素磁珠加到I. 5ml离心管中，加入 IOOul TGED200溶液，用移液器吹打离心管中的溶液，重悬磁珠，将离心管置于磁架上，进行 一次磁珠分离，待磁珠被吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，然后往含有磁珠的离 心管中加入IOOul TGED200溶液，用移液器吹打离心管中的溶液，重悬磁珠，将离心管置于 磁架上，进行二次磁珠分离，待磁珠被吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，然后往含 有磁珠的离心管中加入40ul TGED400溶液，用移液器吹打离心管中的溶液，悬起磁珠，加入 40ul上述标记有生物素的启动子片段的溶液，于室温下，在旋转混合器上旋转30-60min以 上，以使标记有生物素的启动子片段结合到链霉亲和素磁珠上，然后将离心管置于磁架上， 进行三次磁珠分离，待磁珠被吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，所获得的磁珠上 结合有含有生物素标记的启动子；接下去的步骤就是将含有生物素标记的启动子的磁珠与 活性蛋白溶液结合，筛选出与启动子结合的蛋白；
[0011] 3)筛选与启动子互作的蛋白：往上述含有磁珠的离心管中加入125-150U1活 性蛋白缓冲液，重悬磁珠，用移液器枪吹打离心管中的溶液，悬起磁珠，在30 °C下反应 20-50min (为防止磁珠沉淀聚集，反应在杂交炉内于旋转混合器上进行），然后将离心管置 于磁架上，待磁珠被吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，因为启动子结合在磁珠上， 如果蛋白质可以与启动子结合，那么蛋白质与启动子结合后会一起吸附在磁珠上，因此，所 吸去的液体即为不能与启动子结合的蛋白，能够与启动子结合的蛋白与启动子一起吸附在 磁珠上，然后往含有磁珠的离心管中加入50ul洗脱液，在65-80°C下孵育5-10min，洗脱液 可破坏磁珠与生物素的结合，从而使得生物素与启动子分离溶入洗脱液中，生物素中含有 启动子以及与启动子结合的蛋白，因此，与启动子结合的蛋白溶入到洗脱液中，然后将离心 管置于磁架上，待磁珠被吸附到离心管一侧时，吸取液体，所述液体含有与启动子结合的蛋 白，即筛选出了与启动子互作的蛋白，后续通过质谱进行蛋白鉴定；
[0012] 其中，所述TGED200溶液由终浓度10-20m mol/L Tris-HCK三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐），终浓度l-2m mol/L EDTA(乙二胺四乙酸），终浓度100-200m mol/L NaCl氯化钠， 体积终浓度10-20%甘油组成，pH = 8. 0-9. 0 ;
[0013] 所述TGED400溶液由终浓度10-20m mol/L Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸 盐），终浓度I-IOm mol/L EDTA (乙二胺四乙酸），终浓度400-500m mol/L NaCl氯化钠，体 积终浓度10-20%甘油组成，pH = 8. 0-9. 0 ;
[0014] 所述活性蛋白缓冲液由终浓度10-20m mol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸），体积 终浓度10-20%甘油，终浓度 60-100111111〇1/11((^，0.2-0.51^/1111鲑鱼精0嫩，7.5-10即/1111 活性蛋白组成；
[0015] 所述洗脱液由体积终浓度95-98 %甲酰氨溶液，终浓度10-20m mol/L EDTA (乙二 胺四乙酸）组成，pH = 8. 0-9.0。
[0016] 本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如所述TGED200溶液由终浓 度 10-20m mol/L Tris-HCl，终浓度 l-2m mol/L EDTA，终浓度 100-200m mol/L NaCl，体积 终浓度10-20%甘油组成，pH = 8. 0-9. 0,是指Tris-HCl在TGED200溶液中的浓度为10-20m mol/L，EDTA在TGED200溶液中的浓度为l-2m mol/L，NaCl在TGED200溶液中的浓度为 100-200m mol/L，甘油在TGED200溶液中的体积终浓度为10-20%，TGED200溶液的pH = 8. O-9. 0 〇
[0017] 进一步，所述TGED200溶液由终浓度20m mol/L TriS-HCK三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐），终浓度Im mol/L EDTA(乙二胺四乙酸），终浓度200m mol/L NaCl氯化钠，体积终 浓度10%甘油组成，pH = 8. 0。
[0018] 进一步，所述TGED400溶液由终浓度20m mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐），终浓度Im mol/L EDTA (乙二胺四乙酸），终浓度400m mol/L NaCl氯化钠，体积终 浓度10%甘油组成，pH = 8. 0。
[0019] 进一步，所述启动子为水稻启动子，所述活性蛋白缓冲液为水稻活性蛋白缓冲液， 所述水稻活性蛋白缓冲液由终浓度12m mol/L HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸），体积终浓度 12%甘油，终浓度60m mol/L